鼠诺如病毒感染RAW264.7细胞中干扰素和干扰素激活基因转录水平研究

诺如病毒(Norovirus,NoV)是全球急性胃肠炎散发病例和暴发疫情的主要致病原。鼠诺如病毒(Murine norovirus,MNV)是研究诺如病毒的理想研究模型。本研究通过实时定量荧光PCR检测急性感染毒株MNV-CW1和持续性感染毒株MNV-SH1603感染Balb/c小鼠后的排毒情况以及感染RAW264.7细胞后不同时间点病毒RNA扩增、干扰素(Interferon,IFN)和干扰素激活基因(Interferon-stimulated gene,ISG)转录水平,以探讨不同的MNV毒株感染诱导IFNs和ISGs基因表达的特征。研究显示MNV-CW1和MNV-SH1603病毒感染Balb/c小鼠后排毒时间不同。MNV-CW1和MNV-SH1603病毒感染RAW264.7细胞后,6h后出现明显扩增,48h达到病毒复制高峰,随后复制速度减慢。MNV-SH1603增殖比MNV-CW1快。两种病毒感染RAW264.7细胞后能上调IFN-β,IFN-λ2,ISG15和ISG54转录水平。MNV-CW1感染后,诱导IFN-β,IFN-λ2和ISG15基因表达上调,而ISG54在感染24h后转录水平下降。MNV-SH1603感染初期IFN-β,IFN-λ2,ISG15和ISG54基因转录水平持续增高,感染24h后IFN-β和ISG54的转录水平明显降低,IFN-λ2和ISG15转录水平峰值在感染后72h。研究揭示MNV病毒感染RAW264.7细胞后能上调IFN和ISG基因表达,但是MNV-CW1和MNV-SH1603诱导的基因表达特征有异同。     

小剂量α-干扰素联合利巴韦林治疗丙型肝炎肝硬化脾功能亢进的疗效与安全性

目的:观察应用α-干扰素(IFN-α小剂量开始逐渐加量联合利巴韦林治疗丙型肝炎肝硬化代偿期脾功亢进的临床疗效及安全性.方法:14例丙型肝炎肝硬化脾功亢进患者采用IFN-α利巴韦林治疗.IFN-α1MU,隔日一次,皮下注射,两周后对耐受良好的患者,将IFN-α量增加至2MU,以后如能够耐受,则每4周增加1MU,直至5MU,如不能耐受增加剂量,则按原剂量治疗,疗程一年.利巴韦林开始剂量600mg/d,如能耐受逐渐增加至900～1200mg/d,不能耐受按原剂量治疗,疗程一年.观察基因型、血常规、肝功能、HCV-RNA及不良.结果:14例患者,8例为基因1b型;6例为基因2a型.12例患者完成一年疗程.8例出现病毒学应答,应答率66.7%,HCV-RNA平均下降3.6±1.7log10,SVR33.3%,肝功能复常率75%,白细胞、血小板治疗前后比较差异无统计学意义.无不良事件发生.1例合并特发性血小板减少性紫癜(ITP)患者白细胞、血小板恢复正常,PAIg-G明显下降.结论:丙型肝炎肝硬化脾功能亢进患者可选择小剂量IFN-α合利巴韦林逐渐加量治疗方案治疗,未见明显不良反应.     

口蹄疫病毒结构蛋白VP0抑制I型干扰素信号通路的激活

[目的]研究口蹄疫病毒（FMDV）结构蛋白VP0对I型干扰素信号通路的影响。[方法]通过反转录PCR构建VP0真核表达载体,利用Western blotting验证VP0蛋白转染HEK-293T细胞后的表达情况;Real-time PCR检测VP0蛋白对FMDV在BHK细胞上复制的影响,检测VP0蛋白对SeV诱导的干扰素信号通路分子RIG-I、IRF3、IFN-β及下游刺激基因ISG15、ISG20表达的影响;双荧光素酶报告基因检测系统检测VP0蛋白对SeV诱导的IFN-β和NF-κB启动子激活以及对RIG-I样受体（RIG-I-like receptors,RLRs）信号通路分子激活IFN启动子的影响;免疫共沉淀检测VP0蛋白与RLRs信号通路中关键分子的相互作用。[结果]成功构建了pCAGGs-VP0真核表达载体,可以在HEK-293T细胞中表达;FMDV感染后的4-6 h,VP0蛋白显著促进FMDV在BHK细胞上的复制（P<0.01或P<0.05）;VP0蛋白明显抑制干扰素下游刺激基因的表达（P<0.01或P<0.05）。在双荧光素酶报告基因检测实验中,VP0蛋白抑制SeV诱导IFN-β和NF-κB的活化具有剂量依赖性（P<0.01）,并对RIG-I、MDA5、VISA、TBK1和IRF3介导的IFN-β产生具有抑制作用,但是对IRF7没有明显的影响。免疫共沉淀显示VP0蛋白可与IRF3发生相互作用。[结论]证实VP0蛋白可以通过与IRF3相互作用来抑制I型干扰素信号通路的激活。     

口蹄疫病毒结构蛋白VP0抑制Ⅰ型干扰素信号通路的激活

【目的】研究口蹄疫病毒(FMDV)结构蛋白VP0对Ⅰ型干扰素信号通路的影响。【方法】通过反转录PCR构建VP0真核表达载体,利用Western blotting验证VP0蛋白转染HEK-293T细胞后的表达情况;Real-time PCR检测VP0蛋白对FMDV在BHK细胞上复制的影响,检测VP0蛋白对SeV诱导的干扰素信号通路分子RIG-I、IRF3、IFN-β及下游刺激基因ISG15、ISG20表达的影响;双荧光素酶报告基因检测系统检测VP0蛋白对SeV诱导的IFN-β和NF-κB启动子激活以及对RIG-I样受体(RIG-I-like receptors,RLRs)信号通路分子激活IFN启动子的影响;免疫共沉淀检测VP0蛋白与RLRs信号通路中关键分子的相互作用。【结果】成功构建了p CAGGs-VP0真核表达载体,可以在HEK-293T细胞中表达;FMDV感染后的4–6 h,VP0蛋白显著促进FMDV在BHK细胞上的复制(P0.01或P0.05);VP0蛋白明显抑制干扰素下游刺激基因的表达(P0.01或P0.05)。在双荧光素酶报告基因检测实验中,VP0蛋白抑制SeV诱导IFN-β和NF-κB的活化具有剂量依赖性(P0.01),并对RIG-I、MDA5、VISA、TBK1和IRF3介导的IFN-β产生具有抑制作用,但是对IRF7没有明显的影响。免疫共沉淀显示VP0蛋白可与IRF3发生相互作用。【结论】证实VP0蛋白可以通过与IRF3相互作用来抑制Ⅰ型干扰素信号通路的激活。     

ANXA1促进Ⅰ型干扰素表达抑制口蹄疫病毒的复制

【目的】研究膜联蛋白A1(Annexin A1,ANXA1)对Ⅰ型干扰素(I-IFN)表达及口蹄疫病毒(FMDV)复制的影响。【方法】开展过表达及Knockdown实验,检测ANXA1对FMDV复制的影响。利用双荧光素酶报告系统检测ANXA1对ISRE和IFN-β启动子元件活化的影响。双荧光素酶报告系统鉴定ANXA1调控Ⅰ-IFN通路活化靶分子。Western blotting检测ANXA1对干扰素调解因子3(IRF3)磷酸化的影响。Real-time PCR检测ANXA1对干扰素刺激基因(ISGs)的影响。【结果】过表达ANXA1显著抑制FMDV的复制;下调ANXA1表达促进FMDV复制(P0.01或P0.05);ANXA1促Ⅰ型干扰素通路活化,呈现剂量依赖性(P0.01)。ANXA1显著增强IRF3的磷酸化,促进ISGs的表达(P0.01或P0.05)。【结论】ANXA1促进Ⅰ-IFN表达,抑制FMDV的复制。     

泛素样蛋白ISG15在抗病毒天然免疫中的作用

干扰素刺激基因15(ISG15)编码的蛋白是抗病毒天然免疫通路中的重要调节因子,病毒感染和干扰素刺激均可强烈诱导ISG15的表达。ISG15是最早发现的泛素样蛋白,可对细胞内多种蛋白进行修饰并调节蛋白功能,但不介导蛋白质的降解,在机体抗病毒天然免疫反应中发挥重要作用,其机制尚未完全明确。近几年对ISG15的研究有所突破,发现了ISG15在抗病毒天然免疫反应中的新功能。我们简要概述了泛素样蛋白ISG15的概况、修饰酶系统及ISG15在抗病毒天然免疫反应中功能的研究进展。     

新型猫源干扰素FeIFN-ω与干扰素FeIFN-α的表达及抗病毒活性比较

ω型干扰素(IFN-ω)与α型干扰素(IFN-α)同属于Ⅰ型干扰素,都具有抗病毒,抗增殖和免疫调节的功能,但它们之间的活性却存在较大差异.通过PCR扩增猫ω型干扰素基因(FeIFN-ω),根据GenBank公布的猫α型干扰素基因序列,合成猫α型干扰素基因(FeIFN-α).分别构建原核表达载体pET-His/FeIFN-α和pET-His/FeIFN-ω,转化大肠杆菌Rosetta(DE3)进行表达.表达产物经Ni-NTA亲和层析纯化,复性后蛋白用细胞病变抑制法进行抗病毒活性测定.结果显示,重组猫ω型干扰素(FeIFN-ω)抗病毒活性明显高于重组猫α型干扰素(FeIFN-α),尤其对H9N2亚型禽流感病毒(AIV),FeIFN-ω的活性是FeIFN-α的160倍,对犬瘟热病毒(CDV),FeIFN-ω的活性是FeIFN-α的4倍,而日本同类产品Intercat 对CDV和AIV均未表现活性.以上研究为以ω型干扰素为基础的抗病毒药物应用奠定了重要的理论基础.     

重组鲁西黄牛α干扰素融合蛋白的表达及其抗病毒活性研究

通过PCR从鲁西黄牛(Yellowcattle)基因组DNA中克隆了α干扰素(BoIFN-α)基因,并插入到pET32a 中,构建成重组原核表达质粒pET32a /BoIFN-α,进行测序和诱导表达。测序结果表明,鲁西黄牛IFN-α基因全长498个核苷酸,含一个开放阅读框(ORF),编码166个氨基酸的成熟蛋白,与已报道的牛α干扰素C亚型氨基酸组成同源性为97.6%。表达产物经SDS-PAGE分析,表达出40kD的融合蛋白,表达量占菌体总蛋白的26.7%。表达产物经镍离子螯合次氨基三乙酸(Ni-NTA)亲和层析纯化,纯化产物进行复性后在MDBK/VSV上的活性为5×105u/mg。重组牛IFN-α(rBoIFN-α)对牛轮状病毒(BRV)有一定的抑制作用,抗BRV病毒活性为1.5×105u/mg。结果显示从鲁西黄牛中克隆了IFN-α基因的一种新亚型,即BoIFN-αC2,并实现了高效表达,获得了具有较高抗病毒活性的重组干扰素产物,为重组牛干扰素的开发奠定了基础。     

干扰素调节因子家族

干扰素调节因子（IRFs）是调节干扰素（IFN）、干扰素刺激性应答基因（ISG）及其它相关基因表达的重要转录因子,通过调节IFN、ISG和其它密切相关基因表达而发挥多种生物学效应.     

类泛素蛋白ISG15及其在先天免疫中的作用

病毒感染和干扰素刺激高等动物细胞,均可以强烈地诱导表达干扰素刺激基因15编码的蛋白ISG15,它是最早发现的类泛素修饰蛋白.虽然针对泛素及其修饰功能已进行了广泛而深入地研究,但对于ISG15共价修饰以及它的生物学功能了解甚少,有待进一步探讨.该领域的研究近几年有所突破,发现了有关ISG15修饰的酶系统,ISG15及其修饰系统在先天免疫以及干扰素信号调节中的重要作用.简要介绍ISG15的发现历史、生化性质、基因调控特点以及ISG15修饰系统中所涉及的酶,总结目前研究ISG15及其修饰与调节先天性免疫相关过程的一些最新进展.     

结核分枝杆菌Rv2645刺激ISG15的表达上升促进体外丙型肝炎病毒的增殖

为研究结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,M.tb)与丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)感染之间的相关关系,本文研究毒性毒株M.tb H37Rv的RD13区中的Rv2645基因对免疫细胞中干扰素刺激基因(Interferonstimulated gene 15,ISG15)表达的影响,进而探讨ISG15的表达与HCV感染之间的相关性。利用携带Rv2645基因的无毒牛结核分枝杆菌卡介苗(Bacille calmette guerin,BCG)(即rBCG::Rv2645,rBCG)与亲本BCG分别感染小鼠或刺激小鼠巨噬细胞系RAW264.7,运用RT-qPCR以及蛋白印迹的方法检测,比较rBCG与BCG感染对小鼠CD4+T细胞及RAW264.7细胞中ISG15的mRNA及蛋白质表达的影响。同时克隆ISG15真核表达质粒和ISG15的沉默表达质粒-ISG15-shRNA,运用RT-qPCR及蛋白印迹分别检测ISG15过表达及沉默后,对HCV感染的人肝癌细胞系Huh7.5.1中HCV的mRNA、HCV非结构蛋白NS3及核心蛋白Core的表达。我们发现相对于BCG,携带Rv2645的BCG感染之后脾脏CD4+T细胞及体外RAW264.7中ISG15的mRNA及蛋白质的水平明显升高。此外,ISG15过表达导致Huh7.5.1中HCV的mRNA、NS3蛋白及Core蛋白的水平明显升高,而ISG15沉默后ISG15和HCV的mRNA的水平明显下调。本研究首次发现M.tb Rv2645能上调小鼠CD4+T细胞及巨噬细胞中ISG15的表达;而ISG15能促进Huh7.5.1中HCV增殖。本研究对阐明M.tb毒性菌株H37Rv的Rv2645基因的功能,以及为研究MTB感染与HCV感染的分子机制提供参考依据。     

IFN-λ4与HCV感染最新研究进展

干扰素(interferon,IFN)为体内主要的抗病毒细胞因子,新发现的III型干扰素IFN-λ4与丙型肝炎病毒(HCV)的自发清除或治疗无效密切相关。IFN-λ4只能存在于携带IFNL4-ΔG等位基因(rs368234815)个体,它是预测HCV清除的最佳宿主因素。IFN-λ4也通过IFN-λ受体复合物传递信号,并通过激活JAK-STAT途径诱导干扰素刺激基因(IFN-stimulatedgene,ISG)的表达。IFN-λ4能诱导抗病毒活性,却同时影响了HCV的有效清除。因此,解决IFN-λ4这种看似矛盾的功能问题,可能会对HCV感染和干扰素生物学的免疫反应产生重要的新见解。     

USP18介导的蛋白质去ISG化及其在结核病等传染病中的作用

干扰素诱导基因15 (interferon-stimulated gene 15,isg15)的表达受Ⅰ型干扰素诱导,该基因编码的蛋白ISG15可以分别通过E1、E2和E3酶的作用共价修饰靶蛋白,此过程被称为ISG化(ISGylation)。宿主蛋白的ISG化广泛参与天然免疫例如宿主的抗病毒过程。泛素特异性蛋白酶18 (ubiquitin-specific protease 18,USP18)作为一种去泛素化酶(deubiquitinase,DUB)可以去除靶蛋白偶联的ISG15,并通过抑制Ⅰ型干扰素信号通路来抑制宿主的免疫应答。ISG15介导的ISG化和USP18介导的去ISG化(deISGylation)建立的动态平衡对结核病的发生、发展和转归有重要影响。此外,同ISG15一样,USP18也广泛参与病毒感染和宿主细胞抗病毒反应,多种先天性免疫疾病和免疫信号通路都受到USP18的调节。本文综述了ISG15和USP18相关的研究进展,重点介绍了ISG15介导的ISGylation和USP18介导的去ISG化在结核病及其他重要疾病中的调控作用,以期为靶向宿主蛋白的结核病等重要疾病防治提供...     

重组人干扰素α1b体外抗3型腺病毒的药效学及作用机制初步研究

目的:研究重组人干扰素α1b(IFNα1b)体外抗3型腺病毒(HAdV3)的药效,并探讨IFNα1b与利巴韦林的联合效应。方法:噻唑蓝(MTT)法测定IFNα1b、利巴韦林对A549细胞的毒性,乳酸脱氢酶(LDH)法和AnnexinV/PI双染法检测IFNα1b抗HAdV3感染的作用效果;采用MTT法与利巴韦林进行比较,同时检测IFNα1b和利巴韦林联用时的体外药效和联合效应。结果:LDH法测得IFNα1b抗HAdV3的半数有效浓度(EC50)为2.6±0.8 ng/mL,可显著降低感染细胞凋亡率(P0.001)。MTT法测得IFNα1b和利巴韦林的治疗指数(TI)分别为100 000和28.3。IFNα1b与利巴韦林小剂量联用时具有协同作用,可提高细胞存活率,降低单药用量。结论:IFNα1b体外对HAdV3有较强的抑制作用,且与利巴韦林在一定浓度范围内呈协同作用。     

蛙皮素对大鼠IFN性发热反应及脑内AVP含量的影响

目的:研究蛙皮素(BN)能否拮抗大鼠干扰素(IFN)性发热反应及其可能机制的探讨.方法:建立大鼠IFN-α性发热模型,观察侧脑室注射BN对大鼠IFN-α性发热反应及下丘脑、脑腹中隔区(VSA)精氨酸加压素(AVP)含量的影响.结果:①侧脑室注射IFN-α(每只2、5、8×104U)引起剂量依赖性体温升高,同时测得VSA中AVP含量明显增加(P<0.05),下丘脑AVP含量无明显变化(P>0.05).②侧脑室注射BN(每只0.1、0.5 μg),引起剂量依赖性体温降低(P<0.01),同时测得VSA中AVP含量增加( P<0.05),下丘脑AVP含量无明显变化(P>0.05).③侧脑室注射IFN-α(每只5×104U)30 min后,侧脑室注射BN(每只0.5 μg),BN能逆转大鼠发热反应(P<0.05),并于150 min时,大鼠体温恢复到对照组水平,同时测得VSA中AVP含量与对照组无显著性差异(P>0.05).结论:内生性AVP可能参与了IFN-α性发热反应的调节;BN降正常体温及解热作用可能通过AVP介导完成的.     

重组人αB干扰素在大肠杆菌中的克隆与高效表达

人αB干扰素(IFN-αB)是体内具有多种生物学功能的细胞调节因子,能抵御病毒感染和抑制肿瘤细胞生长,在临床上有广泛而重要的应用价值。IFN-α在治疗低度恶性淋巴瘤、慢性白血病、肝炎等方面显示良好的效果,资料表明IFN-αB抑制病毒作用较αD型干扰素强30倍。本文利用基因重组技术构建IFN-αB高效表达菌株E.coli XL-Blue/pBm,经酶(?)鉴定、DNA测序、SDS-PAGE、Western Blot及生物活性测定等分析鉴定,表明能特异性地表达具有生物活性的26 kD IFN-αB。表达水平达到23％(占总菌体蛋白比值),比活为1.0×10~6/mg,具有良好的应用前景。     

干扰素刺激基因15在人类免疫缺陷病毒感染中作用的研究进展

随着有效的联合抗反转录病毒疗法(combination antiretroviral therapy,cART)的普及,人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)感染者的生存期逐步延长。这一过程中,HIV感染者自身免疫反应对免疫系统功能的恢复也发挥了至关重要的作用。HIV感染激活干扰素信号通路,诱导干扰素刺激基因(interferon-stimulated gene,ISG)上调表达,从而发挥抗病毒作用。其中,类泛素蛋白ISG15在HIV感染者中显著上调,通过ISG化抑制HIV颗粒的出芽和释放;而HIV的非结构蛋白则通过干扰ISG化过程或结合干扰素信号通路关键分子,逆转ISG15对病毒的抑制作用。本文从ISG15的生物学特性、在不同细胞亚群中的表达、抗病毒功能及病毒逃逸机制等方面进行综述,为进一步解析ISG15在HIV感染中扮演的角色、探索如何获得以抗HIV感染宿主因子为契机的治疗策略提供了思路。     

干扰素调节因子新剪接异构体IRF7-e的结构及功能

干扰素调节因子7是诱导玉型干扰素表达的最主要的转录因子。寻找IRF7新的剪接异构体,研究其结构及功能,为探索IRF7参与调控玉型干扰素机制的多样性提供基础。通过PCR和Sanger测序获得了IRF7一种新的剪接形式IRF7-e,并通过RACE获取了IRF7-e 基因全长。IRF7-e全长为1994 bp,含5'-UTR 410 bp,3'-UTR 120 bp,开放阅读框1464 bp,编码487个氨基酸的蛋白,预测其等电点为6.659,蛋白分子量为52.8 kD。双荧光素酶报告分析表明过表达IRF7-e能够提高玉型干扰素IFNα和IFNβ启动子的活性,其中对IFNα启动子活性提高了12.18倍,对IFNβ的启动子活性提高了2.99倍。表明IRF7-e可能参与玉型干扰素的调控。     

CVB对OL细胞和OL/BDV细胞I型IFN信号转导途径的影响

探讨柯萨奇病毒(coxsackievirus, CVB)对人类少突胶质细胞(oligodendrocyte, OL)和博尔纳病病毒(Borna disease virus, BDV)持续感染的OL细胞(OL/BDV)中I型干扰素(interferon, IFN)、microRNA-155(miR-155)表达以及干扰素调节因子(interferon regulatory factor, IRF)7细胞定位的影响。CVB感染OL细胞和OL/BDV细胞0、2、4、6、12和24 h,qPCR检测I型IFN mRNA和miR-155表达水平。OL细胞和OL/BDV细胞分别转染IRF7-EGFP质粒,CVB感染4 h,观察IRF7细胞定位情况。CVB感染OL细胞2、4、12和24 h,IFN-αmRNA和miR-155表达水平显著增加,IFN-βmRNA表达水平在4、12和24 h显著增加;CVB感染OL/BDV细胞IFN-α和IFN-βmRNA表达水平除0 h均显著增加,但miR-155表达仅在12和24 h显著增加。CVB感染OL细胞和OL/BDV细胞4 h,IRF7绿色荧光蛋白由细胞浆转移至细胞核内。综上所述,CVB可诱导OL细胞和OL/BDV细胞I型IFN、miR-155的表达,促进IRF7入核,从而激活I型IFN信号转导途径。     

Viperin蛋白可通过影响非结构蛋白与脂筏的关联抑制丙型肝炎病毒复制

目前, 对丙型肝炎病毒( HCV) 感染的患者主要采用以Ⅰ型干扰素为主的治疗方案, 但干扰素抑制病毒的具体机制仍然不详。本研究通过实时聚合酶链反应( PCR) 检测HCV的RNA 水平, 蛋白免疫印迹法检测HCV 非结构蛋白的表达, 以及膜飘浮实验检测非结构蛋白与脂筏的关联性, 探讨干扰素诱导蛋白Viperin 抑制HCV 复制的机制。结果显示, 在体外HCV 亚基因复制子( replicon) 及感染细胞模型中过量表达Viperin 可显著降低细胞内HCV 非结构蛋白的表达及RNA 的水平。膜漂浮实验发现, 过量表达的Viperin 可通过干扰HCV 非结构蛋白NS3、NS5A 与细胞内脂筏膜的关联, 使其对非离子去污剂敏感。进一步研究发现, 与脂筏膜结构组成相关的法尼基合成酶( FPPS) 可通过与Viperin 相互作用, 部分反转Viperin 的抗HCV 复制效应。以上结果提出了一种新的干扰素抗HCV 机制, 即干扰素诱导蛋白Viperin 可通过影响非结构蛋白与脂筏的关联, 干扰HCV 复制复合体的稳定性, 从而抑制HCV 的复制。