盐地碱蓬(Suaeda salsa)中SsINPS基因的分子克隆及表达特性分析

肌醇 1 磷酸 (I 1 P)合成酶 (EC5 .5 .1 .4,INPS)是肌醇生物合成中的关键酶 ,催化葡萄糖 6 磷酸 (G 6 P)到I 1 P的反应。从该实验室已构建的NaCl40 0mmol/L处理的盐地碱蓬 (Suaedasal sa)cDNA文库中克隆了肌醇 1 磷酸合成酶的全长cDNA (S .salsamyo inositol 1 phosphatesynthase,SsINPS) ,基因注册号为AF43 3 879。SsINPS全长约 1 986bp ,含有开放式阅读框架 1 5 3 0bp ,3′和 5′的非翻译区分别为 1 3 9bp和 3 1 7bp ;推导的氨基酸序列全长 5 1 0个氨基酸残基 ,分子量约为 5 6 .7kD ,pI值为 5 .3 5。BLAST同源性分析表明 ,该cDNA与已报告的冰叶日中花 (Mesembryanthemumcrys tallinum)的INPS基因同源性最高 ,其中 ,核苷酸水平的同源性为 91 % ,氨基酸水平上的同源性为84%。以SsINPS全长cDNA为探针进行的South ern杂交结果表明 ,SsINPS基因在盐地碱蓬基因组中只有一个拷贝 ;Northern结果表明 ,在盐处理(40 0mmol/L的NaCl)下 ,SsINPS在叶中的表达量有显著的增加。从而说明SsINPS在盐胁迫下是上升调节的     

盐地碱蓬过氧化氢酶基因的克隆及盐胁迫下的表达分析

过氧化氢酶是清除H2O2的重要酶类,从400mmol/LNaCl处理的盐地碱蓬（Suaeda salsa(L.)Pall)地上部分的cDNA文库中克隆了两个编码过氧化氢酶的cDNA(Sscat1和Sscat2)。其中Sscatl(1.7kb)是一个全长cDNA克隆,编码一个492个氨基酸的开放阅读框架。而Sscat2(1.1kb)是一个cDNA片段。据编码Sscatl3′端的287个氨基酸的cDNA序列与Sscat2的cDNA序列进行的BLAST同源性分析表明,Sscat1和Sscat2在核苷酸水平的一致性则为一个单拷贝基因。Northern杂交结果表明在盐胁迫条件下Sscat1和Sscat2的表达存在差异;400mmol/LNaCl处理48h的盐地碱蓬根中的Sscat1和Sscat2mRNA水平比对照显著提高,但是在叶中仅Sscat1受盐诱导表达,不同盐处理时间下的表达分析也证实。在盐地碱蓬叶中仅Sscat1受盐诱导表达。这说明Sscat1和Sscat2在盐地碱蓬中是差异调控的,生理分析表明过氧化氢酶的活性在盐胁迫条件下显著提高。     

盐地碱蓬过氧化氢酶基因的克隆及盐胁迫下的表达分析

过氧化氢酶是清除H2O2的重要酶类.从400 mmol/L NaCl处理的盐地碱蓬(Suaeda salsa(L.)Pall)地上部分的cDNA文库中克隆了两个编码过氧化氢酶的cDNA(Sscat1和Sscat2),其中Sscat1(1.7kb)是一个全长cDNA克隆,编码一个492个氨基酸的开放阅读框架,而Sscat2(1.1kb)是一个cDNA片段.据编码Sscat1 3＇端的287个氨基酸的cDNA序列与Sscat2的cDNA序列进行的BLAST同源性分析表明,Sscat1和Sscat2在核苷酸水平的一致性为71.9%,在氨基酸水平上的一致性为75%.Southem杂交表明,Sscat1在盐地碱蓬基因组中为多拷贝基因,Sscat2则为一个单拷贝基因.Northern杂交结果表明在盐胁迫条件下Sscat1和Sscat2的表达存在差异:400 mmol/L NaCl处理48h的盐地碱蓬根中的Sscat1和Sscat2 mRNA水平比对照显著提高,但是在叶中仅Sscatl受盐诱导表达.不同盐处理时间下的表达分析也证实,在盐地碱蓬叶中仅Sscat1受盐诱导表达.这说明Sscat1和Sscat2在盐地碱蓬中是差异调控的.生理分析表明过氧化氢酶的活性在盐胁迫条件下显著提高.     

盐地碱蓬延伸因子(SsEF-1α)的克隆与表达分析

从盐胁迫下的盐地碱蓬(Suaeda salsa)的cDNA文库中获得了一个延伸因子(SsEF-1α)的cDNA片段。以此片段为探针,对其在不同胁迫处理下的盐地碱蓬中表达利用Northern杂交进行分析,结果表明,不同盐浓度处理、同一盐浓度不同时间处理下及双氧水刺激条件下延伸因子在碱蓬叶中的表达量先呈现减少然后增加的趋势;聚乙二醇(PEG)及低温诱导下均呈现上升趋势。由此可见该基因在盐、氧化、高渗和低温胁迫条件下产生一定的反应。     

盐地碱蓬GST基因的克隆、序列分析及其表达特征

从盐地碱蓬 (Suaedasalsa)幼苗的cDNA文库中克隆到一个 0 .9kb的全长cDNA ,同源性分析表明该全长cDNA与已报告的大豆 (Glycinemax)GST基因相应序列的同源性达 5 5 % ,可能编码由 2 35个氨基酸组成的谷胱甘肽转移酶 (glutathioneS transferase ,GST)。Southern杂交结果证明GST基因在碱蓬基因组中可能有至少两个以上的拷贝 ;Northern杂交结果表明 ,4 0 0mmol/L的NaCl处理 4 8h ,幼叶中GSTmRNA的表达量是对照的 2～ 3倍 ,说明碱蓬中GST基因受盐诱导     

盐地碱蓬耐盐相关基因克隆研究进展

盐地碱蓬是一种生长于盐碱地和海滨沙滩的盐生植物,富含氨基酸、维生素、矿物质等,极具开发价值。由于其具有很强的耐盐性,人们日益重视其耐盐机理的研究。目前对其耐盐机理的研究已经进入到耐盐基因的克隆、结构分析、功能研究等方面。综述了近年来盐地碱蓬与耐盐相关的基因克隆、结构及功能分析等方面的研究进展。     

盐地碱蓬叶片液泡膜H+-ATPase B亚基的克隆及盐胁迫下表达分析

植物液泡膜H -ATPase在建立跨液泡膜质子梯度、促进液泡Na 区域化、提高植物耐盐性方面发挥着重要作用.本实验从盐生植物盐地碱蓬(Suaeda salsa L.)cDNA文库分离到碱蓬叶片液泡膜H -ATPase B亚基cDNA克隆.测序表明该基因长达1 974 bp,开放阅读框有1 470 bp编码489个氨基酸,含有一个保守的ATP结合位点,其蛋白分子量约为54.29 kD.Northem及Western印迹表明盐地碱蓬液泡膜H -ATPase B亚基表达明显受NaCl胁迫诱导,并且在NaCl胁迫下,B亚基在转录及翻译水平上与液泡膜H -ATPase c亚基存在协同作用.盐胁迫下,盐地碱蓬液泡H -ATPase B亚基与c亚基的协同表达增加了液泡H -ATPase的数量,从而提高了液泡H -ATPase活性,为碱蓬叶片液泡Na 区域化提供了动力,最终提高了碱蓬植株的耐盐性.     

盐胁迫下盐地碱蓬体内无机离子含量分布特点的研究

用不同浓度NaCl溶液处理盐地碱蓬（Suaeda salsa)植株后,测定并比较老叶、幼叶及根部的无机离子含量和对K的选择性,叶片及根部的Na^ 、Cl^-含量随盐度的增加而升高,且累积趋势相似,盐胁迫下根部Na^ 、Cl^-及总离子含量（K^ 、Na^ 、Ca^2 ,NO3^-,Cl^-)明显低于叶片,说明盐地碱蓬地盐胁迫下,以叶片优先积累大量离子（如Na^ ,Cl^-) 为其适应特征。NaCl处理下,叶片的K^ ,Ca^2 含量低于对照,但随盐度的增加保持相对稳定,而根部K^ 含量,K/Na比、对K的选择性则高于叶片,这对盐胁迫下地上部的K^ 亏缺有一定补偿作用。低盐度处理（100mmol/LNaCl)促进NO3^-的吸收,另外随盐度的增加,叶片渗透势下降,渗透调节能力增强,幼叶渗透势低于老叶,但渗透调节能力相同。     

盐胁迫下盐地碱蓬叶片液泡膜H+-ATPase H 亚基的克隆与表达分析

利用EST随机挑取克隆测序的方法从盐地碱蓬叶片cDNA文库中分离得到了盐地碱蓬V-H -ATPase H亚基cDNA序列,并进行了H、c亚基基因表达及V-H -ATPase活性分析.结果表明,H亚基基因全长1 969 bp,包括100 bp的5′-非编码区和471 bp的3′-非编码区.开放阅读框为1 398 bp,编码465个氨基酸残基,分子量约52.8 kD.N orthern杂交分析表明盐胁迫明显诱导了H亚基表达,而且盐胁迫下H、c亚基及V-H -ATPase活性存在协同作用.这些结果表明盐胁迫下H和c亚基基因上调及V-H -ATPase活性的增加为N a 区隔化到液泡中提供了质子驱动力.     

盐地碱蓬的化学成分研究

采用硅胶、聚酰胺、Sephadex LH-20等色谱方法从盐地碱蓬乙醇提取液中分离得到6个化合物,分别鉴定为β-谷甾醇(1)、胡萝卜苷(2)、没食子酸(3)、槲皮素(4)、槲皮素-3-O--β-D-吡喃葡萄糖苷(5)和苯甲醇-β-D-吡喃糖苷(6).以上化合物均为首次从碱蓬属植物中分离得到.     

硫腺苷甲硫氨酸合成酶基因的克隆及其在盐胁迫条件下的不同表达

硫腺苷甲硫氨酸作为甲基供体在转甲基反应中起到重要作用.为了解硫腺苷甲硫氨酸在盐地碱蓬(Suaedasalsa (L.)Pall)耐盐中的作用,我们对可能编码硫腺苷甲硫氨酸合成酶的基因(SsSAMS2)进行了分析.该基因在经400 mmol/L NaCl处理的盐地碱蓬地上部分的λ-Zap cDNA文库中克隆到,其插入片段全长1 531 bp,包含一个395个氨基酸的开放阅读框架,该基因推断的分子量约为43 kD.SsSAMS2与长春花(Catharanthus roseus)的SAMS2在氨基酸水平上的一致性为93%.Southern杂交显示,SsSAMS2在盐地碱蓬基因组中可能是两个拷贝.Northern分析显示硫腺苷甲硫氨酸合成酶基因受NaCl等胁迫的正调控.酶活性检测表明,NaCl胁迫条件下该酶活性增强.     

硫腺苷甲硫氨酸合成酶基因的克隆及其在盐胁迫条件下的不同表达

硫腺苷甲硫氨酸作为甲基供体在转甲基反应中起到重要作用。为了解硫腺苷甲硫氨酸在盐地碱蓬(Suaeda salsa (L.) Pall)耐盐中的作用,我们对可能编码硫腺苷甲硫氨酸合成酶的基因(SsSAMS2)进行了分析.该基因在经400mmol/L NaCl处理的盐地碱蓬地上部分的λ-Zap cDNA文库中克隆到,其播入片段全长1531bp,包含一个395个氨基酸的开放阅读框架,该基因推断的分子量约为43kD.SsSAMS2与长春花(Catharanthus roseus)的SAMS2在氨基酸水平上的一致性为93%.Southern杂交显示,SsSAMS2在盐地碱蓬基因组中可能是两个拷贝.Northern分析显示硫腺苷甲硫氨酸合成酶基因受NaCl等胁迫的正调控.酶活性检测表明,NaCl胁迫条件下该酶活性增强.     

碱蓬cDNA表达文库的构建

以盐生植物盐地碱蓬（Suaeda salsa)地上部分为材料,提取植物总RNA,纯化出mRNA,合成cDNA第一链,得到双链cDNA后,连接入植物表达载体,构建cDNA表达文库。该文库重组子约10^6。将该文库转化农杆菌GV3101,可直接用以转化拟南芥。     

盐地碱蓬叶片液泡膜H^＋—ATPase B亚基的克隆及盐胁迫下表达分析

植物液泡膜H^ -ATPase在建立跨液泡膜质子梯度、促进液泡Na^ 区域化、提高植物耐盐性方面发挥着重要作用。本实验从盐生植物盐地碱蓬(Suaeda salsa L.)cDNA文库分离到碱蓬叶片液泡膜H^ -ATPase B亚基cDNA克隆。测序表明该基因长达1974bp,开放阅读框有1470bp编码489个氨基酸,含有一个保守的ATP结合位点,其蛋白分子量约为54．29kD。Northern及Western印迹表明盐地碱蓬液泡膜H^ -ATPase B亚基表达明显受NaCl胁迫诱导,并且在NaCl胁迫下,B亚基在转录及翻译水平上与液泡膜H^ -ATPase c亚基存在协同作用。盐胁迫下,盐地碱蓬液泡H^ -ATPase B亚基与c亚基的协同表达增加了液泡H^ -ATPase的数量,从而提高了液泡H^ -ATPase活性,为碱蓬叶片液泡Na^ 区域化提供了动力,最终提高了碱蓬植株的耐盐性。     

盐地碱蓬亲环素CYP1基因的克隆、表达及耐盐性分析

为探索盐地碱蓬亲环素与其耐盐性的关系,使用RT-PCR和RACE完成盐地碱蓬亲环素基因的全长克隆与测序,并命名为SsCYP-1.SsCYP-1基因全长为875 bp,编码区为531 bp,编码176个氨基酸.多重序列BLAST结果表明,SsCYP-1基因可归于亲环素家族,并具有特定的肽酰脯氨酸顺反异构酶活性结构域特征.为验证盐地碱蓬亲环素的耐盐特性,构建了SsCYP-1表达载体并在大肠杆菌（E.coli） BL21 （Rosetta）中通过IPTG诱导表达,通过PAGE检测目的蛋白为19 KD,与Editseq软件预测的目的蛋白大小基本一致.对重组菌PET-Ss-CYP1进行耐盐分析表明其在高盐浓度培养下生长速度远高于对照菌pETDuet-1.据此,推测该基因在盐地碱蓬生长中可能具有相关的耐盐性作用.