EERα基因敲除小鼠的繁育及子代小鼠基因型的鉴定

目的 探讨雌激素受体α(ERα)基因敲除小鼠的优化繁育方法及ERα基因敲除小鼠子代鼠的鉴定方法,建立ERα基因敲除小鼠模型,为进一步研究ERα蛋白的功能奠定基础.方法 用4种不同的交配方式观察子代鼠的各表型比率及雌、雄性ERα基因突变纯合子小鼠的繁殖能力;从子鼠鼠尾中提取基因组DNA,用PCR方法扩增ERα基因片段,琼脂糖凝胶电泳后观察结果.HE染色观察雌、雄性ERα<'-/->小鼠生殖系统表型变化.结果 WT、ERα<'+/->、ERα<'-/->各表型小鼠互交繁殖结果基本符合孟德尔遗传规律,且雌、雄性ERα<'-/->小鼠无繁殖能力.与WT比较,雄性ERα<'-/->小鼠睾丸脏器系数降低,睾丸病理变化表现为生精小管管腔膨胀,生精细胞层变薄,且排列不规则;雌性ERα<'-/->小鼠子宫脏器系数降低,子宫和卵巢病变明显,表现为:子宫浆膜、肌层、内膜层细胞排列不规则,卵巢有囊性病变、充血,无黄体.结论 雌、雄性ERα<'+/->小鼠交配是繁育ERα<'-/->小鼠的较好方法;实验所用PCR方法能够精确鉴定ERα<'-/->小鼠,ERα<'-/->小鼠的获得为ERα蛋白功能的实验研究提供了较理想的动物模型.     

ERα基因敲除小鼠的繁育及子代小鼠基因型的鉴定

目的探讨雌激素受体α(ERα)基因敲除小鼠的优化繁育方法及ERα基因敲除小鼠子代鼠的鉴定方法,建立ERα基因敲除小鼠模型,为进一步研究ERα蛋白的功能奠定基础。方法用4种不同的交配方式观察子代鼠的各表型比率及雌、雄性ERα基因突变纯合子小鼠的繁殖能力;从子鼠鼠尾中提取基因组DNA,用PCR方法扩增ERα基因片段,琼脂糖凝胶电泳后观察结果。HE染色观察雌、雄性ERα-/-小鼠生殖系统表型变化。结果 WT、ERα+/-、ERα-/-各表型小鼠互交繁殖结果基本符合孟德尔遗传规律,且雌、雄性ERα-/-小鼠无繁殖能力。与WT比较,雄性ERα-/-小鼠睾丸脏器系数降低,睾丸病理变化表现为生精小管管腔膨胀,生精细胞层变薄,且排列不规则;雌性ERα-/-小鼠子宫脏器系数降低,子宫和卵巢病变明显,表现为:子宫浆膜、肌层、内膜层细胞排列不规则,卵巢有囊性病变、充血,无黄体。结论雌、雄性ERα+/-小鼠交配是繁育ERα-/-小鼠的较好方法;实验所用PCR方法能够精确鉴定ERα-/-小鼠,ERα-/-小鼠的获得为ERα蛋白功能的实验研究提供了较理想的动物模型。     

Grx-1基因敲除鼠的繁殖及子代基因型鉴定

目的探讨glutaredoxin-1(Grx-1)基因敲除小鼠的优化繁殖及子代鼠的鉴定方法,为进一步研究Grx-1在支气管肺发育不良(BPD)中的作用奠定基础。方法将从美国哈佛医学院引进的纯合子Grx-1基因敲除小鼠与野生型小鼠进行交配后得到的子一代小鼠同代间相互交配,繁殖出的子二代中将出现纯合子、杂合子以及野生型3种基因型。从出生起观察其生长发育情况,2周龄时剪尾提取基因组DNA,用PCR方法扩增目的基因片段,琼脂糖凝胶电泳结果判定基因型。结果 Grx-1纯合子小鼠的饲养繁殖取得成功,获得了一批Grx-1基因敲除纯合子小鼠。结论正确的饲养繁殖以及鉴定方法是获得Grx-1基因敲除纯合子小鼠的有效途径,为相关研究提供动物实验模型奠定了基础。     

DDR2基因缺失小鼠的繁育及子代基因型的鉴定

目的：探讨盘状结构域受体2（DDR2）基因缺失小鼠的优化繁殖方法与子代小鼠DDR2基因型的鉴定方法,建立DDR2基因缺失小鼠模型,为进一步研究DDR2分子在肿瘤、肺纤维化、类风湿性关节炎等复杂疾病中的功能以及作用机制奠定基础。方法：将从美国JAX实验室引进的三对杂合子小鼠进行饲养并交配繁殖,繁殖成功后其子代中将会出现野生型、杂合子以及纯合子3种基因型。用基因组提取试剂盒试剂盒提取子鼠鼠尾的基因组DNA,经紫外分光光度计定量后,采用Taqman qPCR的方法准确鉴定出小鼠的基因型,同时观察子代小鼠各基因型的比例,并通过小鼠体态观察,进一步证实Taqman qPCR鉴定方法的可靠性。结果：DDR2基因杂合子小鼠互交繁殖可得到DDR2野生型小鼠、DDR2纯合子小鼠以及DDR2杂合子小鼠三种基因型小鼠,所得子代基本符合孟德尔遗传规律,且雌性和雄性DDR2纯合子小鼠体长均较DDR2野生型小鼠和DDR2杂合子小鼠小,鼻子也较其它基因型小鼠明显变短,无繁殖能力。依据Taqman qPCR的结果所得出的纯合子小鼠体貌特征与文献报道一致,证实了Taqman qPCR结果的可靠性。结论：雌、雄性DDR2杂合子小鼠交配可有效获得DDR2基因缺失小鼠;实验所用Taqman qPCR方法能够准确鉴定子代小鼠的基因型,DDR2纯合子小鼠的获得为后续实验的提供了较理想的动物模型。     

Bmal1时钟基因敲除小鼠的繁育及基因型鉴定

目的 对Bmal1基因敲除小鼠进行繁育及基因型进行鉴定,为生物节律研究提供理想的动物模型.方法 将引进的Bmal1基因敲除小鼠,以1雄2雌的合笼方式进行饲养繁殖,从仔鼠中提取鼠尾基因组DNA,PCR扩增目的基因片段,琼脂凝胶电泳进行基因结果 判定,Western Blot检测心肌组织中Bmal1蛋白表达进行结果 验证....     

条件性基因敲除:骨髓细胞特异性敲除Ncol2基因小鼠的建立和基因型鉴定

Ncol2是新发现的参与免疫调节的重要因子,Ncol2基因骨髓细胞特异性敲除小鼠的建立,能够有针对性的研究Ncol2基因缺失后对免疫系统的影响。根据条件性基因敲除的原理,本文利用loxp转基因小鼠和在骨髓细胞特异性表达Cre重组酶的LysMcre小鼠,繁殖建立了骨髓细胞特异性敲除Ncol2基因的小鼠,并提供了用鼠尾做基因型鉴定的简便方法。     

SPARC 在子宫内膜癌组织中的表达及意义

目的:探讨富含半胱氨酸的酸性分泌型蛋白(secreted protien,acidic and rich in cysteine,SPARC)在子宫内膜癌组织中的表达及其临床意义。方法:应用组织芯片技术研究SPARC在正常子宫内膜、增生的子宫内膜和子宫内膜癌组织中的表达情况。结果:SPARC在正常子宫内膜、增生的子宫内膜和子宫内膜癌组织中的阳性表达率分别为96.55%、76.79%、59.50%,差异具有统计学意义(P<0.05)。在子宫内膜癌中,SPARC的表达强度与手术-病理分期、组织学分级、肌层浸润深度和淋巴结转移相关,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:SPARC表达的缺失与子宫内膜癌的发生、发展密切相关,检测SPARC可为子宫内膜癌的早期诊断、进一步治疗及预后判断提供一定的理论依据。     

SPARC在子宫内膜癌组织中的表达及意义

目的：探讨富含半胱氨酸的酸性分泌型蛋白（secreted protien,acidic and rich in cysteine,SPARC）在子宫内膜癌组织中的表达及其临床意义。方法：应用组织芯片技术研究SPARC在正常子宫内膜、增生的子宫内膜和子宫内膜癌组织中的表达情况。结果：SPARC在正常子宫内膜、增生的子宫内膜和子宫内膜癌组织中的阳性表达率分别为96.55%、76.79%、59.50%,差异具有统计学意义（P〈0.05）。在子宫内膜癌中,SPARC的表达强度与手术-病理分期、组织学分级、肌层浸润深度和淋巴结转移相关,差异具有统计学意义（P〈0.05）。结论：SPARC表达的缺失与子宫内膜癌的发生、发展密切相关,检测SPARC可为子宫内膜癌的早期诊断、进一步治疗及预后判断提供一定的理论依据。     

Presenilin-1/Presenilin-2双基因敲除小鼠的繁育及基因型鉴定

目的:繁殖及鉴定Presenilins双基因敲除小鼠,为进一步研究阿尔茨海默症(AD)奠定基础。方法:将引进的野生型及PS1/PS2双基因敲除小鼠进行饲养并繁殖,繁殖成功的子代小鼠基因型有野生型、杂合子和纯合子3种。提取子代小鼠鼠尾基因组DNA,用PCR法和琼脂糖凝胶电泳鉴定基因类型。结果:PS1/PS2双基因敲除小鼠的饲养和繁殖均获得成功,繁殖结果符合孟德尔遗传规律,同时获得更多基因型小鼠和Presenilins双基因敲除小鼠。结论:正确的饲养繁殖以及鉴定方法是获得PS1/PS2双基因敲除小鼠的有效途径。     

GLAST基因敲除对小鼠表型及听力功能的影响

目的:观察谷氨酸天冬氨酸转运蛋白(GLAST)缺失对小鼠正常听觉功能的影响。方法:我们选用C57BL/6J背景的GLAST^+/-小鼠进行杂交,用琼脂糖凝胶电泳进行后代小鼠基因型鉴定。我们选用9～10周龄雄性小鼠,用免疫荧光染色技术检测耳蜗中GLAST蛋白表达,对敲除结果进行验证(n=3)。比较雌雄小鼠出生后7d至30 d体重变化及30 d的体长(n=8)。听性脑干反应(ABR)测试9-10周龄雌性和雄性小鼠听觉阈值及其Ⅰ波振幅的变化(n=5)。结果:雄性GLAST^-/-小鼠与雄性GLAST^+/+和GLAST^+/-小鼠相比,体重及体长均显著降低(P<0.01),其中雄性GLAST^-/-小鼠与GLAST^+/+相比,在P7至P30统计时间里,均表现出明显差异;与雄性GLAST^+/-小鼠相比,P15后均表现出体重显著性降低。而雌性GLAST^-/-小鼠与雌性GLAST^+/+和GLAST^...     

敲除NDRG2 基因的AD模型小鼠的构建与鉴定

目的:构建与鉴定NDRG2基因全身敲除的阿尔茨海默症(AD)小鼠模型。方法:将NDRG2-/-、APP/PS1进行饲养杂交繁殖,将通过PCR技术鉴定基因型为NDRG2+/-APP/PS1的子一代小鼠再与NDRG2-/-小鼠回交获得子二代小鼠,提取子二代小鼠的基因组DNA再利用PCR方法:扩增NDRG2和APP/PS1基因片段并进行琼脂糖凝胶电泳检测获得4种基因型的小鼠。结果:选取基因型为NDRG2-/-APP/PS1的小鼠即为全身NDRG2敲除且淀粉样蛋白基因过表达的阿尔茨海默症模型小鼠。应用PCR方法:鉴定NDRG2基因全身敲除的AD小鼠模型。成功获得NDRG2基因全身敲除的AD小鼠,该基因型小鼠有繁殖能力,其繁殖符合孟德尔遗传规律。结论:成功构建NDRG2基因敲除的阿尔茨海默症模型小鼠,为进一步研究NDRG2基因在阿尔茨海默症病理发展过程中的作用机制及新的治疗方法的研究提供模型基础。     

利用基因诱捕技术进行小鼠基因剔除的初步研究

对利用基因诱捕技术进行小鼠基因剔除做了初步的探索,为进一步应用该技术进行小鼠基因功能研究奠定了基础.利用基因诱捕载体转染小鼠ES细胞,获得了36株neo基因单拷贝整合的诱捕ES细胞,其中14株细胞表达有活性的β半乳糖苷酶.将3株诱捕ES细胞分别经显微注射引入到受体囊胚中,再植入假孕母鼠的子宫中使其发育成小鼠.两株细胞得到了程度不同的嵌合体小鼠,其中一株诱捕ES细胞整合至生殖系.利用质粒拯救实验获得了诱捕载体整合位点附近的基因组序列,通过序列比对发现被诱捕的基因可能是一个新基因.X-gal染色结果显示,该基因的表达局限于小鼠腹部及肢芽的部位.     

肝脏特异性CD36基因敲除小鼠的制备及鉴定

目的:运用Cre/Loxp重组酶系统构建肝脏特异性CD36基因敲除小鼠并进行鉴定和验证,为研究CD36的生物学功能奠定基础。方法:构建CD36打靶载体,电转转染胚胎干细胞,通过长链PCR筛选出正确同源重组的阳性克隆,阳性胚胎干细胞克隆经扩增后,注射入C57BL/6J小鼠的囊胚中,获得嵌合小鼠,再与Flp小鼠交配筛选获得Flox杂合子小鼠,该小鼠与引进的Alb-Cre小鼠交配,在F3代获得CD36fl/fl:Alb-Cre+基因型小鼠,即为肝脏特异性CD36敲除小鼠。采用PCR鉴定小鼠基因型,PCR、实时荧光定量PCR和Western blot验证小鼠肝脏CD36敲除效果,Western blot检测小鼠肾脏、脂肪和心肌组织CD36表达情况,HE染色观察小鼠肝脏形态学改变。结果:建立了CD36基因的Flox杂合子小鼠,与Alb-Cre小鼠交配后,在F3代筛选出CD36fl/fl:AlbCre-和CD36fl/fl:Alb-Cre+基因型小鼠,DNA水平证实CD36fl/fl:Alb-Cre+基因型小鼠肝脏CD36基因通过Cre/Loxp重组酶系统被敲除。与CD36fl/fl:Alb-Cre-基因型小鼠相比,CD36fl/fl:Alb-Cre+基因型小鼠肝脏CD36mRNA和蛋白表达水平显著降低,肾脏、脂肪和心肌组织CD36蛋白表达无差别,肝脏形态学特征无明显差异。结论:通过Cre/Loxp重组酶系统成功构建了肝脏特异性CD36基因敲除小鼠,为研究CD36在肝脏代谢和肝脏疾病中的功能提供了动物模型。     

基因剔除小鼠研究的新进展

基因剔除小鼠是活体内研究基因及蛋白质功能的理想动物模型。传统的基因剔除技术存在表型分析复杂、周期长、操作繁杂等缺点,如何更科学、更方便地建立基因剔除小鼠模型成为目前使该技术更好地应用于医学研究的关键。本文从胚胎干细胞（ES细胞）的遗传背景、组织特异性基因表达基因剔除小鼠及基因剔除技术上的革新几方面介绍了目前基因剔除小鼠研究的一些最新进展。     

Cre-LoxP条件性基因敲除的实际应用策略

Cre-loxP系统是起源于P1噬菌体的高效重组系统,其根据loxP位点组合不同而发生特定重组的模式使其成为近年来基因编辑最常用的工具之一。本文聚焦于Cre-loxP系统的实际应用问题,首先分析了CRISPR/Cas9系统在插入Cre序列与loxP序列中的作用与优势,随后阐述了一系列Cre-loxP系统的实际应用问题。本文阐述了Cre重组酶序列的原位插入与安全位点插入的选用、loxP序列插入的策略、Cre重组酶的标签蛋白鉴定、“异位”表达的荧光鉴定、PCR鉴定法的引物设计与工具鼠的繁殖策略等。同时,介绍了Cre-loxP系统在条件性基因敲除中的优化应用,例如配体诱导型Cre、启动子激活型Cre、光诱导型Cre与活性改造型Cre等。通过这些优化应用,可以获得对条件性基因敲除的时间可控性,也可以调节Cre重组酶的活性,甚至可以规避Cre重组酶本身的毒性。最后,论述了Cre-loxP系统面临的缺陷与挑战,展望了未来Cre-loxP系统的发展方向。总而言之,本文综述了基于Cre-loxP系统的基因敲除的实际应用,总结了目前Cre-loxP系统最前沿的研究进展和优化策略,并对未来基于Cre-loxP系统的基因编辑进行展望。本文旨在提供解决基于Cre-loxP系统实际操作问题的理论指导,并为未来更精确、更可控、更具适应性的基因编辑提供新的研究思路。     

Smad3基因剔除小鼠的繁殖与基因型鉴定

目的为进一步深入研究Smad3基因在脊椎动物发育中的重要作用,对Smad3基因剔除小鼠进行保种和繁育研究.方法采用基因剔除杂合子小鼠进行保种,通过PCR和Southern杂交对杂合子小鼠交配所产生的后代进行基因型鉴定,纯合子小鼠和野生型小鼠用于表型分析,杂合子小鼠用于留种和繁殖生产.结果采用PCR方法对278只子代小鼠进行了基因型鉴定,83只为野生型,133只为杂合子,62只为纯合子.结论Smad3基因剔除突变能稳定遗传.采用杂合子小鼠保种,子代小鼠三种基因型比例符合孟德尔遗传定律.     

小鼠膜联蛋白Ⅱ基因剔除重组子的构建及小鼠无膜联蛋白Ⅱ细胞系的建立

为了便于对膜联蛋白II(annexinII)的进一步研究以及今后进一步发展膜联蛋白II-/-动物模型,构建了膜联蛋白II基因封闭重组子(pPNT/annexinII/LacZ),筛选了细胞(L5178Y)克隆,并获得了膜联蛋白II-/-稳定细胞克隆(D4,E2)。所获膜联蛋白II-/-L5178Y克隆有待于以PCR做进一步鉴定。     

精胺对Azin1基因敲除小鼠体内Atp8a1基因表达调控的研究

目的 研究精胺对Azin1基因敲除小鼠体内Atp8a1基因表达的影响,并对其作用机理进行初步的探讨.方法 利用Real-time PCR检测正常小鼠和Azin1基因敲除小鼠体内Atp8a1基因的在mRNA水平上的差异表达情况;构建Atp8a1基因的启动子虫荧光素酶报告质粒;将启动子重组质粒转染NTH3T3细胞后,在细胞培养液中加入精胺,检测精胺对启动子活性的影响.结果 Atp8a1基因在Azin1基因敲除小鼠体内的表达量明显增加;精胺能够增强Atp8a1的启动子活性.结论 精胺能够通过增强Atp8a1的启动子活性而增强其在Ain1基因敲除小鼠体内转录水平的表达.