黄化油菜突变体Cr3529子叶类囊体膜光谱性质研究

以发育10d的黄化油菜突变体为材料,分析了突变体油菜子叶类囊体膜的色素含量、室温吸收光谱、叶绿素荧光发射和激发光谱以及蛋白内源荧光光谱的变化。数据显示：与野生型相比,突变体油菜子叶类囊体膜的光合色素Chl α和Chl b含量均减少．但Chl α／b比值升高;突变体油菜子叶类囊体膜叶绿素捕光能力和受激发能力均下降,且较依赖于Chl α捕光并将光能激发传递给PSⅡ反应中心;突变体油菜子叶类囊体膜的蛋白内源荧光也明显异于野生型。进一步表明突变体油菜子叶类囊体膜蛋白组成发生了改变。     

不同失水状态发菜类囊体膜蛋白的分离及鉴定

采用液氮研磨与超声波破碎相结合的方法,破碎不同失水状态的发菜藻体和细胞,用差速离心法制备发菜类囊体膜粗制品,蔗糖密度梯度高速离心纯化类囊体膜,SDS-PAGE电泳分离类囊体膜蛋白,并对膜蛋白进行了MALDI-TOF-TOF/MS质谱分析和鉴定。结果表明:(1)充分吸胀4h后失水6h的发菜(含水量51.2%)和失水24h的发菜(含水量14.9%),经过多步差速离心后再进行蔗糖密度梯度高速离心,可得到纯化的类囊体膜。(2)发菜类囊体膜蛋白SDS-PAGE电泳分离到14个条带,共鉴定出8种蛋白,根据其功能可分为4类——光合作用相关蛋白(光系统Ⅱ锰稳定蛋白PsbO,F1F0 ATP合成酶α亚基和β亚基)、结构域蛋白、选择性通道蛋白OprB、未知蛋白(hypothetical protein Npun_R1321、Npun_R3785、N9414_02186),它们在发菜的光合作用中具有重要作用。     

发菜类囊体膜色素蛋白复合物分离及其谱性质的研究

Nostoc flagelliforme Born. et Flah is highly adapted to drought stress, cold and light stresses, and suitable for growing in the unfavorable areas. This paper presents the results of the analysis of the membrane (mainly thylakoid membrane) lipids from N. flagelliforme in order to investigate the relationship between membrane lipid composition and stress resistance to this cyanobacteria. The membrane lipids are composed of monogalactosyl diacylglycerol (MGDG), digalactosyl diacylglycerol (DGDG), sulfoquinovosyl diacylglycerol (SQDG) and phosphatidylglycerol (PG). The major fatty acids in these lipids are palmitic (16∶0), palmitoleic (16∶1), stearic (18∶0), oleic (18∶1), linoleic (18∶2) and linolenic (18∶3) acids. In N. flagelliforme, polyunsaturated fatty acids account for 73% of the total fatty acids, much higher than that of the other cyanobacteria reported so far. Among which 16∶1 and 18∶3 are as high as 28.9% and 34.3% respectively. The high resistance of N. flagelliforme to abnormal conditions may be associated with the extent of unsaturation of fatty acids. In addition, the wild N. flagelliforme treated with water for 30 min and cultured for 24 h and the lipid and fatty acid composition were found to be not affected by water-absorption.     

野生和黄化大麦类囊体膜色素蛋白的分离和比较

用混和去垢剂（ＳＤＳ、ＯＧ）增溶和温和电泳方法,对野生和黄化大麦的叶绿体类囊体膜进行了色素蛋白复合体组成的分离和比较,并结合ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳对类囊体膜蛋白进行了鉴定。结果表明,黄化大麦类囊体膜色素蛋白组分中,ＬＨＣ Ⅱ和ＬＨＣ Ⅰ的含量都较野生型大麦明显减少;并讨论了黄化大麦类囊体膜色素蛋白含量的减少与其光合速率降低的关系。     

鱼腥藻类囊体膜及其性质的研究

研究了鱼腥藻(Anabaena azollae Strasb.)的光合膜及其性质,结果如下:(1)以培养液为反应介质,测出鱼腥藻细胞的光合放氧,这种放氧受电子传递抑制剂DCMU的抑制。1mmol/L的NH_4Cl既延迟光合放氧的诱导期又抑制光合放氧速率。(2)在700～300nm波长范围,鱼腥藻出现4个吸收高峰,分别位于680、625、480和440nm处。其中625nm的吸收峰应属蓝绿藻的特有吸收峰。(3)通过高压氮气破碎法,并结合超声波处理,可以破碎鱼腥藻细胞壁,并从中分离出鱼腥藻类囊体膜制剂。测定表明,这种膜制剂具有进行光合磷酸化的能力,同时亦有膜上ATP酶水解ATP的能力。(4)利用此膜制剂,分离并部分纯化出ATP酶,在SDS-PAGE图谱上,此酶的两种小亚基(δ和ε亚基)的分子量分别低于菠菜叶绿体ATP酶的δ和ε亚基,但两种酶的α和β两种大亚基的分子量相近。以上结果提示,鱼腥藻具有进行光合作用的内在机构,这种机构在组分及其性质上与其它种类光合膜的异同是值得深入研究的课题。     

盐酸胍对毕氏海蓬子类囊体膜蛋白光谱特征的影响

研究了盐酸胍（GuHCl）处理对毕氏海蓬子类囊体膜蛋白亚基和光谱特征的影响。结果显示,随着GuHCl处理浓度的增高,类囊体膜蛋白的吸收光谱和荧光发射光谱明显下降,峰位发生蓝移。这表明GuHCl处理下,类囊体膜蛋白色素微环境发生明显变化,色素蛋白结构遭到破坏;较低浓度2mmol.L-1GuHCl处理下,随着GuHCl处理时间的延长,类囊体膜蛋白的吸收光谱和荧光发射光谱也呈下降趋势,但与GuHCl浓度梯度处理比,下降程度略缓,峰位也基本没有变化。这说明类囊体膜在2mmol.L-1GuHCl不同处理时间下表现出的耐受性比在GuHCl浓度梯度处理条件强。     

低温胁迫期间水稻光合膜色素与蛋白水平的变化

对４℃和１１℃两种低温胁迫过程中水稻类囊体膜色素与蛋白组成的变化进行了比较研究。结果表明：４℃低温不仅使类囊体膜中的光合色素（叶绿素、类胡萝卜素）含量降低,而且还引起膜蛋白组成的深刻变化,表现在大部分原有膜蛋白组分的含量在低温下明显降低,同时在低温处理的第３天诱导出一条３２．５ＫＤ的新蛋白带。与４℃处理相比,１１℃低温处理只引起了光合色素含量的降低,而对类囊体膜蛋白组成的影响不大,另外发现,两种低     

从超声波破碎的蓝藻类囊体膜中分离的叶绿素蛋白复合物

当蓝藻的类囊体膜用超声波进行破碎,并在4℃下用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离,有6条叶绿素带被分离出来,它们分别是 CPIa,CPIb,CP1,CPa1 CPa2,FC。CP1 在红区和蓝区的吸收峰分别位于674和435 nm 处。在液氮甲该组分在725和680 nm 处有两个荧光发射带。CPa1和 CPa2的吸收光谱相似,其红峰和蓝峰的位置分别位于667和431.5nm 处。它们在77 K 的荧光发射峰都位于684 nm 处。用超声破碎法分离的叶绿素蛋白复合物的光谱特性,除 CPa1和 CPa2在红峰和蓝峰的吸收位置蓝移了3—5 nm 之外,其余与用 SDS 增溶法分离的相应复合物相似。属于光系统Ⅰ的 CPIa-CPI 的叶绿素含量占总叶绿素的40.93%,而属于光系统Ⅱ的 CPa1和 CPa2的叶绿素则占总叶绿素的38.78%,二者之差仅有2.15%。     

发菜膜脂及其脂肪酸组成

对野生发菜（Ｎｏｓｔｏｃ ｆｌａｇｅｌｌｉｆｏｒｍｅ Ｂｏｒｎ．ｅｔ Ｆｌａｈ）的膜脂（主要成分为类囊体膜脂）及其脂肪酸组成进行了测定分析。发菜的膜脂由单半乳糖甘油二酯（ＭＧＤＧ）、双半乳糖甘油三酯（ＤＧＤＧ）、磷酯酰甘油（ＰＧ）和硫代异鼠李糖甘油二酯（ＳＱＤＧ）组成,其酯酰基连接有棕榈酸（１６：０）、十六碳烯酸（１６：１）、硬脂酸（１８：０）、油酸（１８：１）、亚油酸（１８：２）和亚麻酸（１８：     

发菜膜脂及其脂肪酸组成

对野生发菜(Nostocflagelliforme Bom.et Flab)的膜脂(主要成分为类囊体膜脂)及其脂肪酸组成进行了测定分析.发菜的膜脂由单半乳糖甘油二酯(MGDG)、双半乳糖甘油二酯(DGDG)、磷酯酰甘油(PG)和硫代异鼠李糖甘油二酯(SQDG)组成,其酯酰基连接有棕榈酸(16:0)、十六碳烯酸(16:1)、硬脂酸(18:0)、油酸(18:1)、亚油酸(18:2)和亚麻酸(18:3)6种脂肪酸.发菜的不饱和脂肪酸含量可达总脂的73%,特别是16:1和18:3分别高达29%和34%,远远高于已报道的其他蓝藻,说明了发菜类囊体膜具有较强的抗逆性特点.同时还对复水30 min和复水后生长24 h的发菜膜脂及其脂肪酸组成进行了分析.结果表明,复水对野生发菜的膜脂及其脂肪酸组成没有显著影响,说明发菜的膜脂和脂肪酸组成在干燥-吸水过程中能保持很高的稳定性.     

发菜藻蓝蛋白分离纯化的研究

以发菜为材料,比较了提取液类型和饱和硫酸铵浓度对藻蓝蛋白提取的影响,并对藻蓝蛋白的提取程序和部分特性进行了研究。结果表明:50 mmol/L KP缓冲液(pH值7.2)是合适的提取液,体积分数为40%~50%饱和硫酸铵盐析效果优于其它浓度。经过DEAE-Toyopeal 650 S离子交换层析和SuperdexTM200凝胶过滤层析后,藻蓝蛋白纯度达6.2,最大吸收峰位于615 nm,荧光发射峰位于649 nm,由α和β2个亚基组成,其分子质量分别为18 051.17和19 142.27 Da。因此,发菜藻蓝蛋白分离纯化较为理想的程序为:藻粉→50 mmol/L KP缓冲液(pH值7.2)浸泡→French pressure(1 500 kg/cm2)破碎细胞→40%~50%饱和硫酸铵盐析→DEAE-Toyopeal 650 S离子交换层析→SuperdexTM200凝胶过滤层析→较纯的藻蓝蛋白。     

发状念珠藻(发菜)细胞质膜的分离与性质分析

使用一种新方法首次从野生发菜(Nostoc flagelliforme Born.et Flah.)中分离得到细胞质膜并对其性质进行了分析,该方法的主要特点为联合使用细胞破碎仪和毛地黄皂甙对发菜细胞进行破碎.经过细胞破碎仪处理两次(80MPa)后,样品(20mg干重/mL)中的细胞可被毛地黄皂甙(3mg/mL)有效破碎,细胞质膜即可通过蔗糖密度梯度离心得以分离.纯化后的质膜,其吸收光谱中类胡萝卜素的3个吸收峰分别位于458、487和524 nm,另外一种叶绿素前体在673 nm处有少量吸收,质膜的荧光发射来自该叶绿素前体.通过变性电泳对其进行多肽组成分析,可分辨出30多条多肽,其中分子量为80、28、19和17 kD的多肽含量最高.其膜脂主要包含4种成分:单半乳糖甘油二酯(62.4%)、双半乳糖甘油二酯(18.9%)、硫代异鼠李糖甘油二酯(16.7%)和磷酯酰甘油(2.0%).膜脂酯酰基连接有棕榈酸(16:0)、十六碳烯酸(16:1[9])、硬脂酸(18:0)、油酸(18:1[9])、亚油酸(18:2[9,12])和亚麻酸(18:3[9,12,15])等六种脂肪酸,其中十六碳烯酸和亚麻酸为主要成分,分别占总脂肪酸含量的32.3%和34.4%.质膜中高含量的亚麻酸可能是发菜具有极强抗旱能力的一个重要因素.     

发状念珠藻胞外多糖的纯化与性质分析

采用DEAE阴离子交换层析和Sephadex G100凝胶层析对液体悬浮培养发状念珠藻胞外多糖进行纯化, 得到两个组分NFPS1和NFPS2。对组分NFPS2进行理化性质分析, 并与野生发状念珠藻多糖NFPS0的性质进行对比。结果表明二者具有相似的单糖组成, 均为葡萄糖、木糖、半乳糖、甘露糖; 表观分子量分别为2.79×105、2.26×105; 均不含核酸、蛋白质等物质, 是非硫酸化多糖; 有较高的热稳定性, 其降解温度在245oC左右。但在微观结构上, 两者存在一定差别。     

发状念珠藻胞外多糖的纯化与性质分析

采用DEAE阴离子交换层析和Sephadex G100凝胶层析对液体悬浮培养发状念珠藻胞外多糖进行纯化, 得到两个组分NFPS1和NFPS2。对组分NFPS2进行理化性质分析, 并与野生发状念珠藻多糖NFPS0的性质进行对比。结果表明二者具有相似的单糖组成, 均为葡萄糖、木糖、半乳糖、甘露糖; 表观分子量分别为2.79×105、2.26×105; 均不含核酸、蛋白质等物质, 是非硫酸化多糖; 有较高的热稳定性, 其降解温度在245oC左右。但在微观结构上, 两者存在一定差别。     

Isolation and Characterization of the Cytoplasmic Membrane from the Terrestrial Cyanobacterium -Nostoc flagelliforme

Cytoplasmic membrane of Nostoc flagelliforme Born. et Flah. was isolated for the first time with a new method, the unique feature of which is the combined use of French pressure cell and digitonin to disrupt cells. After passed twice through French pressure cell (at 80 MPa), cells in sample (20 mg of dry weight/mL) were disrupted effectively by digitonin (3 mg/mL), and then the cytoplasmic membrane was isolated by density gradient centrifugation. The membrane contained carotenoids with absorption peaks at 458, 487 and 524 nm and a precursor of chlorophyll a with a minor peak at 673 nm. The fluorescence emission peaks of the membrane were emitted from the precursor of chlorophyll a. More than 30 polypeptides were detected in the membrane, in which the most obvious corresponded to the polypeptides with molecular mass of 80,28,19 and 17 kD. The membrane contained four types of glycerolipids: MGDG(62.4%), DGDG (18.9%), SQDG (16.7%) and PG (2.0%). 16:0, 16:1 [9], 18:0, 18:1 [9], 18:2 [9, 12] and 18:3 [9,12,15] fatty acids were determined in the membrane, in which 16:1 and 18:3 fatty acids were the main components, representing 32.3% and 34.4% of the total fatty acids respectively. High proportion of 18:3 fatty acid in the cytoplasmic membrane may be an important factor of N. flagelliforme in its remarkable drought-tolerant ability.     

小麦叶片类囊体膜蛋白复合体的分离和分析技术研究

膜蛋白复合体在生命活动中执行着重要的生物化学功能,具有重要的研究意义,但由于其低表达和高度疏水的特点,完整状态和低丰度的膜蛋白复合体的分离分析仍是一大挑战.首先,采用蓝绿温和胶非变性电泳作为第一维分离技术,大量分离制备叶绿体类囊体膜蛋白复合物;其次,采用电洗脱方法差异富集第一维电泳分离到的各种蛋白复合体;最后,采用SDS-PAGE作为第二维分离技术,分析差异富集的不同种蛋白复合体的亚基构成.研究结果表明,利用这种分离分析模式,能有效地富集膜蛋白复合体尤其是低丰度膜蛋白复合体,明显提高第二维分离分析的分辨率和蛋白覆盖率.     

发菜NdhK的抗体制备与蛋白表达

发菜是一种陆生蓝藻,分布于一些干旱和半干旱区域。其NADPH脱氢酶(NDH-1)是一种重要的光合膜蛋白复合体,参与CO₂吸收、围绕光系统Ⅰ的循环电子传递和细胞呼吸。为研究该物种中ndhK基因的功能,本研究利用特异性引物,通过PCR方法从发菜中扩增ndhK基因并克隆到原核表达载体pET-32a上,得到表达载体pET-32a-ndhK,将其转入大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,得到分子量大小为43 kDa的融合蛋白NdhK。随后,采用亲和层析,对融合蛋白进行纯化回收,并以此回收蛋白作为抗原进行免疫,制备NdhK的多克隆抗体。最后,利用Western blot蛋白免疫印迹对所得抗体的特异性进行验证。从而为进一步探索发菜ndhK基因的功能以及发菜中NDH-1复合体各亚基的作用进行前期准备。