重组枯草芽抱杆菌的构建及对街体的Cl , 2 位脱氢

本文将简单节杆茵3-甾酮-1-脱氢酶基因克隆到分泌表达载体pWB980上,并转入枯草芽孢杆菌WB600中,得到重组芽孢杆菌菌株。重组芽孢杆菌表达出的目的蛋白的分子量为55KDa,分光光度法检测到胞内和胞外可溶性部分的酶活分别为110±0．5mU和15±0．6mU每毫克蛋白,对甾体底物4-AD的转化率为45．3%,比出发茵简单节杆菌提高了将近10倍。     

3-甾酮-1-脱氢酶在不同表达体系中的表达研究

简单节杆菌3-甾酮-1-脱氢酶(KSDH),是甾体母核降解的关键酶,属于黄素蛋白类,并且是一种膜蛋白。膜蛋白的高效表达一直是一个难题。本文尝试利用三种不同的大肠杆菌表达体系,pET-30a/BL21(DE3)、pET-40b( )/BL21(DE3)和pTrc99A/JM109对C1,2位脱氢酶进行诱导表达,并对蛋白的表达量和酶活力进行比较分析,确定出最适的表达系统。     

碱性蛋白酶SubC在枯草芽孢杆菌中的高效异源表达

【背景】碱性蛋白酶是工业用酶中占比最大的酶类,广泛应用于清洁、食品、医疗等行业。近期研究发现碱性蛋白酶在生产生物活性肽方面有巨大潜力,这将进一步拓宽其在保健食品领域中的应用。【目的】利用枯草芽孢杆菌异源表达地衣芽孢杆菌来源的碱性蛋白酶SubC。【方法】通过筛选3种枯草芽孢杆菌宿主菌株(Bacillus subtilis 1A751、MA07、MA08)和6种信号肽(AmyE、AprE、NprE、Pel、YddT、YoqM),同时优化诱导剂浓度、发酵培养基和发酵时长,最终得到最优重组菌株MA08-AmyE-subCopt。【结果】重组菌株MA08-AmyE-subCopt的胞外酶活力为3.33×103 AU/mL,胞外蛋白分泌量为胞内可溶蛋白表达量的4倍,与携带野生型信号肽的对照组菌株WT相比,酶活提高了73.4%。【结论】异源碱性蛋白酶SubC在枯草芽孢杆菌中成功表达,为碱性蛋白酶SubC的表达和在保健食品领域的工业化应用提供了理论基础。     

枯草芽孢杆菌中高效响应N-乙酰神经氨酸生物传感器的构建

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是公认的食品安全菌株,目前已被用于多种高附加值产品的生物合成,包括被广泛用作营养化学品和药物中间体的N-乙酰神经氨酸(N-acetylneuraminic acid, NeuAc)。响应目标产物的生物传感器被广泛用于代谢工程中的动态调控和高通量筛选等方面,以提高生物合成效率。但是,枯草芽孢杆菌中缺乏可高效响应NeuAc的生物传感器。因此,本文首先测试和优化了能将胞外NeuAc转运进胞内的转运蛋白,获得了一系列具有不同转运能力的菌株,以用于后续响应NeuAc的生物传感器的验证;随后将响应NeuAc的转录因子Bbr_NanR的结合位点插入枯草芽孢杆菌组成型启动子的不同位置,筛选具有活性的杂合启动子;接下来,通过在具有NeuAc转运能力的枯草芽孢杆菌中表达Bbr_NanR,选择能响应NeuAc的杂合启动子,并进一步通过优化Bbr_NanR表达量获得了一系列动态范围广、激活倍数高的生物传感器,其中生物传感器P535-N2能灵敏地响应胞内NeuAc浓度的变化,具有最大的动态范围,为(180–20 245) AU/OD;P566-N2则具有最高的激活倍数,为122倍,是已报道的枯草芽孢杆菌中响应N-乙酰神经氨酸的生物传感器的2倍。本文构建的响应NeuAc的生物传感器可用于高产NeuAc的酶突变体和枯草芽孢杆菌菌株的筛选,为枯草芽孢杆菌生物合成NeuAc提供了高效、灵敏的分析和调控工具。     

β-半乳糖苷酶在枯草芽孢杆菌中的分泌表达

为检测本课题组构建的枯草芽孢杆菌分泌表达载体pGPST中启动子和信号肽的活性,将β-半乳糖苷酶基因插入表达载体的多克隆位点,构建含有β-半乳糖苷酶基因的重组质粒pGPST-lacZ,重组质粒转化枯草芽孢杆菌,分别测定液体培养基中上清液和菌体沉淀中β-半乳糖苷酶的活性。培养上清液中的酶活在22h达到峰值,约为26mU/mL,之后开始下降;菌体沉淀中的酶活在14h最高,达6mU/mL,而阴性对照pGPST没有检测到酶活性。结果表明分泌型表达载体中的启动子和信号肽具有较好的活性,能实现异源基因在枯草芽孢杆菌中的分泌表达。本试验为该表达载体的进一步研究和应用提供重要的数据资料,也为外源基因在枯草芽孢杆菌中的表达提供参考资料。该载体将在研究外源基因在枯草芽孢杆菌中表达发挥重要作用。     

一株高效氧化胆固醇的简单节杆菌构建与转化条件优化

为实现胆固醇的高效生物氧化,利用基因工程手段将编码简单节杆菌胆固醇氧化酶的DNA片段克隆到质粒pTY2中,构建pTY2-5332插入表达载体。该载体以简单节杆菌基因组中的16S rDNA位点为整合点,提高了胆固醇氧化酶在基因组中的拷贝数,实现了简单节杆菌胆固醇氧化酶的过表达。重组菌的生长实验分析表明,插入到16S rDNA位点的胆固醇氧化酶没有影响简单节杆菌的生长。重组菌可在20h将2g/L的胆固醇完全转化为4-胆甾烯-3酮,比原始菌的转化时间缩短了4h,提高了胆固醇的转化效率。经过转化条件优化确定了该重组菌以2%的接种量后继续培养16h,然后胆固醇经120目过筛后投料量为2g/L,并添加2%（体积比）二甲基甲酰胺作为促溶剂;胆固醇添加18h后可完全转化为4-胆甾烯-3-酮,是优化前的1.11倍。     

拆分获得(S)-酮基布洛芬脂肪酶基因在枯草芽孢杆菌中的克隆与表达

【目的】筛选具有不对称拆分消旋酮基布洛芬氯乙酯能力的脂肪酶基因,构建其表达分泌型工程菌,并进一步提高该脂肪酶的立体选择性。【方法】以自筛选出的一株具有不对称拆分消旋酮基布洛芬氯乙酯能力的菌株NK13为材料,通过构建其基因组文库,筛选具有不对称拆分消旋酮基布洛芬氯乙酯能力的脂肪酶基因。通过构建该脂肪酶基因的分泌型诱导表达载体pHY300-plk-sacR-gene,将其转入枯草芽孢杆菌WB600,获得基因重组菌WB600(pHY300-plk-sacR-gene)。用SDS-PAGE检测其表达和转化情况,采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法纯化脂肪酶;并利用TLC和HPLC检测该酶的立体选择专一性。【结果】得到了具有专一性拆分获得(S)-酮基布洛芬能力、长度为633bp的脂肪酶基因(GenBank登录号为:EU381317)。该脂肪酶在枯草芽孢杆菌WB600中得到了分泌表达。TLC和HPLC检测结果显示,纯化的脂肪酶对底物转化40h时转化率为30%,生成(S)-酮基布洛芬的e.e.%值最高,达60.02%,与未加Tween-80的枯草芽孢杆菌转化子体系相同。而在含Tween-80的环境下,枯草芽孢杆菌表达重组菌对底物转化36h时转化率约为45%,生成(S)-酮基布洛芬的e.e.%值最高,达93.64%,是野生菌NK13的16倍。【结论】从NK13号菌株中筛选得到的新的脂肪酶具有很高的不对称拆分获得(S)-酮基布洛芬的能力,实现了NK13菌中633bp脂肪酶基因在枯草芽孢杆菌中的分泌表达,研究证明Tween-80能提高该脂肪酶的拆分专一性。     

α-葡萄糖苷酶菌株的选育及发酵条件的研究

从2株芽胞杆菌中通过筛选获得了一株产α-葡萄糖苷酶活力较高的嗜热脂肪芽孢杆菌U2,以嗜热芽孢杆菌U2为菌种,优化发酵培养基后,在温度45℃、初始pH6.8、转速200r/min和10%接种量条件下,发酵20h,菌株U2产酶水平可达到2.62U/mL,比出发菌提高了4倍。     

在枯草杆菌芽胞表面展示P74蛋白膜外肽段

目的:对家蚕核型多角体病毒(BmNPV)囊膜蛋白P74膜外肽段与枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)CotC与进行融合表达,制备表面展示有P74蛋白的重组芽孢,为深入研究该重组芽孢的功能提供基础.方法:将CotC基因与BmNPV P74膜外编码序列进行融合,构建表达CotC-P74融合蛋白的重组质粒pJS700-p74.通过双交换使该重组质粒中的CotC-P74表达盒整合到枯草芽胞杆菌染色体淀粉酶基因位点,并对发生同源重组后的菌株进行筛选和PCR鉴定.结果:PCR结果表明CotC-P74成功地整合到枯草芽孢杆菌基因组上,通过作者实验室制备的P74多抗对诱导后的重组芽孢衣壳总蛋白进行Western blot分析,结果在49 kDa位置处能杂交到一条特异的蛋白带.结论:P74蛋白胞外肽段成功地展示在枯草芽胞杆菌芽胞表面.     

聚γ-谷氨酸高产菌的选育与培养基优化

利用合成培养基为筛选培养基,以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B6-1为出发菌株,经过三轮紫外线诱变和一轮硫酸二乙酯诱变得到了聚γ-谷氨酸高产突变株枯草芽孢杆菌W003,摇瓶液体发酵的聚γ-谷氨酸产量由出发菌株的10.9 g/L提高到20.5 g/L.单因素实验结果表明,该菌产聚γ-谷氨酸的合适碳源为葡萄糖,氮源为硫酸铵.通过正交实验得到了优化的培养基配方,经36h液体发酵,聚γ-谷氨酸产量可达到45.3 g/L.     

内生枯草芽孢杆菌SWB8 菌株β-1，3-1，4-葡聚糖酶的抗菌作用及细胞毒性

【目的】本文研究从药用植物黄姜中分离的内生枯草芽孢杆菌菌株SWB8分泌的β-1,3-1,4-葡聚糖酶的抗菌活性和细胞毒性。【方法】利用液体发酵、凝胶渗透色谱(GPC)、十二烷基-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和液相层析串联质谱(LC-MS/MS)等方法纯化和鉴定枯草芽孢杆菌株SWB8合成的β-1,3-1,4-葡聚糖酶;利用纸片扩散法,检测葡聚糖酶抑制临床致病性细菌和真菌生长的活性;应用MTT法和流式细胞术(FCM)评估此葡聚糖酶对人肺腺癌细胞(A549)和骨髓间质干细胞(MSCs)的细胞毒性。【结果】细菌性β-1,3-1,4-葡聚糖酶显示了广谱的抗菌活性;抗肿瘤活性主要以细胞凋亡的方式选择性的抑制人肺腺癌细胞系A549细胞的增殖,而对人骨髓间质干细胞系MSC细胞无明显影响。【结论】首次报道β-1,3-1,4-葡聚糖酶的抗菌和抗肿瘤细胞的活性。内生枯草芽孢杆菌SWB8菌株有可能成为抗菌和高效低毒的抗肿瘤药物的潜在来源。     

枯草芽孢杆菌群β-甘露聚糖酶基因克隆及同源性分析

本文对33株枯草芽孢杆菌群菌株进行β-甘露聚糖酶活性筛选,其中的32株具有β-甘露聚糖酶活性,只有1株无β-甘露聚糖酶活性.通过基因克隆测序的方法获得33株枯草芽孢杆菌群菌株β-甘露聚糖酶基因编码区全序列,对酶基因进行同源性分析并构建系统发育树;在β-甘露聚糖酶基因系统发育树中,33株枯草芽孢杆菌群菌株聚为3个分支,分别是枯草芽孢杆菌分支、地衣芽孢杆菌分支和解淀粉芽孢杆菌分支;枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌β-甘露聚糖酶基因种内同源性大于91%,而种间同源性为60%69%.     

枯草芽孢杆菌表达和分泌异源蛋白的研究进展

枯草芽孢杆菌是一种广泛应用于基础研究和工业生产的重要模式菌株,具有无致病性、蛋白分泌能力强、遗传背景清晰等多种优势,是生产异源蛋白的理想宿主。目前已有诸多异源蛋白在枯草芽孢杆菌中实现表达和分泌,其中包括淀粉酶、β-半乳糖苷酶和蛋白酶等有价值的工业酶。本文从异源蛋白表达和分泌的关键步骤出发,总结了枯草芽孢杆菌生产异源蛋白的传统策略和最新技术。除此之外,分析了当前研究存在的瓶颈并对如何提高异源蛋白产量提出了新的建议和策略。     

巨大芽孢杆菌β-淀粉酶在枯草芽孢杆菌中诱导表达及碳代谢去阻遏

【背景】β-淀粉酶在食品和医疗领域应用广泛。目前工业上使用的β-淀粉酶主要从植物中提取,生产成本高,限制了β-淀粉酶的应用。微生物生产的β-淀粉酶尽管早有报道,但由于产酶水平低下,因而一直未能实现工业化。【目的】实现巨大芽孢杆菌β-淀粉酶在枯草芽孢杆菌中的高效诱导表达,缓解碳分解代谢物阻遏(Carbon catabolite repression,CCR)对该重组酶表达的影响,并研究其酶学性质。【方法】克隆枯草芽孢杆菌木糖诱导启动子,构建木糖诱导表达载体以介导巨大芽孢杆菌1514的β-淀粉酶编码基因amyM在枯草芽孢杆菌中的异源表达。定点突变位于amyM信号肽编码区的分解代谢物响应元件(Catabolite responsive element,CRE),降低碳源代谢对重组β-淀粉酶施加的阻遏。【结果】构建了诱导表达β-淀粉酶基因的重组枯草芽孢杆菌菌株。同义替换amyM-CRE保守碱基在不同程度上缓解了碳源所施加的CCR效应,重组酶的表达水平得到显著提高。重组酶的分子量为57 kD,水解可溶性淀粉主要生成麦芽糖和少量葡萄糖,其中麦芽糖含量为72%。该酶最适作用温度为50°C,最适反应pH为6.0。Co2+、Ca2+对重组β-淀粉酶具有激活作用。【结论】通过木糖诱导表达系统和碳代谢去阻遏实现了β-淀粉酶在枯草芽孢杆菌中的高效表达,酶活最高可达97.16 U/mL发酵液,比amyM基因来源菌巨大芽孢杆菌1514的β-淀粉酶产量提高了440倍,为β-淀粉酶发酵生产的工业化提供了支撑。     

解淀粉芽孢杆菌β-1,3-1,4-葡聚糖酶的高效表达

目的:克隆解淀粉芽孢杆菌β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因(bglA)使其在解淀粉芽孢杆菌CICIM B4081中高效表达,并对重组酶进行酶学性质研究.方法:以解淀粉芽孢杆菌(CICIM B4801)染色体DNA为模板,经过PCR扩增得到了大小约为0.8kb的β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因(bglA),构建了重组表达质粒pQ-bglA,通过电转化的方法将其转化人解淀粉芽孢杆菌(CICIM B4801)中.结果:得到了能高效表达β-1,3-1,4-葡聚糖酶的重组解淀粉芽孢杆菌.在250mL摇瓶条件下,重组菌分解地衣多糖的胞外最高酶活达到了1515.7U/mL,重组酶的最适作用温度为55℃,最适反应pH值为6.5.结论:重组菌的β-1,3-1,4-葡聚糖酶的酶活为原始菌株的11.84倍,实现了bglA基因在解淀粉芽孢杆菌中的高效表达.     

分枝杆菌Mycobacterium sp. NwIB-01 3-甾酮-9α-羟基化酶基因的克隆、异源表达及分离纯化

3-甾酮-9α-羟基化酶(KSH)是微生物甾体降解途径中的关键酶,在甾体药物制备中有重要价值。以本实验室从土壤中自行筛选的分枝杆菌Mycobacterium sp.NwIB-01为出发菌株,利用红平红球菌Rhodococcus erythropolis SQ1已报道的ksh序列与已全基因组测序的分枝杆菌序列数据库进行比对分析,根据同源基因设计简并引物获得部分ksh序列,通过染色体步移扩增出全长ksh(命名为M.S.-ksh),该基因与耻垢分枝杆菌M.smegmatis mc2155的ksh同源性为85%。构建pET32-ksh表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),获得高表达重组转化子菌株,经IPTG低温诱导,SDS-PAGE电泳分析,目的蛋白主要为可溶性表达,表达量占菌体总蛋白的30%以上,用Ni2+亲和层析柱纯化,纯度达90%以上。本研究为利用基因工程菌进行工业化生产甾体药物奠定了基础。     

苏云金芽胞杆菌营养期杀虫蛋白基因vip3A在枯草芽胞杆菌中的表达

枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis常被用于表达杀虫和抗菌蛋白.为了探讨苏云金芽胞杆菌B. thuringiensis营养期杀虫蛋白基因（vip3A）在枯草芽胞杆菌中的表达情况,促进杀虫防病工程菌构建,将枯草芽胞杆菌168菌株核糖体小亚基S4蛋白基因的启动子与苏云金芽胞杆菌WB7菌株vip3A基因的编码序列连接,插入大肠杆菌Escherichia coli与枯草芽胞杆菌穿梭载体pAD123,得到重组原核表达质粒pADpvip,将重组质粒转化枯草芽胞杆菌标准菌株168和分离自辣椒体内的生防内生枯草芽胞杆菌BS-2菌株中,获得工程菌株.SDS-PAGE分析表明在枯草芽胞杆菌168菌株的部分工程菌株中有约88 kDa大小的VIP条带,而BS-2的工程菌株中未见相应的条带,表明Vip3A蛋白仅在168菌株中表达.生物测定表明有5株168的工程菌株（168vip1-4,6）表现较高的杀虫活性,工程菌株发酵稀释液（约10⁷CFU/mL）处理的小白菜叶片饲喂斜纹夜蛾2龄幼虫72 h的杀虫效果可达87.64%~92.13%,但vip3A基因转入内生枯草芽胞杆菌BS-2中不表现杀虫作用.毒力测定表明168vip2菌株对斜纹夜蛾2龄幼虫72 h的LC₅₀为0.0194 mL/mL.这些结果为进一步研究基因在枯草芽胞杆菌中的表达构建杀虫防病工程菌打下了基础.     

枯草芽孢杆菌β-甘露聚糖酶在毕赤酵母中的分泌表达

目的:研制高效分泌表达枯草芽孢杆菌β-甘露聚糖酶的毕赤酵母基因工程菌株。方法与结果:将优化设计的枯草芽孢杆菌MA139β-甘露聚糖酶基因用EcoRⅠ/XbaⅠ双酶切,克隆到诱导型表达载体pPICzαA中α因子信号肽编码序列的下游,转化大肠杆菌筛选重组质粒,转化毕赤酵母X-33感受态细胞,经Zeocin筛选,获得重组表达菌株X-33/mann。将重组菌株在10L全自动发酵罐中进行高密度发酵培养,甲醇诱导72h发酵活力达到2100U/mL。重组甘露聚糖酶的最适催化温度为40℃,最适催化pH值为6.0。结论:枯草芽孢杆菌β-甘露聚糖酶在毕赤酵母中获得了高效分泌表达,具有开发作为饲料添加剂的潜能。     

分枝杆菌细胞裂解液催化甾体激素C_(1,2)位脱氢反应的研究

9β,11β-环氧-17α,21-二羟基-16β-甲基孕-1,4-二烯-3,20-二酮(Ⅳ)是生产9-氟甾体激素的关键前体,以9β,11β-环氧-17α,21-二羟基-16β-甲基孕-4-烯-3,20-二酮-21-醋酸酯(Ⅰ)为底物合成Ⅳ是工业化生产Ⅳ的重要方法。通过比较分枝杆菌全细胞转化法与细胞裂解液转化法,发现分枝杆菌全细胞只能将Ⅰ转化为9β,11β-环氧-17α,21-二羟基-16β-甲基孕-4-烯-3,20-二酮(Ⅱ),而细胞裂解液可以有效地将Ⅰ转化为Ⅳ,其反应机制为底物Ⅰ自发水解为中间体Ⅱ,Ⅱ在C_(1,2)位脱氢酶(KSTD)的催化作用下发生C_(1,2)位脱氢反应生成产物Ⅳ。为进一步提高产物Ⅳ的转化率,利用基因工程手段在分枝杆菌中分别过表达编码KSTD的关键基因:kst D、kst D3和kstD_M,提高脱氢反应效率,结果表明1 g/L底物Ⅰ在pH7.0的重组菌株MS136-kst D_M细胞裂解液中反应45h,Ⅳ的转化率为78.4%,比出发菌株提高了38.9%;并优化缓冲液pH,提高反应速率,结果表明1 g/L底物Ⅰ在pH7.5的重组菌株MS136-kstD_M细胞裂解液中反应45 h,Ⅳ的转化率为92.8%,比出发菌株提高了63.4%。     

表达3-甾酮-△1-脱氢酶降解植物甾醇合成雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮

构建分枝杆菌表达载体pMTac并在分枝杆菌Mycobacterium neoaurum JC-12中加强表达甾醇降解过程中的关键酶3-甾酮-△1-脱氢酶(KSDD)以提高雄甾-1,4-二烯-3,17-二铜(ADD)的产量。将p MF41的启动子pACE替换成tac启动子构建载体pMTac,在分枝杆菌中分别表达报告基因绿色荧光蛋白(GFP)和关键酶KSDD,通过GFP亮度和KSDD酶活验证tac启动子在M.neoaurum JC-12中的效果,并发酵验证加强表达KSDD对产物ADD的影响。荧光显微照片表明两个载体均能在M.neoaurum JC-12表达GFP,但tac启动子的效果比pACE强。酶活测定结果为重组菌M.neoaurum JC-12/pMTac-ksdd破碎细胞上清液中KSDD酶活比原始菌提高了6.53倍,比M.neoaurum JC-12/pMF41-ksdd提高了4.36倍。摇瓶发酵显示重组菌M.neoaurum JC-12/pMTac-ksdd ADD的产量比原始菌提高了22.2%,由4.86 g/L提高到5.94 g/L,而AD的产量由0.92 g/L减少到0.17 g/L,降低了81.5%;与M.neoaurum JC-12/p MF41-ksdd比,ADD产量提高了12.7%,AD降低了71.2%。以20 g/L植物甾醇为底物,5 L发酵罐中重组菌M.neoaurum JC-12/pMTac-ksdd的ADD产量达到10.28 g/L。结果表明,构建的新型表达载体pMTac适用于在M.neoaurum JC-12中加强表达关键酶KSDD,而且在M.neoaurum JC-12中过量表达KSDD有助于ADD产量的提高,为目前报道的发酵法利用新金色分枝杆菌降解植物甾醇合成ADD的最高水平。