利用S-层蛋白在苏云金芽胞杆菌细胞表面展示多聚组氨酸肽（简报）

S层(Slayer)是由单一的蛋白或糖蛋白组成的薄层晶状结构,它广泛存在于古细菌和真细菌细胞的最外表面,可包裹整个细胞。S层在结构化学、形态学、遗传学以及物理化学等方面具有独特的性质,使之在生物技术、分子纳米技术和仿生学等领域蕴藏着广泛的应用潜力。近年来,随着微生物表     

利用S-层蛋白在苏云金芽胞杆菌细胞表面展示多聚组氨酸肽

S-层(S-layer)是由单一的蛋白或糖蛋白组成的薄层晶状结构,它广泛存在于古细菌和真细菌细胞的最外表面,可包裹整个细胞。S-层在结构化学、形态学、遗传学以及物理化学等方面具有独特的性质,使之在生物技术、分子纳米技术和仿生学等领域蕴藏着广泛的应用潜力。近年来,随着微生物表面展示技术的兴起和展示系统的逐渐成熟,继外膜蛋白、附屑结构蛋白、粘附蛋白以及凝集素等表面蛋白之后,S-层蛋白被作为一种新的表面展示载体成功的在细胞表面展示了一些外源大分子。多聚组氨酸肽是由若干个单位的六聚组氨酸串联而成的短肽。六聚组氨酸能够有效的吸附镍、镉等重金     

利用苏云金芽胞杆菌细胞表面展示系统表达禽流感病毒NP蛋白

首次利用苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)S-层蛋白CTC表面展示系统研究在Bt细胞表面展示禽流感病毒NP蛋白的可行性和最佳方案,为研制能常温长期保藏和运输的禽用口服疫苗奠定基础。用全长np基因或部分np基因(npp)代替S-层蛋白ctc基因的3′-端或中部,构建了4个重组质粒pSNP(含ctc-np)、pCSA-SNP(csa-ctc-np)、pCTC-NPP(ctc-npp)和pCSNPP(csa-ctc-npp)。将重组质粒分别电转化入Bt受体菌株BMB171中,获得了5个重组菌株BN、BCN、C-S、BCCN和CN。用5个重组菌株的营养细胞做玻片凝集试验,结果显示5个重组菌株均成功地在细胞表面展示了NP蛋白。用5个重组菌株的营养细胞免疫小鼠,ELISA测定血清抗体效价,结果显示5个重组菌株均具有免疫原性,其中重组菌株CN的免疫原性最高,其含融合基因csa-ctc-npp,证明该种融合基因的构建方式最佳。这为利用S-层蛋白CTC表面展示系统构建展示其它禽类病原体抗原的重组菌株以研制禽用热稳定性口服疫苗奠定了基础。     

类似S-层蛋白的苏云金芽胞杆菌伴胞晶体蛋白基因的克隆

芽胞杆菌CTC菌株被鉴定为苏云金芽胞杆菌 ,鞭毛血清型H2 ,幕虫亚种 ;产生卵圆形伴胞晶体 ,伴胞晶体蛋白为 1 0 0kD ;测定了该蛋白的N 末端序列 ,该序列与炭疽芽胞杆菌的细胞表面S 层蛋白具 92 %～ 93%相似性 ;根据Southern杂交制作了该晶体蛋白基因ctc所在位置的限制性酶切图谱 ,分别克隆了该基因 5′和 3′端所在的 2 9kbXbaI片段和 3 1kbClaIDNA片段 ,彼此间具 0 6kb重叠 ,通过拼接获得含完整ctc基因的克隆。含该基因的大肠杆菌与表达S 层蛋白的大肠杆菌具相似生长特征。初步表明CTC菌株的伴胞晶体由细胞表面S 层蛋白组成。苏云金芽胞杆菌区别于蜡状芽胞杆菌和炭疽芽胞杆菌的唯一标准是能形成伴胞晶体 ,由于S 层是细胞表面的结构成分 ,本文对CTC菌株鉴定为苏云金芽胞杆菌以及伴胞晶体作为苏云金芽胞杆菌鉴别的唯一标准提出了质疑     

苏云金芽胞杆菌S-层蛋白基因的异源表达及分离纯化

S-层(S-layer)普遍存在于古菌、G~+、G~-菌中,由S-层蛋白所构成细菌S-层结构的生物体中,其功能引起了科学家的广泛关注,但目前S-层的功能大都处于推测阶段。究其原因,是因为外源S-层基因可以造成宿主大肠杆菌的致死效应。本研究将一株苏云金芽胞杆菌的两个S-层蛋白基因(GenBank登录号为AJ012290和AY460125)的3’端序列在大肠杆菌BL21(DE3)中成功进行异源表达,在0.8mmol/LIPTG诱导培养6h时,菌体中包涵体表达量达到最高;并对表达蛋白进行了初步分离纯化,以期为后期利用该纯化蛋白进行抗血清制备,进而对该菌的S-层蛋白在宿主菌中的定位、功能分析打下基础。     

类似S-层蛋白的苏云金芽胞杆菌伴胞晶体蛋白基因的克隆

芽胞杆菌CTC菌被鉴定为苏云金芽胞杆菌,鞭毛血清型H2,幕虫亚种;产生卵圆形伴胞晶体,伴胞晶体蛋白为100kD;测定了该蛋白 N－末端序列,该序列与炭疽芽胞杆菌的细胞表面S－层蛋白具92－93％相似性,根据Southern杂交制作了该晶体蛋白基因ctc所在位置的限制性酶切图谱,分别克隆了该基因5’和3’端所在2．9kb XbaI片段和3．1kb Cla I DNA片段,彼此间具0．6kb重叠,通过拼接获得含完整ctc基因的克隆,含该基因的大肠杆菌与表达S－层蛋白的大肠杆菌具相似生长特征,初步表明CTC菌株的伴胞晶体由细胞表面S－层蛋白组成,苏云金芽胞杆菌区别于蜡状芽胞杆菌和炭疽芽胞杆菌的唯一标准是能形成伴胞晶体,由于S－层是细胞表面的结构成分,本文对CTC菌株鉴定为苏云金芽胞杆菌以及伴胞晶体作为苏云金芽胞杆菌鉴别的唯一标准提出了质疑。     

细菌脂肪酶在大肠杆菌细胞表面的功能性展示

细胞表面展示技术已广泛应用于突变文库的高通量筛选,有力地促进了蛋白质工程的发展。以来自于铜绿假单胞菌的自转运蛋白Est A的羧基端结构域作为锚定区,构建脂肪酶LipA与EstA羧基端结构域的融合基因,并将融合基因插入到改造后的pACYC-Duet表达载体中,获得表面展示载体pBCCB-X1。将载体pBCCB-X1分别导入到大肠杆菌JK321和大肠杆菌UT5600菌株中,以IPTG诱导融合基因的表达。分别用三丁酸甘油酯定性检测和pNPO定量检测诱导表达后的全细胞脂肪酶的水解活性。试验结果表明,脂肪酶LipA在大肠杆菌JK321和大肠杆菌UT5600细胞表面均得到功能性展示,水解活性分别为(2.8±0.1)U/OD和(2.6±0.06)U/OD。脂肪酶LipA在大肠杆菌细胞表面的功能性展示,为后续高通量筛选LipA突变基因文库,奠定了坚实的基础。     

以CotX为分子载体在枯草芽胞杆菌芽胞表面展示绿色荧光蛋白

芽胞衣壳蛋白CotB、CotC、CotG等可作为芽胞表面展示外源蛋白的分子载体,制备口服重组疫苗或具有催化活性的重组酶。CotX为枯草芽胞杆菌Bacillussubtilis芽胞衣壳中的另一种结构蛋白。为证明CotX能否作为分子载体将外源蛋白展示在芽胞表面,本研究将cotX基因与绿色荧光蛋白基因gfp的编码序列进行基因重组,构建融合表达CotX-GFP的整合型重组质粒,将该质粒转化枯草芽胞杆菌,筛选重组菌株并诱导产生芽胞,观察到重组芽胞表面具有GFP绿色荧光。结果表明枯草芽胞杆菌的芽胞衣壳蛋白CotX位于芽胞衣壳外层,可作为芽胞表面展示外源蛋白的载体分子。     

枯草芽胞杆菌孢子表面展示外源蛋白的研究

枯草芽胞杆菌孢子表面展示技术是最近十几年新兴的一种外源蛋白固定方法,已在酶学、疫苗学、靶向药物制备、金属污染治理等领域获得了广泛应用。以孢子衣壳蛋白为载体蛋白,已经成功地把许多抗原、酶和其他蛋白展示在孢子外表面。枯草芽胞杆菌孢子衣壳由多种衣壳蛋白组成,但可用做载体蛋白的并不多,且它们的特性不同。综合介绍了枯草芽胞杆菌孢子表面展示外源蛋白这种新型技术的具体机理,及其在国内外各领域应用的研究进展。     

苏云金芽胞杆菌CTC菌株的S-层蛋白可以形成伴胞晶体

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)CTC菌株产生卵圆形伴胞晶体,晶体蛋白分子量为100kD;透射电子显微镜观察结果表明该菌株有S—层结构,而且在母细胞内可以形成伴胞晶体和S—层的初体结构;其蛋白基因导入苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMB171后,扫描电子显微镜观察结果表明转化子能形成晶体,而其形状与CTC菌株的相同;转化子晶体蛋白的分子量大小也与CTC菌株的相同,为100kD。以上实验结果结合以前晶体蛋白N—末端测序和基因核苦酸序列,表明苏云金芽胞杆菌CTC菌株的S—层蛋白可以形成伴胞晶体。     

苏云金芽胞杆菌CTC菌株的S-层蛋白可以形成伴胞晶体

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)CTC菌株产生卵圆形伴胞晶体,晶体蛋白分子量为100kD;透射电子显微镜观察结果表明该菌株有S层结构,而且在母细胞内可以形成伴胞晶体和S层的初体结构;其蛋白基因导入苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMB171后,扫描电子显微镜观察结果表明转化子能形成晶体,而其形状与CTC菌株的相同;转化子晶体蛋白的分子量大小也与CTC菌株的相同,为100kD。以上实验结果结合以前晶体蛋白N末端测序和基因核苷酸序列,表明苏云金芽胞杆菌CTC菌株的S层蛋白可以形成伴胞晶体。     

炭疽芽胞杆菌假想S-层蛋白SLP缺失突变体的构建

目的：构建炭疽芽胞杆菌假想S-层蛋白SLP缺失突变体,以进行后续SLP的功能研究,为炭疽芽孢杆菌重要基因功能的研究建立技术平台。方法：利用PCR技术,分别扩增得到目的基因的上游同源臂（slp-F）和下游同源臂（slp-R）,将抗性基因（S）和上、下游同源臂先后连入穿梭质粒pKSV7,构建打靶载体pKSV7-FSR,经去甲基化后,电转化入炭疽芽胞杆菌A16R,通过同源重组敲除slp基因,并通过DNA测序和Western blot实验验证;对野生株和突变株37℃时的生长曲线及生化反应进行比较研究。结果：分别从DNA水平和蛋白质水平证实slp基因被成功敲除;突变株对数期生长较快,衰退较慢,与野生株的生化反应差异不明显。结论：获得了炭疽芽胞杆菌假想S-层蛋白SLP缺失突变体。     

乳杆菌表面蛋白的研究进展

本文综述了乳杆菌表面蛋白的分布以及近年来表面蛋白的功能和分子生物学方面的研究进展.     

枯草芽胞杆菌芽胞表面展示研究进展

枯草芽胞杆菌芽胞表面展示技术是把枯草芽胞杆菌作为芽胞表面展示的宿主来展示目的蛋白的一种技术。该技术不仅具备芽胞表面展示技术可展示分子量较大的目的蛋白、目的蛋白无需跨膜及芽胞的极强抗逆性等特点外,同时由于该技术的宿主菌--枯草芽胞杆菌的分子生物学信息研究得比较清楚、安全性高而被广泛应用。介绍了枯草芽胞杆菌表面展示近10年在生产疫苗和固定化酶方面的进展,并对如何提高表面展示目的蛋白的产量做了简要概述。     

细菌运载蛋白及在表面展示技术中的应用进展

细菌细胞表面展示技术是一项新的蛋白质应用技术,其体系由运载蛋白、靶蛋白和宿主菌三者构成,一般可将其分为革兰阴性菌展示体系和革兰阳性菌展示体系两大类。目前已证实多种具有锚定活性的运载蛋白,并用于不同靶蛋白的细胞表面展示体系。该技术现已被应用于活体重组疫苗的开发、蛋白质文库构建与筛选、生物传感器、全细胞生物催化剂、全细胞生物吸附与降解等多个研发领域。     

细菌表面S-层的结构及其功能和应用前景

细菌的细胞外壁一般由细胞壁和细胞膜组成,除此之外,在许多古细菌和真细菌中还有一层表面结构,称为表面层(Surface layers)或称为S-层(S-layers),它们是由蛋白质组成的晶格状结构,位于细胞壁或细胞膜外层,是生物进化过程中最简单的一种生物膜[1,2].     

嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶基因在大肠杆菌中的克隆和表达

以质粒pATl53为载体,应用鸟枪法在大肠杆菌中建立了嗜热脂肪芽孢杆菌α－淀粉酶基因无性繁殖系。两个含α一淀粉酶基因的克隆的Hind Ⅲ片段均为4．5kb,内切酶谱也相同。本文还比较了从HBl01,p^a－1823和从基因供体菌中提取的α－淀粉酶的耐热性。     

S-层蛋白质的功能和应用

400多种古细菌和细菌有S-层蛋白质,该蛋白质能在菌体表面自装配为规则晶格的单分子表面层(S-层),与菌体以非共价方式连接。S-层作为菌体面对环境的最外层屏障,具有保护、分子筛、维持菌体形状、细胞识别和黏附、毒力因子等功能,是菌体适应周围环境的重要结构。随着遗传、结构、装配和功能等方面研究的逐渐深入,人们意识到了S-层蛋白质潜在的应用价值。其基因的可操作性,独特的自装配特性及其单分子晶体层的结构都很有应用前景,目前已经应用在异源蛋白质的分泌性表达、表面展示和纳米科技等方面。     

高温α-淀粉酶高表达的研究

为了进一步提高工业上重要的地衣芽胞杆菌高温α-淀粉酶(BLA)的发酵生产性能,以高温α-淀粉酶基因(amyL)为目的基因,构建地衣芽胞杆菌高温α-淀粉酶基因产生菌的整合表达通用性质粒pB li16 s-amyL-EryR,采用原生质体转化法将此整合型表达质粒导入B.licheniformis CBBD302,在整合表达质粒中的16SrDNA序列的介导下实现了同源整合。挑选20株阳性转化子,分别通过提高培养基中红霉素的使用浓度,增加染色体上目的基因amyL的拷贝数,由此获得的重组菌的BLA生产水平提高了56.37%~80.29%。     

嗜酸乳杆菌S-层蛋白联合抗生素对Escherichia coli和Staphylococcus aureus的抑制作用研究

旨在检测嗜酸乳杆菌S-层蛋白以及S-层蛋白与抗生素联用对大肠杆菌(Escherichia coli)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的抑制作用。采用液体发酵培养法获得嗜酸乳杆菌菌体,LiCl法提取S-层蛋白粗提物,凝胶过滤层析法纯化S-层蛋白,分别用E.coli和S.aureus处理Caco-2细胞2 h后,考察S-层蛋白在不同浓度和不同作用时间条件下对E.coli和S.aureus的抑制作用,并考察S-层蛋白联合抗生素对E.coli和S.aureus的抑制作用,实验分组:(1)空白对照;(2)嗜酸乳杆菌组;(3)S-层蛋白组;(4)抗生素组;(5)嗜酸乳杆菌+抗生素组;(6)S-层蛋白+抗生素组。结果显示,液体发酵得到嗜酸乳杆菌菌体,提取并纯化得到S-层蛋白;S-层蛋白对E.coli和S.aureus有很好的抑制效果,具有浓度依赖性,高浓度下抑制率达到42.2%和31.7%,差异极显著(P<0.01),且在E.coli和S.aureus作用的短时间内干预效果明显,0 h时的抑制率分别达到59.3%和48.4%;S-层蛋白联合抗生素的抑菌率分别达到81.7%和79.3%,差异极显著(P<0.01),效果优于单独使用抗生素。嗜酸乳杆菌S-层蛋白具有较强的抑菌作用,可以与抗生素联用,有望开发称为一种新型的抗菌药物。