新型抗肿瘤转移多肽-三聚β肽(β３)在大肠杆菌中的表达及其抗粘附作用

自行设计了抗肿瘤转移多肽－三聚β肽（β3）,人工合成了β3的基因片段,构建了β3的表达质粒pET-His-β3,在大肠杆菌BL21(DE3)plysS中表达。在用IPTG诱导15h后可见明显的His-β3融合蛋白的表达,表达产物约占细胞总蛋白的4％,占细胞总不溶性蛋白的10％。每升pET-His-β3/BL21(DE3)plysS细菌培养液用金属螯合琼脂糖凝胶6B FF分离后可回收纯度为92.2%的β3产物约20mg。所表达出的β3肽对人肝癌细胞株SMMC-7721细胞及人肝癌高转移细胞株HCCLM6细胞与纤连蛋白（fibronectin, FN）粘附具有特异的抑制作用,呈现剂量效应相关关系和时间效应相关关系,抑制作用强于β肽（β1）、3倍浓度的β1（3×β1）和GRGDS。研究结果表明：pET-His-β3/BL21(DE3)plysS是β3适合的表达系统;表达的β3肽具有特异的抗肿瘤细胞粘附作用。     

青霉素G酰化酶操纵子的负调控因子的研究

青霉素G酰化酶(PA)操纵子的调节基因(pacR)存在于青霉素G酰化酶结构基因(pac)内部Dral-Taql一段约500bp的DNA片段内,此片段内含有2个ORF。2个ORF及其突变体分别克隆到pUC18得到一系列重组质粒,用这些重组质粒转化青霉素G酰化酶产生菌E.coliD816,测定克隆片段对PA表达的影响。如果克隆片段含有具功能的pacR,诱导剂苯乙酸(PAA)不能使由高拷贝却pacR表达的阻抑物全部失活,部分阻抑物结合pac操纵基因,阻碍RNA聚合酶对pac的转录,因此PA的表达量降低。结果表明,阻抑物是由pac结构基因内部的ORF2编码的蛋白因子,pacR即ORF2。RNA—DNA杂交实验证实了pacR在转录水平阻抑pac的表达。     

前列腺素E_2、F_(2α)对大鼠颗粒细胞PA活力的影响

年龄26—27天的Wistar雌鼠用PMSG与HCG诱导成熟,同时分别注射3、6、9 mg消炎痛,分离卵巢颗粒细胞并离体培养,培液中的PA活力经~(125)Ⅰ-纤维蛋白降解法检测,均无被抑制现象(图1)。仅用PMSG激动大鼠的颗粒细胞离体培养于含HCG及不同浓度(10~(-8)mol/L—10~(-5)mol/L)的消炎痛培液内,各组PA活力均未出现明显变化(图2)。离体条件下PGE_2增强PMSG激动大鼠颗粒细胞PA活力的事实说明,消炎痛抑制实验未能显示前列腺素与PA的关系,可能因所用以诱导大鼠临近排卵的PMSG和HCG分别所含FSH与LH的高活力促使PA活力达到最高点,以致前列腺素对PA的影响被掩盖;PGF_(2α)对PA未显示任何作用(图4)。另外,PGE_2使仅接受PMSG大鼠颗粒细胞PA升高的事实(图3)提示,PGE_2有摹拟LH的作用;未经PMSG与HCG处理鼠的卵泡细胞的PA活力也受PGE_2的影响,说明它还有摹拟FSH的作用。     

麦蚜虫霉流行病的初始侵染源及传播途径观察

在河南省原阳县麦区于2002年4~5月期间自空中诱捕到迁飞性有翅麦蚜共1092头, 其中麦长管蚜(Sitobion avenae)415头, 禾谷缢管蚜(Rhopalosiphum padi)642头, 麦无网长管蚜(Metopolophium dirhodum)22头, 麦二叉蚜(Schizaphis graminum)13头. 每日诱获的有翅蚜带回室内在试管麦苗上单头饲养7 d, 共发病死亡341头(麦长管蚜224头, 禾谷缢管蚜106头, 麦二叉蚜3头, 麦无网长管蚜8头), 全部在饲养的前5天死亡, 其中前3天的死亡占78.9%, 有翅蚜的总带菌率为31.2%. 病死有翅蚜经逐头镜检确认病因, 全系虫霉感染所致, 其中新蚜虫疠霉(Pandora neoaphidis)占84.6%, 普朗肯虫霉(Entomophthora planchoniana)占5.5%, 暗孢耳霉(Conidiobolus obscurus)占9.9%, 另有4例为新蚜虫疠霉和暗孢耳霉的复合感染. 基于迁飞性有翅麦蚜高比例带菌和田间麦蚜虫霉流行病的调查资料, 可以认为麦蚜的虫霉流行病可能主要借有翅蚜的迁飞定殖而异地传播, 并讨论了这种传播方式对蚜虫流行病研究与利用的启示.     

促乳素抑制促性腺激素诱导小鼠卵巢的纤蛋白溶酶原激活因子增加和排卵

为进一步研究纤溶酶原激活因子(PA)在排卵中的作用,我们观察了促乳素(PRL)对hCG诱导小鼠卵巢PA增加和排卵的影响。实验结果表明;(1)PRL抑制促性腺激素诱导小鼠排卵。当bCG注射18 h后,在输卵管中发现卵子平均为31.1±6.7,而hCG加PRL组为19.7±4.9;当hCG注射24 h后,输卵管中发现卵子数为32.3±10.8,hCG加PRL组为20.3±5.4;其抑制率分别为36.5％和37％;(2)PRL对排卵的抑制作用是通过抑制促性腺激素对小鼠颗粒细胞(GC)和膜-间质细胞(TIC)PA分泌的结果;(3)在离体实验中PRL也明显抑制促性腺激素对小鼠GC PA分泌的作用。这些结果进一步证实PA在排卵过程中的重要作用。     

炭疽毒素受体与人IgG1的Fc段融合蛋白ATR_Fc在CHO细胞中的表达

ATR-Fc是人炭疽毒素受体（ATR）的胞外区与人免疫球蛋白IgG1的铰链区、CH2区和CH3区组成的融合蛋白。表达该蛋白是为了获得结合PA的抗体样分子,通过阻断PA与细胞受体的结合,而阻止炭疽致死毒素和水肿因子进入细胞内,可作为预防和治疗炭疽感染的生物制品。将编码炭疽毒素受体N端1-227氨基酸的基因和编码Fc段的基因连接,插入到pcDNA3-1的HindⅢ和NotⅠ位点得到表达ATR-Fc融合蛋白的真核表达载体pcDNA31/ATR9Fc,并用脂质体方法将该载体转染至CHO-K1细胞中,用G418筛选并获得ATR-Fc表达水平为10～15μg/(106cells·d)的基因工程CHO细胞系ATR-Fc-1D5。采用蛋白A纯化重组蛋白,并用ELISA法鉴定ATR-Fc与PA的亲和性,表明ATR-Fc可与PA特异性结合。     

丝裂原活化蛋白激酶介导脱乙酰几丁质诱导的人参细胞氧迸发与皂苷合成

脱乙酰几丁质(chitosan, CHN)可以特异性诱导人参细胞42与39 kD蛋白激酶活性, 丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)途径的抑制剂PD98059可以抑制CHN的这种诱导. 利用MAPK抗体进行免疫沉淀试验与体外激酶分析也表明CHN诱导的42 kD与39 kD蛋白为一类MAPK. PD98059还可以抑制CHN诱导的鲨烯合成酶与鲨烯环氧酶基因(gss与gse)的转录、β-香树素合成酶(β-amyrin synthase, β-AS)的累积与人参皂苷的合成. 这些结果表明, CHN诱导的MAPK对于促进人参皂苷的合成是必需的. EGTA与LaCl3可以抑制CHN诱导的42与39 kD MAPK活性, 钌红(ruthenium red, RR)可以抑制CHN诱导的39 kD MAPK活性, 而且它们又都能抑制人参皂苷的合成, 说明胞内钙离子浓度的升高对于诱导MAPK活性与人参皂苷的合成是必需的. PD98059可以抑制CHN诱导的氧迸发(包括质膜NADPH氧化酶活性与H₂O₂的产生), 但是二碘基苯(diphenylene iodonium, DPI)、二甲基硫脲(dimethylthiourea, DMTU)与2, 5-二羟基肉桂酸甲酯(2, 5-dihydroxycinnamic acid methyl ester, DHC)却不能抑制CHN诱导的MAPK活 性, 表明CHN诱导的MAPK活性可能作用于人参细胞氧迸发的上游.     

抑制c-sis/PDGF-B原癌基因表达的TFO设计、体外三链形成及功能的检测

血小板衍生生长因子(PDGF)在肿瘤发生、生长,动脉粥样硬化和炎症反应等病理状态中起着极其重要的作用,其B链基因为原癌基因c-sis的同源物.提供了用于抑制c-sis/PDGF-B原癌基因表达的3种TFO(三链形成寡聚脱氧核苷酸triplex-forming oligonucleotide).凝胶阻滞电泳、DNaseⅠ印迹、体外转录抑制及核蛋白结合抑制等实验证明了这些化合物可与靶位点(c-sis/PDGF-B基因5′上游启动子核心区)形成稳定的三链复合物,并可抑制其下游基因的转录和转录因子的结合.它们有望应用于配制治疗肿瘤发生、生长,动脉粥样硬化和炎症反应等有关疾病的药物.     

水飞蓟宾通过抑制Notch1信号通路发挥抗食管癌EC109细胞的作用

目的:探讨水飞蓟宾(silybin,SIL)对人食管癌EC109细胞系的作用,并探求Notch1以及凋亡通路在其中的角色。方法:实验分为对照组和SIL处理组(75、150、300μM),各组细胞分别处理12、24、36小时。Cell Counting Kit-8(CCK-8)测细胞活力;粘附实验测细胞粘附能力;Caspase-Glo誖3/7定量试剂盒测细胞Caspase3/7的表达;Western-blot测Notch1、Bcl2和Bax蛋白表达。结果:CCK-8检测结果示SIL可有效抑制EC109细胞的活力(P0.01),并呈浓度时间依赖性;粘附实验结果示SIL可以降低EC109细胞粘附能力(P0.01);Caspase3/7检测结果示SIL可以使EC109细胞Caspase3/7活性升高(P0.01);Western-blot检测结果显示SIL可以使EC109细胞Notch1和Bcl2表达下降,Bax表达上升(P0.01)。结论:SIL可有效抑制食管癌EC109细胞活力,其作用机制可能与抑制Notch1通路,激活凋亡通路相关,SIL可能是食管癌药物治疗领域具有开发前景的药物。     

铜绿假单胞菌PA16株粘附性、菌毛与质粒关系的研究

为探讨PA的质粒与粘附性及质粒与菌毛的关系,围绕PA16株的耐药性与质粒的关系、质粒与菌毛及粘附性的关系作了一系列的研究,结果表明PA16对所测的7种抗生素全部耐药,其MIC＞400 mg/L;PA16仅含有一种27.3 kb(18 Mu)的质粒.转化后此质粒也使JM109获得了对四环素的耐药性.消除此质粒后,PA16对四环素的耐药性消失.粘附试验证明PA16质粒消除株对尿道上皮细胞的粘附能力较野生株显著性减小(P＜0.05),同时,透射电镜照片显示PA16野生株表面有致密、纤细刚直的菌毛,而PA16质粒消除株表面几乎无菌毛可见.     

野生型铜绿假单胞菌和新型mucA突变铜绿假单胞菌生物膜形成的动态观察

目的观察新型mucA突变的粘液型菌株PA17和野生型菌株PAO1生物膜(biofilm,BF)形成的动态过程,并比较2株菌生物膜形成过程的差异。方法 SYTO9/PI荧光探针标记PAO1和PA17,体外建立1d,3d,5d,9d时间点PAO1及PA17的BF模型,激光共聚焦显微镜(CLSM)观察两株菌BF动态形成的过程。结果通过SYTO9/PI双染可以动态观察PAO1菌株和PA17菌株的BF形成过程;PAO1菌株和PA17菌株的BF形成过程有差异:PAO1菌株1d时已形成微菌落,3d时形成覆盖整个玻片的生物膜结构,而PA17菌株1d时仅有散在的不可逆粘附细菌,3d时才形成微菌落,5d时形成生物膜结构;随着时间的推移,2株菌生物膜形成的厚度均逐渐增加,且死菌的比例也逐渐增加。结论 PAO1和PA17BF的动态形成过程存在差异,而PA17与PAO1生物膜形成存在的差异可能与其mucA基因突变造成大量藻酸盐的产生有关。     

嗜水气单胞菌合成含3-羟基戊酸单体的聚羟基脂肪酸共聚酯的研究

分别利用葡萄糖或葡萄糖酸钠与十一碳酸、月桂酸与十一碳酸为混合碳源进行嗜水气单孢菌 (Aeromonashydrophila)菌株 4AK4的摇瓶培养 ,实现了含有 3 羟基戊酸 (3HV)单体的聚羟基脂肪酸酯的微生物合成。当使用葡萄糖或葡萄糖酸钠与十一碳酸为混合碳源时 ,野生型A .hydrophila 4AK4及含有 3 羟基丁酸辅酶A合成基因phaA和phaB的重组A .hydrophila 4AK4 (pTG01)能够合成-3-羟基丁酸(3HB)与-3HV的共聚物 ,且葡萄糖或葡萄糖酸钠与十一碳酸比例为 1∶1时最利于细胞生长和PHA的积累。当使用月桂酸和十一碳酸为混合碳源时 ,A .hydrophila4AK4能够合成-3HB、3HV与 β-羟基己酸 (3HHx)的共聚物 ,且随着混合碳源中十一碳酸的含量增加 ,A .hydrophila4AK4合成的PHA中-3HV的比例增加 ,而-3HB和-3HHx的比例降低.     

卵巢纤蛋白溶酶原激活因子及其抑制因子的研究

本文综述了近年来作者在研究卵巢纤蛋白溶酶原激活因子(PA)及其抑制因子(PAI)的某些成果。PA是一种高效能蛋白水解酶激活因子,它激活纤蛋白溶酶原成为纤蛋白溶酶,此酶在纤蛋白水解过程中起重要作用。已有证据表明,PA与排卵有关。我们进一步研究发现:(1)在大鼠卵巢体细胞中存在两种PA,即组织型PA(tPA)和尿激酶型PA(uPA);而在卵细胞中只发现tPA;(2)大鼠卵巢tPA明显受促性腺激素和其他激素调节,并在排卵前达到高峰,而uPA没有明显变化;(3)在卵巢体细胞中还发现一种PA的抑制因子(PAI),它与PA结合形成复合体,能部分或完全消除PA活性;(4)只有tPA与大鼠排卵有关;PA和PAI间的相互作用和随激素的波动而引起的动态变化可能对维持卵巢正常生理功能和排卵起重要作用。     

人内皮抑素在毕赤酵母中的表达、纯化与生物功能研究

内皮抑素（Endostatin）是近年来新发现的一种内源性新生血管生成（Angiogenesis）抑制因子,通过抑制新血管生成而抑制肿瘤的形成和转移且不会引起耐药性,具有极高的临床应用前景。巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris)具有表达率高、产物可分泌、可对高等真核生物蛋白正确进行翻译后加工、遗传稳定、发酵工艺成熟等优点被用来进行重组人Endostatin的表达。本研究用PCR的方法从人胎肝cDNA文库中扩增出人Endostatin的cDNA,测序正确后转入毕赤巴斯德甲醇酵母,并获得了高效可溶型表达,用肝素亲和层析的方法进行纯化,纯化后产物经SDSPAGE薄层扫描分析纯度达987％以上,质谱测定分子量为2043kD与理论值一致,蛋白质N端序列测定结果为SPPAHTHRDFQPVLH与天然序列一致。生物活性检测证明可抑制鸡胚尿囊绒毛膜（CAM）的新生血管生成（Angiogenesis),并可抑制血管内皮细胞的增殖。因此用酵母表达系统可以得到具有生物活性的内皮抑素,经纯化后可用于进一步的生物功能和作用机理试验。     

尖镰孢青霉素V酰化酶的纯化及性质

通过硫酸铵沉淀、硅藻土吸附、DEAD-纤维素离子交换层析和Sephadex G-200凝胶过滤,由尖镰孢(Fusarium oxysporum)FP941培养滤液中得到了聚丙烯酰胺凝胶电泳均一的青霉素V酰化酶。酶作用最适pH为7.0,最适温度为50℃。酶在pH6.0—8.0和42℃以下稳定。酶作用青霉素V的米氏常数Km为4.65×10~(-3)mol/L;苯氧乙酸是酶的竞争性抑制剂,抑制常数Ki为23.87×10~(-3)mol/L;6-氨基青霉烷酸是酶的非竞争性抑制剂,抑制常数Ki为30.01×10~(-3)mol/L。某些金属离子对酶有抑制作用,Fe~(2+)最强,其次是Hg~(2+)和Cu~(2+)。用SDS凝胶电泳测定酶亚基分子量为77600;用分子筛测定自然酶分子量为148000。     

一氧化氮对增强的UV_B胁迫下螺旋藻生物损伤的减缓作用

为了探讨一氧化氮对增强的UV_B胁迫下螺旋藻生物学特性的影响,通过色素含量、蛋白质含量和生物量3个方面的变化证实了05mmol/L的一氧化氮(Nitric oxide, NO)供体硝普钠(Sodium nitroprusside, SNP)对增强UV_B胁迫下的螺旋藻(Spirulina platensis)794细胞生物损伤有明显的减缓作用。实验结果显示,NO能够显著诱导增强的UV_B胁迫下螺旋藻细胞内蛋白质含量、脯氨酸含量的提高,促进正常生长条件下螺旋藻(Spirulina platensis)794细胞内抗氧化物质GSH含量的增多,但外源NO又可以降低增强UV_B胁迫下螺旋藻细胞中GSH含量的增加。说明NO对增强UV_B胁迫下的螺旋藻794细胞有保护作用,可以减轻UV_B胁迫对螺旋藻(S. platensis)细胞引起的生物损伤。首次研究报道了增强UV_B胁迫下NO信号分子对蓝细菌——螺旋藻细胞生物损伤调节能力的影响,为进一步探讨NO信号及其与其它信号分子之间相互作用、相互关联来调节细胞的生理生化过程,以减缓UV_B胁迫下的生物损伤机理奠定了基础。     

ω-3 多不饱和脂肪酸对PTSD-SPS 大鼠行为学影响的研究

目的:观察饲料中添加ω-3PUFAs对PTSD-SPS大鼠焦虑/抑郁行为的防护作用。方法:将40只健康成年雄性SD大鼠随机分为正常对照组、PTSD-SPS模型组、60%ω-3PUFAs+PTSD-SPS模型组1、60%ω-3PUFAs+PTSD-SPS模型组2。采用高架十字迷宫实验和旷场实验评价实验组大鼠的焦虑/抑郁行为变化。结果:与对照组相比,SPS模型组大鼠进入开放臂的次数比例和时间比例明显减少;中央格停留时间明显缩短(5.56±0.21)s,穿格次数明显减少(30.23±5.96)次,差异均显著(P<0.05)。与SPS模型组相比,60%ω-3PUFAs的SPS组大鼠进入开放臂的次数比例和时间比例明显增加;中央格停留时间明显延长(9.88±1.14)s,穿格次数明显增加(43.22±4.35)次,差异均显著(P<0.05);与对照组相比没有显著差异。结论:膳食补充ω-3多不饱和脂肪酸可以降低PTSD-SPS大鼠焦虑/抑郁程度。     

大肠杆菌-链霉菌高效接合载体的构建及其应用

以链霉菌质粒SCP2 的衍生质粒pHJL400为基础 ,构建了能够在大肠杆菌到链霉菌之间进行高效接合转移的质粒pGH112。pGH112含有在大肠杆菌和链霉菌中复制起始位点 ,以及分别在大肠杆菌和链霉菌中进行筛选的抗性标记。用pGH112转化EscherichiacoliET12567(pUZ8002 )后 ,与天蓝链霉菌 (StreptomycescoelicolorA3(2 ) )、除虫链霉菌 (Streptomycesavermitilis)、变铅青链霉菌 (StreptomyceslividansTK54 )、毒三素链霉菌 (StreptomycestoxytriciniNRRL15443)、委内瑞拉链霉菌 (Streptomyces.venezuelaeISP5230 )和红色糖多孢菌 (Saccharopolyporaerythraea)进行接合 ,发现本文构建的pGH112与pKC1139相比 ,接合转移效率较高 ,稳定性好 ,而且宿主范围较广。把组成型启动子ermE 与绿色荧光蛋白基因 (gfp)克隆到本文构建的pGH112 ,通过接合转移到链霉菌中 ,gfp获得表达,证明其可以用作基因接合转移的有效工具载体,这为研究链霉菌的基因功能创造了有利条件上。     

L—精氨酸L—门冬氨酸盐对血小板功能的抑制

用血小板聚集、粘附、释放实验和出血时间测定观察L-精氨酸*L-门冬氨酸盐(DR)对血小板功能的作用。实验结果显示DR15mg/kg静脉给药,可明显抑制腺苷二磷酸(ADP)诱导的大鼠血小板聚集(P<0.01);15mg/kg单次口服给药可明显抑制ADP诱导的家兔血小板聚集;其药效可持续8h以上(P<0.01);DR7.5、15、30mg/kg灌胃给药(Bid×3.5d),可明显抑制ADP、胶原或凝血酶诱导的大鼠血小板聚集(P<0.01),并延长出血时间(P<0.05)。DR30mg/kg可明显抑制大鼠血小板粘附,并促进血管内皮释放前列环素(PGI2),但对活化的血小板释放血拴素(TXA2)无明显影响。本研究发现,DR可抑制血小板聚集和粘附功能,其作用机制不同于阿司匹林。这些作用部分是由于DR增加了血管内皮PGI2的释放。此结果为血小板功能的调节提供了新线索。     

黑曲霉An-76木聚糖酶系的酶学研究

用分子筛和离子交换等色谱分离技术,由黑曲霉An-76的木聚糖酶系中分离纯化到一种β-木糖苷酶(βx)和三种内切-β-木聚糖酶组分(EX1,EX 2,EX 3)。这几种酶均达到凝胶电泳纯和聚焦电泳纯。用凝胶过滤方法测得3X的分子量为147000,用凝胶电泳法测得EX1、EX2和EX3的分子量分别为2 3000、22000和41 000;βX、EX1、EX2和EX 3的等电点分别为4．6、5．9、4．1和3．9。本文还研究了各种酶的最适反应温度和PH、酶的热稳定性和pH稳定性;研究了金属离子和巯基试剂对酶活力的影响、动力学参数、氨基酸组成、底物持异性和反应产物等。各酶组份不具有分解纤维素的交叉活力。巯基试剂能完全抑制卢βX活力,其活力丧失可被半胱氨酸恢复。