嵌合抗原受体疗法在肿瘤免疫治疗中的研究进展

嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor, CAR)是通过基因工程技术构建的融合蛋白,经其修饰的免疫细胞可以特异性靶向和杀伤表达特定抗原的肿瘤细胞。到目前为止,大多数关于CAR的研究主要集中在T细胞上。CAR-T细胞疗法在治疗恶性血液疾病方面取得了突破性进展,目前已有7款药物获批上市,研究者在不断深入研究CAR-T细胞疗法的同时也开始寻找新的免疫效应细胞, CAR自然杀伤细胞(CAR natural killer cell, CAR-NK)疗法、CAR自然杀伤T细胞(CAR NK T cell,CAR-NKT)疗法以及CAR巨噬细胞(CAR macrophage, CAR-MP)疗法逐渐成为免疫治疗的新策略。尽管围绕CAR的研究策略不断增加,该领域也依然面临一些挑战,例如有效地靶向实体瘤、减少治疗时的毒副作用。该文对以CAR为基础修饰不同效应细胞的细胞疗法的研究进展进行了综述。     

组合型嵌合抗原受体的构建及分析鉴定

目的：构建靶向磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican-3,GPC3)的嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor, CAR)及靶向上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule, EPCAM)嵌合抗原共刺激受体(chimeric antigen costimulatory receptor, CCR)共修饰的T细胞,并对其进行体外活性评估。方法：将EPCAM-CCR和GPC3-CAR基因片段克隆入慢病毒载体质粒,酶切、PCR和测序鉴定CCR+CAR pCDH重组载体。分离、激活和扩增人T细胞,利用慢病毒感染并筛选能够稳定表达该组合型嵌合抗原受体人T细胞。通过Western blot、流式细胞术(flow cytometry, FCM)验证CCR+CAR T细胞中CCR+CAR的表达,ELISA检测细胞因子IL-2、INF-γ、IL-4的分泌。结果：成功构建CCR+CAR pCDH慢病毒重组载体。成功分离、激活并扩增人T细胞。CCR+CAR pCDH慢病毒成功感染人T细胞,RT-PCR、Western blot检测也显示其成功表...     

定点突变优化信号肽对嵌合抗原受体T细胞功能的影响

信号肽(signal peptide, SP)参与调节嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor, CAR)结构的分泌水平及跨膜易位过程,对嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T cell, CAR-T)行使功能至关重要,本研究通过定点突变技术优化SP序列,并研究其对CD19-CAR-T杀伤功能的影响。首先,利用基因合成和分子克隆技术,构建含野生型SP (SP-wtY)、2种突变型SP (SP-muK或SP-muR)的靶向CD19的CAR载体;对构建成功的载体进行慢病毒包装,并使用慢病毒侵染T细胞,利用流式细胞术检测细胞的转染效率,钙黄绿素释放法检测对靶细胞的体外杀瘤能力,酶联免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)技术检测2种细胞因子[干扰素-γ (interferon-γ, IFN-γ)和干扰素-α (interferon-α, TNF-α)]的分泌水平。结果显示,构建了野生型和信号肽突变的重组慢病毒质粒,慢病毒转导T细胞后,携带3种信号肽(SP-wtY、SP-muK或SP-muR)的CD19-CAR转染效率分别为33.9%、35.5%、36.8%。进一步杀伤实验显示,与SP-muK和SP-wtY细胞相比,SP-muR细胞的肿瘤杀伤效果显著提高,当效靶比为10:1时共培养24 h后,SP-muR组CAR-T细胞的细胞因子IFN-γ和TNF-α分泌水平显著高于SP-muK和SP-wtY组。本研究揭示信号肽N端正电荷数的增加可以提高CAR的表达效率和对CD19⁺靶细胞的杀伤作用,为CAR结构的优化改造和临床高效应用提供了科学依据。     

Regnase-1敲除对脐血来源CAR-T细胞的生物学功能影响

嵌合抗原受体T(chimeric antigen receptor-T, CAR-T)细胞治疗虽然在血液肿瘤治疗中疗效显著,但仍面临CAR-T细胞体内持续性短的问题,后者与疗效密切相关。Regnase-1具有核糖核酸酶作用,负向调控免疫应答。该研究在脐血T(cord blood T)细胞上成功敲除Regnase-1,制备Regnase-1缺陷的靶向CD19的脐血CAR-T细胞Regnase-1–CAR-T,发现敲除Regnase-1不影响脐血T细胞表达CAR分子,也不影响CAR-T细胞体外增殖和分化,在CAR-T体外生长早期可显著抑制CD39耗竭分子,并且显著增强CAR-T特异性持续杀伤能力和扩增能力,有助于改善脐血CAR-T细胞持续性,为CAR-T细胞药物的优化奠定基础。     

以CD27的胞外结构域为嵌合抗原受体构建靶向CD70的CAR-T细胞

该研究以CD27分子的胞外段的部分肽段为嵌合抗原受体构建靶向CD70的嵌合抗原受体T(chimeric antigen receptor T,CAR-T)细胞并在体外验证其功能。通过流式细胞术检测急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)细胞系的CD70靶抗原的表达情况,利用基因工程方法构建包含4-1BB共刺激因子的第二代Anti-CD70慢病毒表达载体,并制备相应慢病毒,感染激活的人CD3⁺T细胞,获得靶向CD70的第二代CAR-T细胞。流式细胞术检测靶向CD70 CAR-T细胞对AML细胞系的体外杀伤功能;CBA试剂盒测定其细胞因子(包括IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ)的分泌水平。研究结果表明,AML细胞系均表达CD70,并且在效靶比为1?1、2?1和5?1时,CD70 CAR-T细胞都能明显且特异性地杀伤表达CD70的AML细胞系。相比于对照组,CD70CAR-T细胞在杀伤靶细胞时分泌更高水平的IL-6、IL-10、IFN-γ等细胞因子(P<0.05)。综上所述,该研究成功构建了靶向CD70...     

低温电转联合Sleeping beauty转座子系统增强CAR-T修饰效率

嵌合抗原受体T淋巴细胞(chimeric antigen receptor T cells, CAR-T cells)在恶性B淋巴细胞瘤治疗上取得了显著成效。CAR-T治疗通过分离病人外周血单个核细胞PBMC,经适当的基因编辑手段表达CAR结构,令T细胞获得靶向肿瘤细胞的能力,扩增后过继到体内完成对肿瘤的杀伤。该文主要探索在低温状态将含有睡美人(Sleeping beauty)转座子/转座酶系统的质粒电转进PBMC内表达CD19-CAR制备CAR-T细胞,并添加特定细胞因子进行增殖,并验证CAR表达、细胞活性与杀伤能力。结果表明,转染效率高达58.8%±4.1%,增殖后的CAR-T细胞能够整合并表达CAR基因,在与靶细胞共培养后,表现出与慢病毒制备的CD19-CAR相似的细胞活性和毒性。该文确定了一种基于Sleeping beauty转座子/转座酶和电转制备CAR-T细胞的方法,为临床CAR-T治疗提供了新的思路。     

肿瘤特异性嵌合抗原受体EGFRvⅢ-CAR的构建及体外活性分析

嵌合抗原受体T细胞免疫疗法（chimeric antigen receptor-T, CAR-T）,是通过体外激活和扩增肿瘤特异或非特异性杀伤细胞达到抗肿瘤效果,在肿瘤免疫治疗方面具有良好的应用前景。本研究构建靶向EGFRⅢ(epidermal growth factor receptor variant III)的嵌合抗原受体（CAR）的重组慢病毒表达载体,利用慢病毒感染并筛选能够稳定表达该嵌合抗原受体的Jurkat细胞系。通过EGFRvⅢ分子刺激、与U87MG细胞共培养的方式检测细胞系的活化状况。结果显示,成功构建了pCDH-EGFRvⅢscFv-CAR-copGFP-T2A-puro慢病毒表达重组质粒,并筛选出可稳定表达EGFRⅢ-CAR的Jurkat 细胞系。CCK-8 法检测显示,EGFRvⅢ分子刺激12 h的Jurkat-CAR细胞增殖率约是对照组的1.36倍（P<0.05）;ELISA法检测显示,与U87MG细胞共孵育后,细胞上清中IL-2的浓度约是单独培养分泌在上清中IL-2的1.625倍（P < 0.01）。以上结果表明,稳定表达CAR的jurkat细胞,可以靶向性识别EGFRvⅢ分子及EGFRvⅢ阳性的靶细胞,并引起IL-2细胞因子释放,为后续临床细胞免疫治疗提供了理论基础。     

靶向CD123抗原嵌合受体T细胞治疗急性髓系白血病的研究

急性髓系白血病(AML)是一种预后较差的血液系统恶性肿瘤,迫切需要新的治疗手段。随着嵌合抗原受体(CAR)T细胞(CAR-T)技术的发展并在B细胞肿瘤中取得显著疗效,人们把目光投入更多的实体瘤与血液肿瘤靶点中。CD123分子是CAR-T治疗AML的潜在靶点,抗CD123 CAR-T具有靶向清除白血病干细胞(LSCs)及原始细胞的能力。本研究总结了目前在靶向CD123 CAR-T治疗急性髓系白血病目前的研究进展。     

细胞治疗的典范：嵌合抗原受体T细胞疗法

嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞疗法是一种利用合成受体特异性靶向抗原的过继性细胞疗法(ACT),目前在血液肿瘤的治疗中有极大的临床应用价值。虽然美国食品药品监督管理局(FDA)已经批准两款CAR-T药物上市,但CAR-T疗法在治疗过程中仍然存在一些副作用,如细胞因子释放综合征(CRS)、神经毒性、B细胞功能缺失等。同时,CAR-T疗法在实体瘤治疗中的效果甚微,主要原因是缺乏特异性靶点以及肿瘤微环境对CAR-T细胞功能的抑制等。文中将从CAR的结构设计、临床应用、合成生物学对新型CAR的优化来阐述应用CAR-T细胞疗法治疗肿瘤所面临的挑战及广阔前景。     

CAR-T细胞治疗恶性肿瘤的研究现状与展望

嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)是运用重组DNA技术制备的基因工程抗体,由单链抗体、协同刺激分子及T细胞信号转导分子等部分融合而成。全外显子测序技术是传统的c DNA文库表达血清学方法之外的筛选肿瘤抗原的新方法。近年来,嵌合抗原受体-T细胞(chimeric antigen receptor-T cells,CAR-T细胞)在治疗包括实体瘤在内的一系列恶性肿瘤中取得了较大的成就。临床试验表明,CAR-T细胞在产生强大抗肿瘤效应的同时,也具有不容忽视的毒副反应。该文将讨论嵌合抗原受体-T细胞治疗恶性肿瘤基本原理、关键技术和面临的挑战。     

嵌合抗原受体修饰的T细胞治疗急性白血病的研究进展

嵌合抗原受体修饰的T细胞(CAR-T)治疗是过继免疫治疗的一种,通常CAR-T细胞是由患者或供者的T细胞经CAR基因转化并扩增而来,最后再回输到患者体内.CAR-T在治疗B细胞恶性肿瘤中展现出了振奋人心的效果,目前也被用于治疗其他血液肿瘤的研究中.本文就CAR的基本结构、CAR结构的演变、在急性白血病治疗中的进展以及目前CAR-T设计新方案4个方面进行叙述.     

CAR-T细胞治疗血液肿瘤的临床进展

嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T cell,CAR-T)是一种新型治疗型T细胞,通过基因工程在T细胞表面表达可识别特定肿瘤抗原的嵌合受体,能特异性杀伤肿瘤细胞。CAR-T在多种血液肿瘤的治疗中具有良好的应用前景,受到了广泛的关注,但越来越多的临床应用显示CAR-T治疗产生了一系列不良反应,不同程度影响患者预后。该文总结了CAR的结构设计演变,CAR-T在急性淋巴细胞白血病、急性髓系白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤中的应用及相关不良反应,并就如何提高CAR-T的疗效和安全性展开讨论。     

CAR-T 对肿瘤的特异性治疗研究进展

嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(CAR-T疗法)是一种治疗肿瘤的新免疫疗法,通过向患者自身T细胞中导入已被修饰的CAR基因,使T细胞表达结合肿瘤表面抗原的特异性受体来实现对肿瘤的精准治疗.目前已发展到第四代.该免疫疗法在血液瘤和实体瘤治疗中都有一定疗效,同时也存在一些待解决难题.本文就近年来CAR-T在血液瘤和实体瘤中的研究治疗进展及存在的问题进行综述.     

嵌合抗原受体构建与肿瘤治疗的研究进展

多年来,癌症治疗一直是困扰人类的难题之一,常规的治疗手段都各有局限。随着基因转移和细胞培养技术的更新换代,细胞免疫治疗逐渐走入公众视线。嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)修饰的T淋巴细胞(CAR-T)治疗是几年来肿瘤过继免疫治疗的新方法,能特异性识别靶抗原,并杀伤肿瘤细胞。我们将CAR-T细胞在肿瘤治疗中的应用及构建CAR-T细胞的策略做简要综述。     

嵌合抗原受体T细胞治疗血液肿瘤的研究进展

嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy,CAR-T)是近年来迅速发展的肿瘤过继免疫治疗方法,其胞外段抗体以非主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex,MHC)方式与相应的肿瘤相关抗原结合识别后,使T细胞活化而发挥抗肿瘤效应。CAR-T在血液疾病治疗中取得较好的效果,现就CAR的结构、CAR-T治疗的靶点、出现的不良反应及采取的相应策略等作一概述。     

靶向CD138的第四代CAR-T细胞的构建及功能研究

该研究构建了靶向CD138的第四代CAR-T细胞(分泌IL-7和CCL19),通过与靶向CD138的第二代CAR-T细胞进行生物学功能比较,探讨第四代CAR-T细胞应用于临床的优势。使用慢病毒转染健康人外周血的T细胞制备出靶向CD138的第二代和第四代CAR-T细胞,CFSE标记法检测T细胞的增殖能力,Transwell实验检测T细胞的趋化能力,ELISA检测细胞因子分泌水平,流式细胞术检测T细胞的CAR表达率和亚型。荧光素酶生物发光法检测CAR-T细胞对多发性骨髓瘤细胞株的体外杀伤功能;构建人多发性骨髓瘤NCG小鼠模型,通过生物发光成像系统监测CAR-T细胞输注后小鼠肿瘤的消退情况。结果显示,靶向CD138的第四代CAR-T细胞(CD138-BBZ-7×19)在体外的生物学功能优于第二代CAR-T细胞(CD138-BBZ),而且在人多发性骨髓瘤动物模型中具有明显的抗肿瘤作用。     

非病毒定点整合CAR-T技术的开发及其在复发难治性非霍奇金B细胞淋巴瘤临床治疗中的应用

近年来,嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor, CAR) T细胞疗法在治疗恶性血液肿瘤中取得了喜人的进展,但目前CAR-T疗法依然存在一定的问题。本课题组利用CRISPR/Cas9基因编辑系统成功开发了非病毒定点整合CAR-T技术。通过各种条件的摸索和优化,成功制备了靶向CD19的非病毒PD1定点整合型CAR-T细胞。临床前和临床研究结果显示,该CAR-T细胞在复发难治性非霍奇金B细胞淋巴瘤的治疗中具有出色的安全性和有效性。机制研究表明,该PD1定点整合CAR-T细胞具有更高比例的记忆性T细胞和更强的抗肿瘤免疫功能。本研究开发的非病毒定点整合CAR-T技术为解决现有CAR-T治疗领域存在的问题提供了新的方法和思路。     

CAR细胞疗法在T细胞-急性淋巴细胞白血病应用的新进展

嵌合抗原受体(chimeric antigen receptors,CAR)细胞疗法已广泛用于白血病、淋巴瘤的治疗, CD19和CD22靶向CAR-T已在复发、难治性急性B淋巴细胞白血病(RR-B-ALL)等血液系统疾病的治疗上取得了显著疗效,而在T细胞肿瘤治疗上进展缓慢。介绍了目前国内外利用CAR细胞技术与CRISPR / Cas9基因编码技术,设计了T-ALL相关的CAR细胞免疫疗法并进行了CAR细胞免疫疗法在T-ALL治疗上的初步探索。     

靶向GPC3的第四代嵌合抗原受体T细胞 (分泌IL-7和CCL19) 的构建以及功能

基于嵌合抗原受体修饰的T细胞(CAR-T)的过继免疫疗法已被证明是治疗恶性肿瘤最有希望的策略之一,但是目前其在实体瘤中的应用依然有限。研究表明磷脂酰肌醇蛋白聚糖3 (GPC3)对肝细胞癌来说是一种有意义的诊断、治疗和预后生物标志物,且已有利用第二代/第三代GPC3靶向的CAR-T细胞治疗肝细胞癌的研究报道。为了进一步提高治疗效果,构建同时表达GPC3 CAR、人源IL-7和CCL19细胞因子的第四代慢病毒载体,转染293T细胞包装慢病毒并感染人T淋巴细胞制备靶向GPC3的第四代CAR-T细胞(GPC3-BBZ-7×19)。利用细胞计数、趋化小室、荧光素酶生物发光法以及流式细胞术等比较其与第二代GPC3 CAR-T细胞(GPC3-BBZ)在增殖、迁移、杀伤以及亚型分布方面的区别,评估GPC3-BBZ-7×19 CAR-T细胞对免疫缺陷小鼠体内GPC3阳性的肝细胞癌腹腔移植瘤生长的作用。结果表明与GPC3-BBZ CAR-T细胞相比,GPC3-BBZ-7×19 CAR-T细胞具备更强的增殖能力、趋化能力以及记忆干细胞(Stem memory T cell,Tscm)组成比(P值均0.05),而在体外特异性杀伤GPC3阳性的肝细胞癌细胞以及细胞因子分泌水平方面无显著差异。此外,GPC3-BBZ-7×19 CAR-T细胞能够明显抑制免疫缺陷小鼠体内的GPC3阳性肝细胞癌移植瘤模型。因此靶向GPC3的第四代CAR-T细胞(分泌IL-7和CCL19)有望比第二代GPC3靶向的CAR-T细胞更持久有效地对抗肿瘤,并产生针对肿瘤的记忆功能,为以后的临床试验提供了临床前研究基础。     

CAR-T细胞疗法的自动化设备及展望

嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)T细胞疗法是近年来发展非常迅速的一种细胞治疗技术。通过从患者或者捐献者外周血分离获得T细胞,并进一步激活、基因修饰、扩增从而获得CAR-T细胞,洗涤浓缩后回输患者体内进行治疗。修饰后的T细胞肿瘤靶向性、杀伤活性更强,在血液肿瘤疾病临床试验中疗效明显,在实体瘤的临床试验中也崭露头角。CAR-T细胞疗法整个过程的安全性、无菌性、纯度等质量控制极其重要。确保CAR-T细胞疗法生产过程的标准化、封闭化与自动化,做到药效和风险可控是首要任务。对CAR-T细胞疗法工艺与自动化设备以及面临的工程化问题进行综述,以期为CAR-T细胞疗法工程化提供参考。