22株猪瘟病毒E2基因部分编码序列的序列分析

RT－PCR方法获得了13株猪瘟病毒分离株、石门系强毒、中国C株及法国温度敏感株Thiverval株的E2基因部分编码序列的拉增片段,并对其进行了测序,得到了251bp的E2基因部分编码序列。利用DNAStar软件对其中224bp的片段进行了序列分析,并与已发表的Alfort、Brescia等毒株进行比较,结果13株猪瘟分离株所测片段均为猪瘟病毒E2基因的序列,与石门系强毒的序列相比所有毒株的碱基替换随机地分布于整个序列,无碱基缺失和碱基插入。其中变化较大的区域位于序列的3′端。2 2株HCV E2基因部分编码序列的核苷酸及氨基酸同源性范围分别为78.1%-100%、78.4%-100%,其中13株猪瘟病毒流行毒株的核苷酸及氨基酸同源性范围分别为:78.1%-100%、78.4%-100%,4株70－80年代分离的毒株的核苷酸及氨基酸同源性范围分别为：79.0%-88.3%、81.1%-87.8%,9株90年代分离的毒株的核苷酸及氨基酸同源性范围分别为：90.3%-100%、83.8%-100％;说明猪病毒流行株的变异呈现一定的多样性。     

猪瘟病毒E2基因主要抗原区的克隆及原核表达

利用反转录PCR（RT－PCR）和套式PCR（nest Polymerase Chain Reaction,nPCR)技术扩增出当前猪瘟流行毒（广西玉林株,GXYL)一中国猪瘟兔化弱毒（C－株）兔脾组织毒E2基因的主要抗原区,将其克隆到表达载体pPROEX-HTb中,获得重组质粒pPROEX-GXYL和pPROEX-C,经PCR,酶切和序列分析鉴定表明,插入的位置,大小和读码框均正确。SDS－PAGE,检测表明,经重组质业pPROEX-GXYL和pPROEX-C转化,诱导的受体菌能表达E2基因主要抗原区蛋白,Western-blot检测表明,诱导表达的抗原蛋白能与猪瘟阳性血清发生特异性反应。     

猪瘟病毒E2基因真核表达质粒的构建及基因疫苗的研究

构建了猪瘟（ｃｌａｓｓｉｃａｌ ｓｗｉｎｅ ｆｅｖｅｒ ｖｉｒｕｓ,ＣＳＦＶ）主要保护性抗原Ｅ２基因４种不同的真核表达质粒。小鼠免疫试验表明,Ｅ２基因上不同的功能区对基因疫苗的免疫应答有很大影响,有信号肽序列的Ｅ２基因可诱导产生特异性免疫反应,且无跨膜区序列的Ｅ２基因所诱导的免疫应答反应比有跨膜区序列的强,而无信号肽序列的Ｅ２基因则不能诱导产生ＣＳＦＶ特异性的免疫反应。攻毒保护试验表明,免疫家兔最     

猪瘟病毒E2基因真核表达质粒的构建及基因疫苗的研究

构建了猪瘟病毒(classical swine fever virus, CSFV)主要保护性抗原E2基因4种不同的真核表达质粒.小鼠免疫试验表明,E2基因上不同的功能区对基因疫苗的免疫应答有很大影响,有信号肽序列的E2基因可诱导产生特异性免疫反应,且无跨膜区序列的E2基因所诱导的免疫应答反应比有跨膜区序列的强,而无信号肽序列的E2基因则不能诱导产生CSFV特异性的免疫反应.攻毒保护试验表明,免疫家兔最少可抵抗10个最小感染剂量(MID)的猪瘟兔化弱毒苗(Hog cholera lap-inized virus, HCLV)的攻击;免疫猪可抵抗致死剂量的CSFV石门株强毒的攻击.     

12株猪瘟病毒E2基因主要抗原区域的序列差异分析

用RTPCR扩增了12个不同时期分离的HCV毒株E2基因主要抗原区域的cDNA片段并对其进行了序列测定。应用DNAstar序列分析软件对所测的12个HCV毒株与国内外已知的6个毒株Alfort株、Ald株、Brescia株、Gpe株、C株、CW株及早期已测定的HCLV株、HCVSM株和北京顺义株(BJSY2/96)3个毒株的相应片段进行了同源性比较分析。E2基因主要区域长度均为224 bp,包括从HCV 2485到2708位的E2基因B、C区域。所测的疫苗株HCLV与国外测得的疫苗株C株核苷酸及氨基酸同源性分别为991%和100%,表明目前应用的疫苗株是稳定的;用目前我国流行的部分野毒株对HCLV株免疫猪的攻击试验表明,HCLV对野毒株均具有很好的免疫力,这与序列分析结果相吻合。根据系统树分析,可将HCV分为两大群,5株90年代的野毒株及1株80年代的野毒株(其中北京3株、河南2株、广东1株)均与国内外C株、标准株属同一群(即第一群),其核苷酸及氨基酸的同源性分别为857%～100%和838%～100%;与Alfort株同属第二群的有6个野毒株(广西北海、辽宁、河北黄骅、吉林、深圳光明、四川成都),其中80年代与90年代的野毒株各有三株,核苷酸及氨基酸的同源性分别为843%～100%和851%～100%;21株HCV的核苷酸及氨基酸的同源性分别为781%～100%和784%～100%。两群之间的特征性差异表现在713和729位氨基酸位点的不同,经分析发现猪瘟野毒株具有复杂性与多样性。     

逆转录病毒载体介导的猪瘟病毒E2基因的真核表达

利用DNA重组技术将猪瘟病毒(Classical swine fever virus , CSFV)石门株囊膜蛋白E2基因插入逆转录病毒载体pBABE-puro 中构建成重组逆转录病毒载体pBABE-puro-E2,该重组逆转录病毒载体与pVSVg质粒经磷酸钙共转染法将其转入293GP细胞中包装逆转录病毒假病毒.用包装的假病毒感染PK-15细胞,经嘌呤霉素筛选阳性细胞后进行流式细胞技术(FACS)分析,结果表明CSFV E2基因在PK-15细胞膜上成功表达.将表达E2蛋白的PK-15细胞腹腔免疫Balb/c小鼠,成功诱导小鼠产生了抗E2蛋白的抗体.     

猪瘟病毒E2基因在昆虫细胞/杆状病毒中的表达

目的利用昆虫细胞/杆状病毒系统表达猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白,用于E2蛋白功能、开发CSF新型疫苗以及建立相关血清学诊断方法等研究。方法采用RT-PCR扩增CSFV E2基因,将PCR产物克隆到pGEM-T-Easy载体,将该基因插入到pFast-BacHT A载体中,构建重组转座载体后转化DH10Bac感受态细胞,获得重组Bacmid质粒后转染sf9昆虫细胞,传毒3代,对表达蛋白进行Western-blot及免疫组化鉴定。结果成功克隆CSFVE2基因,其核苷酸序列为1119 bp。SDS-PAGE电泳结果显示表达E2蛋白相对分子质量约为43×103,Western-blot和免疫组化结果证实表达蛋白能够被CSFV标准阳性血清识别。结论在Bac-to-Bac杆状病毒系统中的成功表达了CSFV E2蛋白,与CSFV标准阳性血清具有较好的反应性。     

猪瘟病毒糖蛋白E0基因的克隆及及表达研究

用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增分别获得了中国猪瘟病毒强毒石门株和兔化弱毒株糖蛋白Ｅ０基因ｃＤＮＡ,并克隆到ｐＧＥＭ Ｔ载体中测定其核苷酸序列和推导出其对应氨基酸序列,结果表明这两个毒 间的Ｅ０基因核苷酸序列同源性为９５．３％,氨基酸序列同源性为９４％,有１４个殖基的差异;与几个代表毒株ＡＬＤ株、ＧＰＥ株、Ｂｒｅｓｃｉａ株、Ａｌｆｏｒｔ株和国外测得的兔化弱毒Ｃ株相应序列进行比较,所测石门病毒核苷酸序列与上述     

猪瘟病毒保护性抗原E2基因的克隆、序列分析及在大肠杆菌中的表达

本研究首次用RT-PCR技术分两段扩增了我国猪瘟病毒(HCV)标准强毒石门株的主要保护性抗原E2基因,并将其进行了克隆和序列分析。将这两个片段连接成完全的E2基因,并将其克隆到原核表达载体pBV220和pET-28a( )中,重组表达载体转化、诱导的受体菌经Western印迹和直接ELISA检测能够表达E2抗原。 用RT-PCR技术对从我国多个地区收集的猪瘟病料进行检测,结果从吉林、长春、南京、重庆、昆明、佛山病料中扩增出了HCV E2保     

猪瘟病毒流行毒株E2基因密码子优化及在酵母中的高效表达

密码子的偏嗜性是影响基因异源表达的重要参数之一,优化密码子序列能够提高外源基因的表达水平。野生型猪瘟病毒E2基因在毕赤酵母中的表达量较低,为了提高E2基因在毕赤酵母中的表达水平,利用PCR基础上的定点突变技术将E2基因上的毕赤酵母低利用密码子突变为其高利用率的简并密码子。结果表明,替换野生型E2基因上24个酵母低利用密码子后,E2基因在酵母中表达水平有较显著提高,表明通过密码子优化提高E2基因在毕赤酵母中的表达这一策略是成功的。     

表达猪瘟病毒E2蛋白的BacMam病毒的构建及其免疫原性分析

含具有哺乳动物细胞活性的启动子的重组杆状病毒(BacMam病毒)可有效转导多种哺乳动物细胞,并被广泛用于开发新型非复制型载体疫苗．将水泡性口炎病毒G蛋白(VSV-G)基因插入多角体启动子下游,得到经修饰的杆状病毒转移载体,将对虾白斑综合症病毒(WSSV)ie1启动子控制下的猪瘟病毒E2基因表达盒插入此载体中,构建了BacMam病毒BacMam/G-ie1-E2,以其感染Sf9细胞和转导HeLa细胞,通过间接免疫荧光试验和Western blot分析检测E蛋白的表达,同时用BacMam病毒直接免疫小鼠,用检测猪瘟病毒抗体的间接ELISA方法检测免疫小鼠血清抗体,用基于CFSE和WST-8的淋巴细胞增殖试验评价其细胞免疫应答．结果显示,BacMam/G-ie1-E2能同时在昆虫细胞和哺乳动物细胞中高效表达E2蛋白,免疫小鼠能诱导产生针对猪瘟病毒的特异性抗体,免疫小鼠脾细胞经猪瘟病毒刺激后能诱导特异性的淋巴细胞增殖．这表明,由BacMam病毒介导的基因转移有望用于开发针对猪瘟病毒的非复制型载体疫苗．     

22株猪瘟病毒E2基因部分编码序列的序列分析*

利用RT PCR方法获得了 1 3株猪瘟病毒分离株、石门系强毒、中国C株及法国温度敏感株Thiverval株的E2基因部分编码序列的扩增片段 ,并对其进行了测序 ,得到了251bp的E2基因部分编码序列。利用DNAStar软件对其中224bp的片段进行了序列分析 ,并与已发表的Alfort、Brescia等毒株进行比较 ,结果 1 3株猪瘟分离株所测片段均为猪瘟病毒E2基因的序列 ,与石门系强毒的序列相比所有毒株的碱基替换随机地分布于整个序列 ,无碱基缺失和碱基插入。其中变化较大的区域位于序列的 3′端。     

利用T4噬菌体展示猪瘟病毒E2抗原

利用重组PCR技术将猪瘟病毒 (CSFV )E2蛋白主要抗原编码区基因 (mE2 )与T4噬菌体SOC基因融合 ,构建了大小为 643bp的SOC/mE2融合基因 ,再将其插入携带T4溶菌酶基因 (e)和(denV)基因的T4重组载体 (PRH) ,构建了重组载体pRsmE2。通过重组载体与缺失突变型T4发生同源重组 ,可将SOC/mE2融合基因整合入T4的基因组中 ,并成功地将大小约 2 1 5aaSOC/mE2融合蛋白展示于T4噬菌体衣壳表面。经Westernblot、胶体金免疫电镜等免疫学检测证实 ,展示于T4表面的mE2融合蛋白具有CSFV免疫学活性。     

猪瘟病毒强弱毒株和野毒株E2全基因序列测定及比较分析

为了比较猪瘟病毒 (HCV)野毒株、疫苗株及标准株之间E2基因抗原区域的差异 ,采用RT PCR扩增了HCV石门株、兔化弱毒疫苗株、野毒 0 3及 0 7株的囊膜糖蛋白E2 (gp55)全基因的cDNA片段 ,分别克隆于pGEM T载体中并对其进行了核苷酸序列测定及氨基酸序列的推导 ,同时进行了同源性比较及E2结构与功能的分析。所测 4株HCVE2基因的长度均为1 2 73bp,所编码的氨基酸序列均包括部分信号肽序列和完整的跨膜区序列 ,共由 381个氨基酸组成 ;4个毒株E2蛋白N末端的 683位至 690位信号肽序列 (WLLLVTGA)和C末端 1 0 30～1 0 63位跨膜区均为保守序列 ,而且具疏水性 ;N末端抗原功能区中 ,4个E2蛋白与其它所比较序列在位于第 753位至 759位氨基酸处 ,均有一段保守序列RYLASLH ,无一氨基酸发生变异 ,为亲水性 ,在整个E2蛋白抗原谱中抗原性峰值为最高 ,推测对抗原性产生起重要作用 ;4个E2蛋白的氨基酸序列中均含有 1 5个半胱氨酸 (Cys)残基 ,其数量及位置与国外五株HCV(Brescia ,C ,Alfort.ALD和GPE)完全一致。表明…     

共表达猪瘟病毒E2基因和猪白细胞介素2基因的重组腺病毒的构建及其免疫原性研究

为研制猪瘟活载体疫苗,构建共表达猪瘟病毒E2基因和猪白细胞介素2基因的重组腺病毒并研究其免疫原性。应用PCR方法从pMD19-T-E2质粒和pMD19-T-pIL2质粒中分别扩增E2基因和pIL-2基因,将扩增的全长E2基因和pIL-2的编码区基因序列通过柔性接头序列(5个甘氨酸密码子)串联,插入腺病毒穿梭载体AdTrack中,在受体菌中与骨架载体AdEasy同源重组。重组质粒AdEasy-E2-pIL-2转染HEK293细胞,包装出重组腺病毒rAd-E2-pIL-2。用rAd-E2-pIL-2免疫家兔,经兔体交互免疫试验评定其免疫效果。结果显示,经RT-PCR和West-ern blot检测,成功构建了rAd-E2-pIL-2,重组病毒滴度达108.12PFU/mL。rAd-E2-pIL-2接种家兔后刺激接种兔产生猪瘟病毒特异性抗体,淋巴细胞转化试验结果显示猪瘟病毒诱导兔淋巴细胞特异性增殖,攻毒后rAd-E2-pIL-2接种兔和猪瘟病毒C株接种兔均未出现定型热反应。研究结果表明,rAd-E2-pIL-2免疫兔可以预防猪瘟病毒C株接种引发的体温反应,rAd-E2-pIL-2可望成为猪瘟候选疫苗。     

融合铁蛋白的猪瘟病毒囊膜蛋白E2的表达及鉴定

目前,传统的灭活猪瘟疫苗及弱毒（减毒）猪瘟疫苗存在免疫保护期短、毒力返强等缺点,而蛋白源性亚单位疫苗可以很好的解决上述问题。铁蛋白24个亚基可以自组装成稳定的多聚体纳米颗粒,成为理想的抗原呈递载体和疫苗开发平台。基于此,将铁蛋白与具有较强免疫原性的猪瘟病毒囊膜蛋白E2（具有高保守性的保护性抗原）结合,构建融合基因E2-Fe,将该基因克隆到pET28a原核表达载体中,转化至大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）感受态细胞中进行诱导条件的探索及其高效表达,再将表达的融合蛋白进行镍柱纯化、质谱分析、Western-blotting验证及电镜检测。结果显示,融合基因E2-Fe已成功克隆到pET-28a载体上,0.50%乳糖诱导6 h为融合蛋白E2-Fe表达的最优条件;质谱分析与Western-blotting均显示融合蛋白的大小约为51 kD,与理论值相符;电镜观察到的纳米颗粒直径约为20 nm。结果表明,融合铁蛋白的猪瘟病毒囊膜蛋白E2在大肠杆菌中得到高效表达,经镍柱纯化后可获得数量可观的自组装纳米颗粒抗原,为研究新的猪瘟疫苗拓宽了研究思路。     

猪瘟病毒E2基因在Pichia pastoris中的表达及其免疫活性的初步研究

将猪瘟病毒的E2基因克隆入酵母分泌型表达载体pPIC9K中,酶切线性化后电穿孔导入Pichia pastoris进行整合,经G418筛选得到高拷贝转化子,甲醇诱导表达。SDS－PAGE和Western blit结果证实了酵母培养上清液中含有E2蛋白。免疫活性研究证明P.pastoris表达的E2蛋白能刺激动物产生抗猪瘟病毒的抗体。     

猪瘟病毒E2基因的定点突变、在大肠杆菌中的高效表达及表达产物的免疫原性

用重组PCR技术对猪瘟病毒石门株E2基因进行了定点突变, 然后将突变后的基因克隆至表达载体质粒pET-28a(+)中,构建成重组质粒pETE2。将pETE2转入受体菌BL21(DE3)plysS中,在IPTG的诱导下, 重组转化菌可高效表达目的基因, 表达量平均可达菌体蛋白总量的28%。免疫印迹和间接ELISA表明所表达的蛋白是CSFV特异性的。此重组蛋白免疫的家兔可抵抗猪瘟兔化弱毒的攻击。