淀粉样前体蛋白裂解片段sAPPβ、Aβ和AICD对SH-SY5Y细胞氧化损伤和线粒体膜电位的影响

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)的一个主要的病理特征表现为神经细胞表面大量地呈现β-淀粉样蛋白(amyloidβ-protein, Aβ)。淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein, APP)是与AD病理密切相关的膜蛋白,它经β-裂解途径剪切后生成s APPβ、Aβ和AICD片段。Aβ能引发细胞内质网氧化应激、线粒体功能障碍等,但s APPβ和AICD片段对细胞的影响还有待进一步的研究。本实验采用慢病毒介导质粒转染技术,分别构建了稳定过表达s APPβ、Aβ和AICD片段的SH-SY5Y细胞系,并分析了其细胞活力、细胞膜损伤、胞内活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平和线粒体膜电位去极化程度。结果表明, Aβ或AICD片段可在一定程度上导致细胞活力下降、细胞膜受损、胞内ROS水平升高和线粒体膜电位发生去极化,从而对细胞产生氧化损伤作用。     

Parkin基因过表达质粒和细胞模型的构建

目的:构建Parkin基因过表达质粒并转染SH-SY5Y细胞,为进一步研究帕金森病的发病机制及中药的作用环节奠定基础。方法:首先构建Parkin基因过表达质粒,采用脂质体转导技术,将Parkin过表达质粒应用Lipo3000转染SH-SY5Y细胞。荧光显微镜观察细胞绿色荧光蛋白的表达;RT-PCR检测其Parkin mRNA的表达;Western Blot技术检测其Parkin蛋白的表达。结果:转染组可观测到较多的绿色荧光蛋白表达;Parkin过表达细胞Parkin mRNA和蛋白的表达均显著提高(P0.01)。结论:通过脂质体转导技术,应用Lipo3000可将Parkin过表达质粒成功转染入SH-SY5Y细胞,转染的基因和蛋白表达均较高,提示此法可成功构建Parkin基因过表达的细胞模型。     

APPswe基因慢病毒表达质粒的构建及对其SH-SY5Y细胞生长和凋亡的影响

为考察APPswe基因的表达对细胞生长和凋亡作用的影响,本研究采用gateway分子重组技术构建表达APPswe基因的慢病毒质粒,并将该质粒转染至SH-SY5Y细胞中.用RT-PCR和Western blot技术分别测定APPswe基因的mRNA转录和蛋白翻译水平.活细胞计数法和细胞外乳酸脱氢酶法分别测定细胞存活力和细胞膜损伤程度.Annexin V-FITC/PI染色流式细胞术测定细胞凋亡水平,Hoescht 33342染色观察细胞核形态变化,DCFH-DA染色法测定胞内活性氧水平.转录和翻译水平的验证表明,APPswe基因能够在SH-SY5Y细胞中相对稳定地表达.表达APPswe基因后,细胞的存活能力降低,损伤程度增加,细胞内活性氧水平上升,细胞核浓缩聚集,细胞发生凋亡反应.试验结果表明,APPswe基因的表达对SH-SY5Y细胞生长产生抑制作用,造成细胞损伤和凋亡,表达APPswe基因的SH-SY5Y细胞系可应用于体外AD病理发生机制和药物作用的研究.     

氟西汀对阿尔茨海默病神经细胞模型保护作用分子机制的研究分析

本研究初步探讨氟西汀(fluoxetine)对阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)神经细胞模型小鼠神经纤维瘤细胞,野生型N2A/WT细胞和β-淀粉样蛋白(amyloidβ-protein,Aβ)过表达型N2A/APP695swe细胞的保护作用及可能机制。CCK-8法进行氟西汀对APP695细胞抑制率的测定,以半数抑制率(IC50)的氟西汀浓度作为后续实验的药物浓度。后分为WT组、APP695+氟西汀组、APP695组,三组细胞分别培养48 h后,进行细胞原位凋亡染色。最后以Western测定Aβ和BDNF的表达量。实验结果测得半数抑制率(IC50)的氟西汀浓度10-7mol/L。细胞凋亡染色结果显示APP695组凋亡的细胞明显多于其他两组(p0.01),与APP695+氟西汀组相比凋亡细胞增加(p0.05),而WT组与APP695+氟西汀组凋亡细胞无显著性差异(p0.05)。Western结果显示APP695组Aβ表达多于其他两组(p0.05)而BDNF表达明显少于其他两组(p0.01),与APP695+氟西汀组相比Aβ表达增加(p0.05)但BDNF表达减少(p0.05),而WT组与氟西汀组相比Aβ和BDNF的表达量均无显著性差异(p0.05)。本研究结果提示氟西汀可以通过抑制APP695过表达Aβ,从而减少有毒Aβ对BDNF的影响,增加BDNF的表达量,对神经细胞起保护作用,为氟西汀治疗AD提供新的思路。     

β-分泌酶与二价阳离子耐受蛋白CUTA存在相互作用

淀粉样蛋白(β-amyloid,Aβ)沉积是阿尔茨海默病(Alzheimerdisease,AD)的重要病理特征之一.Aβ是由淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)经β-分泌酶(BACE)和γ-分泌酶水解产生的,因此BACE1在AD的形成过程中发挥重要作用.为了进一步研究BACE1的作用机制,以BACE1胞内段构建诱饵蛋白用酵母双杂交方法筛选与之相互作用的蛋白质.结果得到了二价阳离子耐受蛋白(divalent cation tolerant protein,CUTA)的阳性克隆,β-半乳糖苷酶实验表明CUTA和BACE1胞内片段存在相互作用.构建了两者全长基因的表达载体,证明二者在哺乳动物细胞中同样可以相互作用.CUTA可能涉及铜的代谢动力学及乙酰胆碱酯酶(AchE)的膜锚定,而铜的代谢失衡和AchE水平与AD发病密切相关.实验结果为BACE生物学功能和AD发病机制的研究提供了条件.     

MPST基因慢病毒载体的构建及在SH-SY5Y细胞中的表达

为构建MPST基因慢病毒表达载体,获得稳定表达外源MPST基因的SH-SY5Y细胞株,本研究通过PCR扩增出MPST目的基因,将其克隆到慢病毒表达载体p EB-GFP (T2A) PURO上,将重组慢病毒表达载体和慢病毒包装质粒系统(pLP/VSVG, pLP1, p LP2)共转染293T细胞,用获得重组的慢病毒液感染SH-SY5Y细胞,嘌呤霉素筛选稳定表达MPST基因的(SH-MPST)细胞株。采用Real-time PCR和Western blotting以及ELISA等方法对筛出来的SH-MPST中的MPST的表达及功能进行鉴定。与空转染组(SH-PEB)相比,SH-MPST细胞中MPST mRNA及蛋白的表达水平显著增加,且细胞内MPST酶活性、酶含量及细胞释放硫化氢的水平均显著增加(p0.05)。以上研究表明,MPST基因慢病毒表达载体成功构建,并获得稳定表达外源MPST基因的SH-SY5Y细胞株,这将为MPST功能的深入研究提供依据。     

野菊花总黄酮增强细胞自噬促进β淀粉样蛋白清除

目的探讨野菊花总黄酮(total fl avonoids of Chrysanthemu m,TFC)清除β淀粉样蛋白的作用和分子机制。方法采用CCK-8法观察不同浓度TFC对SH-SY5Y神经细胞株增殖的影响,ELISA法检测TFC对转染过表达淀粉样前体蛋白(APP)和淀粉蛋白前β位分解酶1(BACE1)的CHO细胞培养上清液中Aβ水平的影响,MDC染色检测TFC处理后的神经元内自噬小体的形成,Western blot检测自噬蛋白LC3表达水平。结果 CCK-8法分析显示,TFC对SH-SY5Y神经元活力无明显影响;ELISA检测显示,TFC处理使过表达APP和BACE1的CHO细胞培养上清液中Aβ水平呈浓度依赖性降低;荧光倒置显微镜下观察和Western blot检测发现,TFC处理后SH-SY5Y细胞自噬增加,LC3/LC3自噬标志物蛋白表达增强。结论 TFC可能通过增强细胞自噬而促进Aβ的清除,减少Aβ细胞毒性。     

β-淀粉样蛋白寡聚体对人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞Munc-18表达的调节

为了观察阿尔茨海默病(AD)起始因素β-淀粉样蛋白(Aβ)对Munc-18表达的调节作用,采用Zn^2 诱导制备Aβ寡聚体,分化的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞经纳摩尔浓度Aβ寡聚体作用后用免疫印迹和流式细胞术的方法检测SH-SY5Y细胞的Munc-18蛋白水平,用MTT法分析纳摩尔浓度Aβ寡聚体的细胞毒性。结果发现,1nmol／L Aβ寡聚体作用1天后,SH—SY5Y细胞的Munc-18蛋白水平明显下调,随后逐渐增加。高浓度的Aβ寡聚体也有相似的作用效应,但抑制Munc-18蛋白表达的效应更明显。另外,相同浓度Aβ单体对Munc-18表达没有明显的影响,纳摩尔浓度的Aβ寡聚体也没有对细胞代谢产生显著的抑制。结果表明,纳摩尔水平Aβ寡聚体对Munc-18的表达有调节作用。     

稳定表达β-synuclein的SH-SY5Y细胞株的构建

目的构建稳定表达β-synuclein的SH-SY5Y细胞株。方法利用脂质体转染技术将质粒pcD-NA3.1-β-synuclein转染SH-SY5Y细胞,通过Zeocin进行抗性筛选。采用原位免疫荧光、免疫组织化学染色及Western blot杂交检测β-synuclein在SH-SY5Y细胞中的表达情况;通过MTT比色法检测β-synuclein稳定表达对SH-SY5Y细胞增殖的影响。结果原位免疫荧光、免疫组织化学染色及Western blot检测结果显示β-synuclein在SH-SY5Y细胞中的表达水平较对照组明显升高;稳定表达β-synuclein的细胞增殖程度较对照组明显增高(P<0.05)。结论β-synuclein在SH-SY5Y细胞中稳定表达,为后续的研究提供有用的细胞模型。为进一步研究β-sy-nuclein对帕金森病发病神经保护作用的研究奠定了良好的基础。     

人神经母细胞瘤株中β-淀粉样前体蛋白基因IL-1反应元件的研究

细胞团子IL-1β可以诱导SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞中APP基因的转录．为了研究APP基因启动子区的IL-1β反应元件,用含不同长度APP启动子片段的报告基因载体,瞬时转染SH-SY5Y细胞,发现APP启动子在SH-SY5Y细胞中有较强活性,其中-488到-303区为IL-1β诱导APP转录活性增加所必需,这个区域包括1个AP1结合位点和1个HSE元件．     

APP17肽对β—淀粉样肽及有关蛋白质表达的影响

本研究选用人类野生型SY5Y及SY5YA4CT基因转染细胞,应用免疫沉淀Western Blot等分析方法研究APP17肽对β-淀粉样肽及有关蛋白质如IDE,NT－3,NF表达的影响,探讨其影响神经元存活和退变的可能机理,结果发现,APP17肽能抑制转染细胞Aβ胞外分泌,并能促进野生型SY5Y细胞中IDE的表达,同时对内源性NT－3和NF的表达也有促进作用,提示：APP17肽抑制Aβ分泌和促进内源性神经营养因子的表达可能是其支持神经元存活,改善神经退变的机理之一。     

淀粉样前体蛋白生理功能研究进展

阿尔茨海默病(alzheimer's diasese,AD)是一种神经退行性疾病,以β淀粉样肽(βamyloid,Aβ)为主要成分的老年斑是脑内的主要病理改变,因此Aβ的过量产生和沉积是AD主要发病机制。Aβ主要由淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)经β和γ分泌酶异常剪切产生,APP表达增加被认为是AD的风险因素之一,目前关于APP的研究主要集中在作为Aβ的前体如何剪切及在AD发病中的作用,而对APP的生理功能关注较少。近年研究发现APP具有广泛的生理功能,APP缺失可以影响学习记忆,这与其剪切及Aβ的产生均无关。APP广泛表达于多种器官和组织,生理功能具有多样性,因此了解APP的生理功能将为AD发病机制的研究与治疗干预提供重要的理论依据。本文对此进行综述。     

稳定表达GFP-Parkin融合蛋白的SH-SY5Y细胞系的建立和功能初探

目的:建立稳定表达GFP-Parkin的SH-SY5Y细胞系,并检测Parkin对MPP~+引起的SH-SY5Y细胞损伤的保护作用。方法:将Parkin编码序列克隆到载体pEGFP-C1中,构建重组质粒pEGFP-Parkin,转染SH-SY5Y细胞,通过G418筛选,建立稳定表达GFP-Parkin的SH-SY5Y细胞系;荧光显微镜和Western印迹鉴定Parkin表达,MTT法检测Parkin对MPP~+致细胞损伤的保护作用。结果:酶切鉴定及测序结果表明重组质粒pEGFP-Parkin构建正确;荧光显微镜下可见细胞内有GFP-Parkin的融合表达,Western印迹检测发现相对分子质量79×103的蛋白条带;MTT结果显示Parkin能够减弱MPP~+对SH-SY5Y细胞的损伤,与对照组相比,存活率高约15%,差异显著(P0.05)。结论:构建了稳定表达GFP-Parkin的SH-SY5Y细胞系,为进一步研究Parkin的细胞保护作用和其他功能机制奠定了基础。     

MicroRNA-153对靶基因下游信号分子GSK-3β表达水平及细胞抗损伤能力的影响

目的 mir-153可负调控阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）主要致病基因APP及APLP2的蛋白表达,降低其胞内降解片段（intracellular domains,ICDs）的生成。因ICDs具有转录活化及促凋亡活性,本研究旨在探讨mir-153对这两个靶基因下游信号分子GSK-3β表达水平及细胞抗损伤能力的影响,以期进一步阐明mir-153在阿尔茨海默病发病机制中的作用。方法构建mir-153稳转细胞系及mir-153转基因小鼠,Western blot检测该细胞系及小鼠脑内磷酸化GSK-3β、Tau及其总蛋白的表达;Aβ42肽和H2O2分别处理mir-153稳转细胞系,MTS法检测细胞增殖活性的改变,流式细胞术检测细胞凋亡水平的改变。结果 mir-153稳转细胞系中磷酸化GSK-3β及其总蛋白的表达下调,Tau磷酸化水平降低。mir-153转基因小鼠脑内,磷酸化GSK-3β及其总蛋白的表达降低,磷酸化Tau及其总蛋白水平均无明显变化。Aβ42肽和H2O2损伤作用下,mir-153稳转细胞系的增殖活性显著降低,凋亡水平增加。结论 mir-153可负调控靶基因下游信号分子GSK-3β的表达;高表达mir-153可降低细胞抗损伤的能力。     

人APP基因C-末端片段在PC12细胞中的稳定表达及其对细胞生长和发育的影响

APP在AD病因学中是一个重要的分子,但到目前为止尚缺乏良好的动物和细胞模型用来探讨APP在AD发病中的作用。本研究旨在建立过表达人APP基因C－末端片段的遗传工程细胞系。将人APP695cDNA中编码C－末端105个氨基酸的片段重组到真核表达载体pDORneo中形成重组质粒pDORneo－CT,然后用脂质体将其转染到大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞（PC12）中。用800μg／mlG418筛选获得了在mRNA和蛋白质水平均表达相应片段的稳定细胞系。细胞形态学观察和MTT,LDH分析表明,该片段在细胞内的表达未能对NGF处理的PC12细胞产生明显的毒性作用。     

Beclin-1 shRNA对低氧诱导的SH-SY5Y细胞自噬的影响

目的：构建Beclin-1基因短发夹干扰RNA（shRNA）慢病毒载体,感染人SH-SY5Y细胞,观察沉默Beclin-1基因后低氧对SH-SY5Y细胞自噬的影响。方法：构建特异性靶向Beclin-1基因的shRNA慢病毒表达载体和阴性对照序列慢病毒载体;再将载体转染入SH-SY5Y细胞;RT-PCR检测Beclin-1的mRNA表达;Western blot检测Beclin-1蛋白表达;CCK-8法测定Beclin-1 shRNA对SH-SY5Y细胞活力的影响。再将空白对照、阴性对照、转染型三种细胞分别以21%常氧及5%低氧培养,Western blot检测各组细胞LC3蛋白表达;电镜观察自噬小体。结果：Beclin-1 shRNA能明显抑制SH-SY5Y细胞Beclin-1的mRNA及蛋白的表达;沉默Beclin-1基因后,Beclin-1 shRNA组细胞存活率与阴性对照组相比无差异;成功建立了稳定表达Beclin-1 shRNA的SH-SY5Y细胞。5%低氧处理后,与阴性对照组相比较,Beclin-1 shRNA组细胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值下调,细胞内自噬小体数量减少。结论：慢病毒介导的Beclin-1shRNA对SH-SY5Y细胞的活力无影响,但可以抑制低氧诱导的自噬。     

β-分泌酶抑制剂的筛选方法及其天然来源的研究进展

β-淀粉样蛋白(Aβ)的聚集是目前公认的导致阿尔茨海默病(AD)发病的关键因素,而β-分泌酶(BACE1)是将大脑中的淀粉样β-蛋白前体(APP)转化成Aβ的第一个蛋白酶,也是Aβ产生的限速酶。因此,对BACE1的抑制是有效治疗AD的策略之一。本文阐述了目前可用于β-分泌酶抑制剂筛选的荧光法、可见光比色法和酵母细胞筛选模型的原理和特点,并对来源于植物、微生物、动物的天然β-分泌酶抑制剂的研究进展进行了综述,为更多活性更强、毒副作用更小的抗AD天然产物先导化合物的发现和结构优化提供了借鉴和启示。     

ERK1/2信号通路介导PGI_2对γ-分泌酶亚基APH-1的调控作用

本文主要探讨环氧合酶-2的下游代谢产物PGI_2通过ERK1/2信号通路调控γ-分泌酶亚基APH-1蛋白表达的影响。应用免疫荧光技术检测PGI_2对人源和鼠源的神经母细胞瘤SH-SY5Y和鼠源神经母细胞瘤n2a细胞APH-1蛋白表达情况的调控作用,同时应用Western blot和Real-Time PCR的方法进一步检测PGI_2调控APH-1表达的具体机制,最后利用ELISA实验检测PGI_2对细胞内Aβ表达的调控作用。结果发现PGI_2处理SH-SY5Y和n2a细胞24 h后可通过ERK1/2信号通路增加APH-1蛋白表达,进而明显增加Aβ表达。以上结果说明COX-2代谢产物PGI_2可通过促进APH-1的表达,进一步增加γ-分泌酶的剪切活性,从而使Aβ产生增加,最终加速阿尔茨海默病的发病进程。     

β淀粉样蛋白的分泌酶与阿尔采末病的治疗

β淀粉样蛋白(Aβ)级联反应在阿尔采末病(AD)发病过程中起主要作用,Aβ由分泌酶中的β和γ分泌酶水解β淀粉样蛋白前体蛋白(APP)而来。本文综述了参与APP水解的三种分泌酶(α、β和γ)的发现、研究进展及其在调节β淀粉样蛋白过程中的作用。选择性地激活α分泌薄或抑制β和γ分泌酶格减少Aβ产生,为AD治疗提供新的研究思路,以分泌酶为靶点可能成为治疗AD的理想途径。     

缺氧对稳定表达人淀粉样前体蛋白HEK293细胞的存活及阿尔茨海默病相关蛋白表达的影响

目的：探讨缺氧对稳定表达人淀粉样前体蛋白的HEK293细胞（HEK293-APP695）存活及相关蛋白表达的影响,为深入研究缺氧对阿尔茨海默病的调节作用提供稳定的细胞模型。方法：利用缺氧手套箱（0.3% O₂）处理HEK293-APP695细胞,CCK-8法检测细胞的存活情况;Western blot检测缺氧条件下阿尔茨海默病（AD）相关蛋白APP、APP-CTFs和BACE1的表达变化。结果：缺氧处理后,HEK293-APP695细胞的存活率明显下降,APP表达降低,其剪切体APP-CTFs表达升高。结论：缺氧导致APP剪切的增多,抑制细胞的存活,提示缺氧可能通过影响BACE1的活性在AD的发病进程中起重要的调节作用。