人血浆 α_2-巨球蛋白的分离纯化

α_2-巨球蛋白(α_2-Macroglobulin,简称α_2M)是一种高分子量的糖蛋白,含糖量为8-11％,分子量为725,000,等电点为5.5,已知每克分子α_2M含有4.8克原子锌,占血浆总锌含量的20％.α_2M是血浆中重要的蛋白酶抑制剂.含量约为2毫克/毫升,能抑制四种内肽酶的活性.α_2M使蛋白酶失活的机理尚未彻底弄清,文献报道α_2M与胰蛋白酶、凝血酶、纤溶酶及激肽释放酶反应时,可从α_2M分子上游离出一段多肽(MW:85000),这一裂解作用使α_2M分子     

小鼠抗人胰岛素受体单克隆抗体的制备、纯化及鉴定

 M11D杂交瘤细胞株是由人胎盘细胞膜纯化所得胰岛素受体免疫BALB/C小鼠后,取其脾细胞与同系小鼠骨髓瘤细胞株NS-1细胞融合所得。该杂交瘤细胞分泌的抗体经ELISA及放射免疫沉淀法证实为胰岛素受体特异的单克隆抗体。该抗体经Protein A-Sepharose亲和层析分离、纯化,SDS-聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳鉴定得分子量分别为53000及23000的两条区带,免疫双扩证明为IgGl。该抗体特异地沉淀125Ⅰ-人胎盘细胞膜胰岛素受体,沉淀经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后放射自显影得分子量为135000的特异显影带,与胰岛素受体α亚基分子量相同,说明M11D为抗胰岛素受体α亚基的单克隆抗体。     

猪血浆a2巨球蛋白部分性质的研究

对猪血浆α２巨球蛋白性质研究表明其大部分理化性质与人α２巨球蛋白十分相似,而且猪α２巨球蛋白也存在有活性的天然的Ｓｌｏｗ－Ｆｏｒｍ和构象发生变化并不可逆失活的Ｆａｓｔ－Ｆｏｒｍ。猪α２巨球蛋白经测定其ＰＩ为４．５５,５．１。紫外吸收光谱在２７６ｍｍ处有最大吸收,其糖含量为９．３％。氨基酸组成表明酸性氨基酸含量较高。圆二色谱分析说明分子中含有较多的Ｂ折叠。它还具有连接锌离子的性质。     

甲2巨球蛋白制剂对正常人外周血淋巴细胞周期的影响

采用外周血淋巴细胞姐妹染色单体差别法(SCE)检测技术,研究甲_2巨球蛋白制剂α_2M对人外周血淋巴细胞周期的影响,在人外周血淋巴细胞培养中加入α_2M制剂浓度在≤0.5mg/ml培养液时,第一次细胞周期(M_1)、第二次细胞周期(M_2)、第三次细胞周期(M_3)、细胞增殖速度指数(PRI)改变不大。在加入的α_2M制剂浓度(?)1.0 mg/ml培养液时,M_1百分数增加(r=0.977,P<0.001)、M_2百分数也随α_2M浓度递增而增高(r=0.956,P<0.001)而M_3百分数则随α_2M浓度递增而减少(r=-0.979,P<0.001)、细胞增殖速度指数则随α_2M浓度递增而减少(r=-0.983,P<0.01),表明在人外周血淋巴细胞离体培养时,当每毫升培养液中α_2M浓度等于或大于1mg时,细胞分裂周期延缓。讨论了它的意义和可能作用的环节。     

朱桔Mn-SOD的纯化、鉴定及浓度梯度胶电泳在其中的应用

朱桔叶中存在Mn-SOD、Fe-SOD和CuZn-SOD三种类型,在10%的PAGE中有三条活性带,其中Mn-SOD的Rf值大于Fe-SOD与CuZn-SOD₁的Rf值相同;在4%~35%的梯度胶电泳中有四条活性带,而Mn-SOD的R_f值最小,表明该酶带有较高的电荷密度。Mn-SOD占总活性的20%左右,已被纯化到均一程度。该酶的比活性为1 249 U/mg,分子量和亚基分子量分别为54.0 kD和26.6 kD,在紫外区最大吸收值为280 nm,在95℃处理15 min仍保留了46%的酶活性,等电点为5.06。该酶的活性不被KCN、H₂O₂抑制,但对1% SDS和氯仿-乙醇液敏感。     

猪血浆α_2巨球蛋白部分性质的研究

对猪血浆α２巨球蛋白性质研究表明其大部分理化性质与人α２巨球蛋白十分相似。而且猪α２巨球蛋白也存在有活性的天然的Ｓｌｏｗ－Ｆｏｒｍ和构象发生变化并不可逆失活的Ｆａｓｔ－Ｆｏｒｍ。猪α２巨球蛋白经测定其ｐＩ为４．５５,５．１。紫外吸收光谱在２７６ｍｍ处有最大吸收,Ｅ＝９．１４。其糖含量为９．３％。氨其酸组成分析表明酸性氨基酸含量较高。圆二色谱分析说明分子中含有较多的β折叠。它还具有连接锌离子的性质。     

甲2巨球蛋白对辐照细胞的保护效应

用~3H—TdR掺入办法观察电离辐射对培养的人成纤维细胞的影响。在0—500cGy钻-60γ射线照射剂量范围内,细胞~3H-TdR掺入计数与照射剂量呈线性关系。y=33745.4e~(-0.0036×)。低浓度α_2M对细胞~3H-TdR掺入没有影响,高浓度α_2M能抑制细胞~3H-TdR掺入。4×10~5细胞经钻-60γ射线500cGy照射后加α_2M制剂,细胞~3H-TdR掺入计数与不照射对照组相比有明显升高(P<0.05)。在照射前加α_2M制剂与对照组相比无明显差别。     

血清中甲_2巨球蛋白对胰蛋白酶抑制活力测定

甲_2巨球蛋白(简称α_2M)是存在于人和动物血清中一种广谱蛋白酶抑制剂。实验利用α_2M对蛋白酶的特殊抑制原理:α_2M通过包陷蛋白酶去抑制蛋白酶对天然蛋白质的水解作用,但不破坏蛋白酶活化中心,因而仍保留对小分子合成底物的水解,释放显色基团,在分光光度计上比色,达到测定目的。本实验用人和大鼠正常混合血清作样品,对实验方法和测定系统中选择样品和试剂量作较详细介绍。方法灵敏,血清量少。为实验室和临床检验提供测试方法。     

番茄果实中焦磷酸:D-果糖-6-磷酸 1-磷酸转移酶的两种酶型的分离纯化及其特性

用快速蛋白液相层析仪(FPLC)Mono Q柱(HR5/5)分离纯化成熟绿番茄果实中PFP的两种分子酶型及其特性。一种酶型为Q_1,是含两个β-亚基(60kD)的二聚体,比活为5μmol min~(-1) mg~(-1);另一种为Q_2,由四个α-亚基(66kD)和四个β-亚基(60kD)组成八聚体,比活为70.5μmol/min~(-1)·mg~(-1)。Q_1的分子量是120kD,Q_2的分子量介于500kD和530kD之间。用纯化的Q_2制备的抗血清专一地与Q_2起沉淀反应。PFP酶液贮存后,其Q_1/Q_2蛋白量比值增加明显,表明部分Q_2转化为Q_1。Q_1具有催化活力表明PFP的活性中心位于β-亚基。α-亚基可能借增强PFP酶对F2,6P_2的亲和力以提高酶的比活而起调节功能,但是Q_1的活力依赖于F2,6P_2的激活,表明β-亚基处也可能存在F_2,_6P_2的调节位点。Q_2含紧密结合的F2,6P_2分子,并表现出对F2,6P2_的不敏感性,基于此种现象,有必要重新认识PFP对F2,6P_2敏感性的内在实质。     

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶cDNA在T7 RNA多聚酶/启动子系统中专一性表达的研究

用PT7和pGP1—2质粒偶联表达系统,通过温度诱导(30～42℃),使温度敏感基因CI875失活;加入利福霉素选择性抑制E.coliRNA多聚酶的表达,从而使外源PEP羧化酶cDNA得到专一性的表达。产物经SDS—PAGE和Wesern杂交分析,表明该系统表达出两条PEP羧化酶带,分子量分别是78kD和80kD。     

固氮螺菌(Azospirillum.brasilenseYu-62)中固氮酶活性的氨关闭现象

固氮螺菌(A.brasilense)Yu-62在以谷氨酸为氮源好气液体培养条件下,氨离子使固氮酶迅速失活,Western blotting实验证明这种失活的分子基础是固氮酶铁蛋白一亚基被修饰.测定加NH_4~ 后细胞内α-ketoglutarte和glutamine的含量.α-ketoglutarate/glutamine比值在加NH_4~ 后瞬间下降然后上升,而细胞内ATP/ADP的比值没有明显变化.谷氨酸合成酶的抑制剂azaserine使固氮酶失活.Western blotting实验表明这种失活的分子基础也是固氮酶铁蛋白一亚基被修饰.测定加azaserine后细胞内α-ketoglutarate及glutamine比值的变化以及外源α-ketoglutarate及glutamine对细胞固氮活性的影响,表明细胞内一些小分子化合物的变化可能是作用于固氮酶活性氨关闭的重要因素.     

固氮螺菌(Azospirillum.brasilenseYu-62)中固氮酶活性的氨关闭现象

固氮螺菌(A.brasilense)Yu-62在以谷氨酸为氮源好气液体培养条件下,氨离子使固氮酶迅速失活,Western blotting实验证明这种失活的分子基础是固氮酶铁蛋白一亚基被修饰.测定加NH_4^+后细胞内α-ketoglutarte和glutamine的含量.α-ketoglutarate/glutamine比值在加NH_4^+后瞬间下降然后上升,而细胞内ATP/ADP的比值没有明显变化.谷氨酸合成酶的抑制剂azaserine使固氮酶失活.Western blotting实验表明这种失活的分子基础也是固氮酶铁蛋白一亚基被修饰.测定加azaserine后细胞内α-ketoglutarate及glutamine比值的变化以及外源α-ketoglutarate及glutamine对细胞固氮活性的影响,表明细胞内一些小分子化合物的变化可能是作用于固氮酶活性氨关闭的重要因素.     

固氮螺菌(Azospirillum.brasilenseYu-62)中固氮酶活性的氨关闭现象

固氮螺菌(A.brasilense)Yu-62在以谷氨酸为氮源好气液体培养条件下,氨离子使固氮酶迅速失活,Western blotting实验证明这种失活的分子基础是固氮酶铁蛋白一亚基被修饰.测定加NH_4~+后细胞内α-ketoglutarte和glutamine的含量.α-ketoglutarate/glutamine比值在加NH_4~+后瞬间下降然后上升,而细胞内ATP/ADP的比值没有明显变化.谷氨酸合成酶的抑制剂azaserine使固氮酶失活.Western blotting实验表明这种失活的分子基础也是固氮酶铁蛋白一亚基被修饰.测定加azaserine后细胞内α-ketoglutarate及glutamine比值的变化以及外源α-ketoglutarate及glutamine对细胞固氮活性的影响,表明细胞内一些小分子化合物的变化可能是作用于固氮酶活性氨关闭的重要因素.     

菠菜和蚕豆叶绿体CF_1结构与功能的比较

比较了菠菜和蚕豆叶绿体的光合磷酸化活力以及由不同活化方法活化的叶绿体及可溶CF1的Mg2＋－ATPase和Ca2＋－ATPase的活力,观测到两种叶绿体ATPase的合成和水解ATP的功能有明显差异。从两种叶绿体CF1的SDS－PAGE图谱上可见蚕豆CF1的ε亚基分子量明显小于菠菜的,蚕豆CF1的α和β亚基间分子量的差别也比菠菜的小。     

神经生长因子对成纤维细胞生长的负调节作用

从小鼠颌下腺分离所得的神经生长因子(nervegrowth factor,NGF)是分子量为130000的多肽,其沉降系数为7S,由三种亚基α,β,γ组成,化学式为α_2βγ_2,其中β亚基可以完全表现NGF的生理效应.NGF的生物学效应比较广泛,它对神经系统的发育、分化有重要促进作用,在神经系统损伤后起修复、营养作用.另外,NGF对免疫系统、生殖系统也有一定作用.近年来,NGF与肿瘤关系的研究尤其     

猪-C反应蛋白的分离纯化及其性质的研究

以猪血清为材料,通过磷酸乙醇胺—琼脂糖亲和层析,Sepharose 4B柱层析和Sephacryl—S300凝胶过滤,获得了猪C—反应蛋白的结晶。猪C—反应蛋白可与肺炎球菌壁C多糖发生特异的沉淀反应,这种结合是依赖钙离子的。EDTA和一些磷脂代谢产物如磷酸胆碱,磷酸乙醇胺等,能抑制猪C—反应蛋白与C多糖的结合。在SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳及梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳中,猪C—反应蛋白表现出与人C—反应蛋白相同的行为,亚基是一条分子量为23.5kD的肽链,全分子的表观分子量为150kD。猪C—反应蛋白与兔抗人C—反应的蛋白的抗血清能发生免疫交叉反应。     

八棱丝瓜籽核糖体失活蛋白的分离纯化及其生化性质

通过盐溶液抽提、硫酸铵分级沉淀、CM 5 2纤维素阳离子交换层析、反相毛细管液相色谱 (re verse phasecapillaryliquidchromatography ,RP CLC)等步骤 ,从八棱丝瓜籽中分离到 2种单链核糖体失活蛋白luffaculin 1和luffaculin 2 .在SDS PAGE和IEF上均显示为单一条带 ,表观分子量均为 2 8kD ,其等电点分别为 8 86 (luffaculin 1)和 9 0 5 (luffaculin 2 ) .实验表明 ,它们具有RNAN 糖苷酶活性 .蛋白质合成抑制活性测试表明 ,它们对蛋白质合成具较强的抑制作用 .体外抑制肿瘤细胞生长活性检测表明 ,luffaculin 1和luffaculin 2对人白血病细胞株K5 6 2有较强的毒性 ,IC50 分别为 1 1×10 -6mol L和 2 0× 10 -7mol L .八棱丝瓜籽核糖体失活蛋白具有可以用于或构成免疫毒素治疗癌症的应用前景     

鸭血超氧化物歧化酶(SOD)的纯化及性质研究

超氧化物歧化酶(E、C、1.15.1.1)是催化超氧阴离子起歧化反应的金属酶类,血红细胞中的SOD属Cu Zn—SOD。本文详细报道了从鸭血分离纯化SOD的改进方法(同时用猪血作对比研究)。设计了热变性、(NH_4)_2SO_4分级监析、低浓乙醇—氯仿短时去除残留血红蛋白、凝胶层析四步纯化方案,获得高产率电泳纯SOD。用紫外扫描,PAGE电泳后考马斯亮蓝和SOD活性杂色,SDS—电泳,HPLC分离和各电泳带组分的N—端测定等技术检测纯度,并进行性质研究。证明所得SOD是均一的;N—端为Ala;分子量和亚分子量各为32,359和16,500dt;并与猪血SOD对比研究其某些性质;对HPLC出现的多个活力峰及PAGE电泳显现的多条活性带进行了讨论。     

甘油醛-3-磷酸脱氢酶的变性和失活动力学研究

用紫外差吸收和萤光方法对甘油醛-3-磷酸脱氢酶及其衍生物的SDS变性动力学研究结果表明,不论对于全酶、酶朊、羧甲基化酶,还是光照酶,在酶浓度为5μM,SDS的浓度为6.24mM,25℃恒温条件下,测量差吸收ΔA_(295)随时间的变化,或在λ_(ex)=305nm,λ_(em)=335nm测萤光强度随时间的变化,其结果均表现为由三个简单一级反应组成的复合一级反应,三个速度常数,对于上述四种酶来说尽管各不相同,但它们的数量级分别为:k_1=1秒~(-1),k_2=10~(-2)秒~(-1),k_3=10~(-3)秒~(-1)。这表明甘油醛-3-磷酸脱氢酶每个亚基中的三个色氨酸由于所处的空间位置的不同,在空间结构发生变化时,分别以不同的速度由酶蛋白分子内部的非极性环境暴露于其外部的极性环境。另外还发现,在这四种酶中,全酶的变性速度最小,而羧甲基化酶的变性速度最大。这说明酶经羧甲基化后空间结构的稳定性减弱,因而更易于为SDS变性。与此同时,我们测定了全酶和酶朊的SDS失活过程,并同它们的变性过程进行了比较。从酶的失活过程类似于变性过程也是由三个一级反应组成的复合一级反应这一事实来看,全酶和酶朊的失活过程似有部分变性并具有部分活力的中间物存在。     

甘油醛-3-磷酸脱氢酶的变性和失活动力学研究

用紫外差吸收和萤光方法对甘油醛-3-磷酸脱氢酶及其衍生物的SDS变性动力学研究结果表明,不论对于全酶、酶朊、羧甲基化酶,还是光照酶,在酶浓度为5μM,SDS的浓度为6.24mM,25℃恒温条件下,测量差吸收ΔA_(295)随时间的变化,或在λ_(ex)=305nm,λ_(em)=335nm测萤光强度随时间的变化,其结果均表现为由三个简单一级反应组成的复合一级反应,三个速度常数,对于上述四种酶来说尽管各不相同,但它们的数量级分别为:k_1=1秒~(-1),k_2=10~(-2)秒~(-1),k_3=10~(-3)秒~(-1)。这表明甘油醛-3-磷酸脱氢酶每个亚基中的三个色氨酸由于所处的空间位置的不同,在空间结构发生变化时,分别以不同的速度由酶蛋白分子内部的非极性环境暴露于其外部的极性环境。另外还发现,在这四种酶中,全酶的变性速度最小,而羧甲基化酶的变性速度最大。这说明酶经羧甲基化后空间结构的稳定性减弱,因而更易于为SDS变性。与此同时,我们测定了全酶和酶朊的SDS失活过程,并同它们的变性过程进行了比较。从酶的失活过程类似于变性过程也是由三个一级反应组成的复合一级反应这一事实来看,全酶和酶朊的失活过程似有部分变性并具有部分活力的中间物存在。