Mir-106b对阿尔茨海默病昼夜节律调控的初步研究

目的探讨mir-106b在阿尔茨海默病发病中的作用。方法取6月龄APPswe/PSΔE9小鼠脑组织,进行microRNA芯片的检测;利用real-time PCR对芯片检测结果进行验证;构建mir-106b表达载体,将其转染至SH-SY5Y细胞中构建mir-106b稳定转染的稳转细胞系。用Targetsan、Pictar、miRanda等靶基因预测软件,对mir-106b的靶基因进行预测,根据靶基因的功能选择可能与AD发病相关的靶基因,并用Western blot对所选择的靶基因在稳转细胞中的表达进行验证。用双荧光素酶报告检测系统检测mir-106b与其靶基因的结合位点。结果芯片结果显示,与野生型小鼠相比,6月龄APPswe/PSΔE9小鼠脑组织中mir-106b的表达下降,经real-time PCR验证,mir-106b的表达在APPswe/PSΔE9小鼠脑组织中的表达较野生型小鼠升高,差别具有统计学意义（P=0.03）。mir-106b稳转细胞系较对照mir-106b的表达升高2～5倍。神经PAS结构域蛋白2（neuronal PAS domain protein2,NPAS2）在mir-106b稳转细胞中的表达明显下降。双荧光素酶报告实验证实：与对照相比,带有NPAS2的3＇UTR的荧光素酶报告载体与mir-106b表达载体共转染,海肾荧光素酶/萤火虫荧光素酶的相对活性降低;荧光素酶报告载体的NPAS2-3＇UTR突变后与mir-106b表达载体共转染,海肾荧光素酶/萤火虫荧光素酶的相对活性升高。结论mir-106b可能通过调节机体生物钟基因NPAS2的表达,影响阿尔茨海默病人的生活节律,参与阿尔茨海默病的发生。     

阿尔茨海默病中mir-34a作用机制的探讨

目的探讨mir-34a在阿尔茨海默病发病机制中的作用。方法取3月龄和6月龄APPswe/PSΔE9小鼠脑组织,进行microRNA芯片的检测;利用real-time RT-PCR对芯片结果进行验证;采用western blot的方法检测APPswe/PSΔE9小鼠和对照小鼠脑组织中bcl2蛋白的表达情况;通过构建mir-34a稳定转染细胞系和mir-34aknockdown研究mir-34a与bcl2之间的关系;通过构建bcl23’UTR-荧光素酶报告载体,验证bcl23’UTR序列中包含mir-34a的结合位点。结果mir-34a在模型小鼠中表达水平明显升高,并且其表达水平与bcl2蛋白水平呈负相关;通过体外实验,我们发现mir-34a过表达可以明显降低bcl2蛋白水平,反之,当我们抑制mir-34a的表达以后则可以增加bcl2蛋白水平;荧光素酶报告载体实验表明bcl23’UTR序列中包含mir-34a的结合位点。结论bcl2可能是mir-34a重要的功能靶点,mir-34a的过表达可能通过下调bcl2的蛋白水平,从而参与AD的发生。     

阿尔茨海默病中miR-29c对APP表达调控的初步研究

目的探讨microRNA29c（miR-29c）在阿尔茨海默病中的作用。方法采用了microarray芯片检测3月龄、6月龄APPswe/PSΔE9双转基因阿尔茨海默病小鼠大脑中microRNA表达情况并利用实时定量PCR验证结果可靠性,通过microRNA靶基因数据库预测选出与阿尔茨海默病相关的靶基因,构建miR-29c表达载体,将其转染SH-SY5Y及HEK-293T细胞,在高表达miR-29c的SH-SY5Y及HEK-293T细胞系中验证miR-29c对靶基因的调控作用。将靶基因APP mRNA的野生及突变3’UTR序列克隆到双荧光素酶报告基因载体,用双荧光素酶报告检测系统检测miR-29c与靶基因的结合位点。结果根据microRNA芯片结果筛选出在3、6月龄APPSWE/PS1ΔE9双转基因小鼠大脑表达均有差异的miR-29c,通过实时定量PCR证实miR-29c在3月、6月、9月龄小鼠中表达明显升高。通过microRNA靶基因数据库预测miR-29c可以调控阿尔茨海默病的靶基因APP,利用Western blot检测到高表达miR-29c的SH-SY5Y细胞及HEK-293T细胞中APP蛋白表达减少。将miR-29c表达载体与带有野生及突变APPmRNA的3’UTR的双荧光素酶报告载体共转染HEK-293T细胞,通过双荧光素酶检测系统检测未找到miR-29c与APP mRNA 3’UTR的结合位点。结论 miR-29c对APP表达的具有负向调控作用,但其调控位点可能不位于其3’UTR区域。     

MicroRNA-153对靶基因下游信号分子GSK-3β表达水平及细胞抗损伤能力的影响

目的 mir-153可负调控阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）主要致病基因APP及APLP2的蛋白表达,降低其胞内降解片段（intracellular domains,ICDs）的生成。因ICDs具有转录活化及促凋亡活性,本研究旨在探讨mir-153对这两个靶基因下游信号分子GSK-3β表达水平及细胞抗损伤能力的影响,以期进一步阐明mir-153在阿尔茨海默病发病机制中的作用。方法构建mir-153稳转细胞系及mir-153转基因小鼠,Western blot检测该细胞系及小鼠脑内磷酸化GSK-3β、Tau及其总蛋白的表达;Aβ42肽和H2O2分别处理mir-153稳转细胞系,MTS法检测细胞增殖活性的改变,流式细胞术检测细胞凋亡水平的改变。结果 mir-153稳转细胞系中磷酸化GSK-3β及其总蛋白的表达下调,Tau磷酸化水平降低。mir-153转基因小鼠脑内,磷酸化GSK-3β及其总蛋白的表达降低,磷酸化Tau及其总蛋白水平均无明显变化。Aβ42肽和H2O2损伤作用下,mir-153稳转细胞系的增殖活性显著降低,凋亡水平增加。结论 mir-153可负调控靶基因下游信号分子GSK-3β的表达;高表达mir-153可降低细胞抗损伤的能力。     

miR-106b在阿尔茨海默病中的作用机制

目的 探讨miR-106b在阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)发病中的作用.方法 取3月龄和6月龄APPswe/PSΔE9小鼠脑组织,进行microRNA芯片的检测;利用real-time PCR检测3、6、9月龄APPswe/PSΔE9小鼠脑组织中miR-106b的表达,对芯片检测结果进行验证;通过构建miR-106b稳定转染细胞系和miR-106b knockdown研究miR-106b与TGFBR2表达之间的关系; 构建TGFBR2 3'UTR-荧光素酶报告载体,验证miR-106b是否可以直接调控TGFBR2蛋白的表达;采用Western blot的方法检测APPswe/ΔPSΔE9小鼠和对照小鼠脑组织中TGFBR2蛋白的表达情况.结果 miR-106b在3月龄和6月龄AD模型小鼠脑组织中表达升高,在9月龄模型小鼠脑组织中表达降低;通过体外实验,我们发现miR-106b与TGFBR2蛋白的表达呈负相关;荧光素酶报告实验表明TGFBR2 3'UTR序列中包含miR-106b的结合位点;TGFBR2蛋白在3、6、9、12月龄AD模型小鼠脑组织中表达均降低.结论 miR-106b可能通过调控TGFBR2蛋白的表达影响TGF-β信号通路,从而参与AD的发病.     

川芎嗪对痴呆小鼠模型学习记忆能力的影响

目的研究川芎嗪对痴呆小鼠学习记忆的影响。方法对APPswe/PSΔE9双转基因小鼠在3月龄开始食物中连续给川芎嗪（100 mg/kg.d）进行治疗,停药后立即进行水迷宫实验,并与未给药APPswe/PSΔE9双转基因小鼠和及野生鼠进行比较。结果治疗组与APPswe/PSΔE9双转基因组比较,平台寻找潜伏期缩短,穿过原平台区的频次增加。结论川芎嗪能改善APPswe/PSΔE9痴呆模型小鼠的学习记忆能力。     

12种中药单体对APPswe/PSΔE9转基因痴呆模型小鼠学习记忆作用的比较

目的利用APPswe/PSΔE9转基因阿尔茨海默病小鼠模型探索治疗痴呆有效的中药单体。方法根据目前的研究资料,选定12种中药单体,加入鼠粮中对APPswe/PSΔE9双转基因小鼠在5月龄开始进行治疗,以安理申作为阳性药对照,4周后进行水迷宫实验,并与安慰剂组小鼠进行比较。结果在水迷宫实验中,与安慰剂组相比,吴茱萸碱能够显著缩短寻找平台的潜伏期,显著增加穿过原平台区的次数。结论吴茱萸碱能够显著改善APPswe/PSΔE9痴呆模型小鼠的学习记忆能力。     

抑制小鼠乳腺肿瘤转移 microRNA 的筛选

目的：鉴定25种microRNA的功能及其在乳腺癌中发挥的作用,以筛选新的抑制乳腺癌转移的microRNA分子。方法利用脂质体2000将25种鼠源microRNA表达载体转染至4TO7细胞,经G418筛选结合流式细胞仪分选获绿色荧光细胞得稳定表达鼠源microRNA 的细胞株。将细胞2＆#215;105个/只尾静脉注射接种于BALB/C小鼠,14 d后解剖分离肺组织,统计小鼠肺组织结节数目。结果和接种阴性对照细胞小鼠相比,接种mir-449a稳转细胞的小鼠肿瘤肺转移减少。而接种 mir-1935稳转细胞的小鼠肿瘤肺转移增多。其它23种microRNA稳转细胞接种小鼠肿瘤肺转移既不增加也不减少。结论从25种鼠源microRNA中筛选到2种与乳腺癌肿瘤转移相关的microRNA：mir-449a抑制乳腺癌细胞肺转移,mir-1935则促进癌细胞肺转移。     

心肌细胞内质网应激介导APPswe/PS1dE9转基因成年小鼠发生心肌肥厚的研究

目的:探讨内质网应激在APPswe/PS1dE9转基因成年小鼠发生心肌肥厚中的作用。方法:选择APPswe/PS1dE9转基因成年小鼠及野生型(WT)成年小鼠各10只,分别为转基因实验组及对照组、野生型实验组及对照组,每组各5只,实验组背部皮下注射低剂量异丙肾上腺素(ISO)(2 mg/kg),每日1次,连续4周;对照组注射同等体积的生理盐水,4周后麻醉各组小鼠,描记体表心电图,计算心率,测量体重后处死,取出心脏,测量心脏质量及左室质量,计算左心室重量指数(LVW/BW)及全心重量比(HW/BW)。用于HE染色法测定心肌细胞病理形态学变化,应用Western Blot方法及免疫组织化学方法检测内质网应激相关蛋白即GRP78、JNK、P-JNK及CaMKⅡ的表达。结果:APPswe/PS1dE9转基因小鼠在低剂量的ISO诱导后较WT小鼠心脏明显肥大,APPswe/PS1dE9转基因实验组较转基因对照组及WT小鼠实验组及对照组HW/BW及LVW/BW显著增加(P0.05);HE染色可见APPswe/PS1dE9转基因实验组较转基因对照组及WT实验组、对照组心肌细胞直径明显变大,细胞密度变小,毛细血管密度减少,细胞间质增多,细胞间距变大。Western blot结果显示APPswe/PS1dE9转基因实验组GRP78、p-JNK及CaMKⅡ的表达较转基因对照组及WT两组明显增加(P0.05,P0.01),而转基因对照组与WT两组无明显差异。免疫组化结果显示APPswe/PS1dE9转基因实验组GRP78及CaMKⅡ蛋白在心肌细胞胞浆中表达阳性率80%,明显高于野生型实验组(40%)(P0.05),两组对照组表达均为阴性;转基因实验组p-JNK表达为90%,JNK表达为30%,其它三组均为阴性。结论:APPswe/PS1dE9转基因成年小鼠在较低剂量的ISO诱导后较WT实验组更容易出现心肌肥厚,内质网应激参与了APPswe/PS1dE9转基因成年小鼠心肌肥厚的发生。     

阿尔茨海默病中mir-222作用机制的初步研究

目的探讨mir-222在阿尔茨海默病发病机制中的作用。方法取6月龄APPswe／PSAE9小鼠脑组织,进行microRNA芯片的检测;利用real—timePCR对芯片检测结果进行验证;构建mir-222表达载体,将其转染至SH-SY5Y细胞中,转染后48小时提取蛋白检测p27kipl的表达情况。结果芯片结果显示,与野生型C57BL／6J小鼠相比,6月龄APPswe／PSAE9小鼠脑组织中mir-222表达明显下降,经real-timePCR验证,差别具有统计学意义（P=O．012）;将mir-222表达载体转染至SH—SY5Y细胞后,p27kipl表达减少。结论mir-222可能通过调节细胞周期抑制因子p27kipl的表达参与阿尔茨海默病的发生。     

阿尔茨海默病模型小鼠自主活动能力的分析

目的研究阿尔茨海默病APP/PS双转基因小鼠自主行为的改变和作为阿尔茨海默病行为特征的可行性。方法对APPswe/PSΔE9双转基因小鼠和野生鼠分别在4月龄、6月龄、8月龄进行旷场自主行为实验,并与Morris水迷宫分析进行比较,利用SPSS16.0软件统计分析。结果在4月龄、6月龄转基因小鼠的学习记忆能力、以及自主性探究性行为与野生鼠比较有明显的差异。表现为：模型鼠学习记忆能力减弱,兴奋性增高,自主活动增加。这些表现与临床患者的症状有许多相似性,8月龄时,差异减小。结论APPswe/PSΔE9双转基因小鼠的自主行为学表现为烦躁不安,自主活动增加,与阿尔茨海默病患者的临床表现有许多相似之处,可作为小鼠模型判别的行为标志之一,在阿尔茨海默病的病因病机研究和药物研发等方面具有一定的应用价值。     

APP／PS双转基因阿尔茨海默病小鼠模型的老年斑及行为学动态分析

目的研究APP／PS1双转基因阿尔茨海默病小鼠模型老年斑形成和行为改变的动态过程。方法将转APPswe突变基因小鼠与转PSAE9基因突变小鼠杂交,PCR鉴定APPswe／PSAE9双突变转基因小鼠的基因表型,筛选阳性小鼠建立APPswe／PS／kE9双转基因C57BL／6J小鼠模型。抗邮免疫组化、改良Bieschowsky银染法、Thioflavin-S荧光分别动态检测3、4、5、6、9、12月龄APPswe／PSAE9双转基因小鼠大脑病理改变。荷兰Noldus公司EthovisionXT监测分析软件动态观察3、6、9月龄的APPswe／PSAE9双转基因小鼠Morris水迷宫行为学改变。利用SPSS16．0软件统计分析。结果建立了人APPswe／PSAE9双转基因阿尔茨海默病小鼠模型。3月龄APP／PS1双转基因小鼠大脑组织抗Aβ1—17免疫组织化学、改良Bieschowsky银染法、Thioflavin—S荧光未检测到有明显老年斑形成。4．5月龄APPswe／PSAE9双转基因小鼠大脑组织上述三种方法均可检测到老年斑。9、12月龄双转基因小鼠老年斑数量体积明显增加,出现与阿尔茨海默病患者较相似的老年斑改变。Morris水迷宫试验发现3、6、9月龄APPswe／PSAE9双转基因小鼠行为学结果与同月龄野生型小鼠有差异,说明与同月龄野生型小鼠相比出现记忆学习能力缺陷（P〈0．05）。结论成功建立了人APPswe／PSAE9双转基因小鼠阿尔茨海默病模型,为阿尔茨海默病发病机制研究和药物研发提供了有价值的动物模型。     

柚皮苷及其与吴茱萸碱联合用药对APP~（swe）/PS~（ΔE9）转基因痴呆模型小鼠学习记忆能力的影响

目的探讨柚皮苷及柚皮苷与吴茱萸碱联合用药对APPswe/PSΔE9转基因痴呆模型小鼠学习记忆能力的影响,研究柚皮苷与吴茱萸碱联合使用是否具有协同或叠加作用。方法 APPswe/PSΔE9转基因痴呆模型小鼠随机分组,每组12只,雌雄各半,分别选择在3月龄和5月龄两个时间段开始进行治疗,各给药组按设定剂量分别单独或联合加入鼠粮中。3月龄给药16周、5月龄给药4周后进行水迷宫实验,以安理申作为阳性药对照,并与安慰剂组小鼠进行比较。Thioflavin-S荧光染色检测单独使用柚皮苷治疗转基因小鼠脑组织老年斑的形成。结果单独使用柚皮苷4周和16周,缩短寻找平台的潜伏期分别为22%、32%;单独使用吴茱萸碱4周和16周,缩短寻找平台的潜伏期分别为33%、10%。柚皮苷治疗16周减少海马老年斑26%。柚皮苷与吴茱萸碱联合应用能够显著缩短寻找平台的潜伏期47%。结论单独使用柚皮苷或吴茱萸碱均能改善痴呆模型小鼠的学习记忆能力,柚皮苷长期的使用优于短期的治疗效果,但是吴茱萸碱短期有效,长期作用反而下降;柚皮苷与吴茱萸碱联合应用能够显著改善APPswe/PSΔE9痴呆模型小鼠的学习记忆能力,但联合用药组并未表现出强于单独给药组的协同保护效应。     

靶向细胞外基质磷酸糖蛋白的microRNA的筛选及鉴定

目的:寻找靶向细胞外基质磷酸糖蛋白(MEPE)基因的微小RNA(miRNA),并检测其对人HeLa细胞内源性Mepe基因表达的影响。方法:通过NCBI检索人源Mepe的3’UTR,利用miRNA预测工具TargetScan预测可能靶向Mepe的所有miRNA,通过双萤光素酶报告基因系统检测miRNA与Mepe3’UTR的结合情况,从而初步筛选出可能靶向Mepe的miRNA;同时,用Western印迹检测miRNA经转染后对Mepe基因表达的影响。结果:利用TargetScan预测出36条可能靶向Mepe的miRNA,根据分值及匹配情况从中挑选出6条进行验证;与转染空载体pGL3-cm的相对荧光素值相比,转染miR-376a的相对荧光素值降低较为明显,而当Mepe3’UTR与miR-376a结合位点突变后,miR-376a不能抑制萤光素酶的活性;Western印迹结果显示miR-376a能明显抑制MEPE的表达。结论:miRNA-376a可能是靶向Mepe基因的miRNA,为进一步研究MEPE的功能奠定了基础。