七种常见宠物二级抗体的制备和HRP标记

目的制备兔抗7种中国家庭中常见宠物的二级抗体,并进行辣根过氧化酶标记,为宠物血清学检测系统的建立提供工具。方法利用饱和硫酸铵沉淀法粗纯抗体后,再利用protein A 或protein G亲和层析的方法进一步纯化宠物的IgG,免疫大耳白兔制备抗血清,利用免疫双扩散来检测抗血清的效价,并用Protein A亲和层析的方法来纯化兔抗宠物的二级抗体,采用简易过碘酸钠法对纯化的兔抗宠物的二级抗体进行HRP标记,通过ELISA方法测定标记抗体的效价,并利用Western blotting考察标记抗体的特异性。结果纯化了狗、家猫、豚鼠、金仓鼠、松鼠、花鼠和龙猫7种宠物的血清IgG,免疫双扩散法测定兔抗这7种宠物的抗血清效价均达到1：32,并对纯化的兔抗7种宠物的二级抗体进行了HRP标记,ELISA测定标记抗体的效价达到1：（2000～15000）左右,Western blots显示标记抗体具有很好的特异性。结论成功制备了HRP标记的兔抗7种中国家庭中常见宠物的二级抗体,为宠物血清学检测体系的建立提供了工具。     

九种重要经济动物二级抗体的制备和HRP标记

目的制备兔抗9种重要经济动物的二级抗体,并进行辣根过氧化酶标记,为经济动物血清学检测系统的建立提供工具。方法利用饱和硫酸铵沉淀粗纯抗体后,再利用protein A或protein G亲和层析的方法进一步纯化动物血清IgG,免疫大耳白兔制备抗血清,利用免疫双扩散来检测抗血清的效价,并用Protein A亲和层析的方法纯化兔抗经济动物的二级抗体,采用简易过碘酸钠法对纯化的二级抗体进行HRP标记,通过ELISA方法测定标记抗体的效价,并利用Western blotting考察标记抗体的特异性。结果纯化了家猪,绵羊、山羊、牛、马、驴、狐狸、貉和黑貂9种重要经济动物的血清IgG,免疫双扩散法测定兔抗血清效价均达到1：32,并对纯化的兔抗家猪,绵羊、山羊、牛、马、驴、狐狸、貉和黑貂9种重要经济动物二级抗体进行了HRP标记,ELISA测定标记抗体的效价达到1：（2000～15000）左右,Western blots显示标记抗体具有很好的特异性。结论成功制备了HRP标记的兔抗9种重要经济动物的二级抗体,为经济动物血清学检测体系的建立提供了工具。     

十六种鸟类二级抗体的制备和辣根过氧化物酶标记

目的制备兔抗16种鸟类的二级抗体,并进行辣根过氧化物酶标记,为鸟类血清学检测系统的建立提供工具。方法采用水稀释法粗纯抗体后,再利用改良的饱和硫酸铵分级沉淀法,或亲和层析结合饱和硫酸铵沉淀法,或饱和硫酸铵沉淀法结合SDS-PAGE凝胶切胶纯化的方法进一步纯化鸟类的IgY,利用纯化的IgY免疫大耳白兔制备抗血清,用免疫双扩散来检测抗血清的效价,并用Protein A亲和层析的方法来纯化兔抗鸟类的二级抗体,采用简易过碘酸钠法对纯化的兔抗鸟类的二级抗体进行辣根过氧化物酶标记,通过ELISA方法测定标记抗体的效价,并利用Western blots考察标记抗体的特异性。结果纯化了灰雁、鸬鹚、鸵鸟、小鹈、鸽子、鹅、孔雀、鹌鹑、贵妃鸡、草鹭、夜鹭、赤嘴潜鸭、燕鸥、长脚鹬、虎皮鹦鹉、翘鼻麻鸭等16种鸟类的IgY,免疫双扩散法测定兔抗这16种鸟类的抗血清效价均达到1∶32,并对纯化的兔抗灰雁IgY、兔抗鸬鹚IgY、兔抗鸵鸟IgY、兔抗小鹈IgY、兔抗鸽子IgY、兔抗鹅IgY、兔抗孔雀IgY、兔抗鹌鹑IgY、兔抗贵妃鸡IgY、兔抗草鹭IgY、兔抗夜鹭IgY、兔抗赤嘴潜鸭IgY、兔抗燕鸥IgY、兔抗长脚鹬IgY、兔抗虎皮鹦鹉IgY、兔抗翘鼻麻鸭IgY等16种兔抗鸟类IgY的二级抗体进行了辣根过氧化物酶标记,ELISA测定标记抗体的效价达到1∶800～80000左右,Western blots显示标记抗体具有很好的特异性。结论成功制备了辣根过氧化物酶标记的兔抗16种鸟类的二级抗体,为鸟类血清学检测体系的建立提供了工具。     

蝙蝠血清IgG的纯化及兔抗蝙蝠IgG酶标抗体的制备

目的纯化蝙蝠血清IgG,制备兔抗蝙蝠IgG酶标抗体。方法采用亲和层析纯化法纯化蝙蝠血清IgG,SDS-PAGE电泳鉴定蝙蝠IgG纯度。免疫大白兔制备兔抗蝙蝠IgG抗血清,免疫双扩散法测定抗血清效价,亲和层析纯化法纯化抗血清IgG。用改良过碘酸钠标记法制备兔抗蝙蝠IgG酶标抗体,直接ELISA和Western blot法对兔抗蝙蝠IgG酶标抗体进行工作浓度测定。结果纯化的蝙蝠血清IgG,其SDS-PAGE测定纯度大于95%;免疫大白兔所制备的抗血清免疫双扩散效价为1∶64;用改良过碘酸钠标记法制备兔抗蝙蝠IgG酶标抗体,其直接ELISA和Western blot工作浓度分别为1∶12800和大于1∶2000。结论制备了蝙蝠血清IgG的抗血清和酶标抗体,为蝙蝠的血清学检测体系提供了技术和资源储备。     

兔抗五种鱼免疫球蛋白抗体的制备和HRP标记

目的制备兔抗鱼类免疫球蛋白抗体并进行辣根过氧化酶标记,为鱼类血清学检测系统的建立提供工具。方法利用proteinA亲和层析的方法纯化鱼血清免疫球蛋白,免疫大耳白兔制备抗血清,利用免疫双扩散来检测抗血清的效价,并用Protein A亲和层析的方法来纯化兔抗鱼免疫球蛋白的抗体,采用简易过碘酸钠法对纯化的兔抗鱼免疫球蛋白的抗体进行HRP标记,通过ELISA方法测定标记抗体的效价,并利用Western blotting来考察标记抗体与其他常见鱼类血清蛋白间的交叉反应。结果纯化了鳙、鲤、乌鳢、黄鳝、鲈五种鱼血清免疫球蛋白,免疫双扩散法测定兔抗这五种鱼免疫球蛋白的抗血清效价均达到1∶32,并对纯化的兔抗鳙、鲤、乌鳢、黄鳝、鲈五种鱼类免疫球蛋白的抗体进行了HRP标记,ELISA测定标记抗体的效价达到1∶10000左右,Western blots显示标记抗体与部分其他鱼类免疫球蛋白之间存在不同程度的交叉反应。结论成功制备了HRP标记的兔抗鱼类免疫球蛋白抗体,为鱼类血清学检测体系的建立提供了工具。     

兔抗金黄地鼠酶标抗体的制备及应用

目的 纯化金黄地鼠血清IgG,制备兔抗金黄地鼠酶标抗体(IgG-HRP),开展金黄地鼠仙台病毒的初步检测.方法 采用亲和层析纯化法纯化金黄地鼠IgG,用SDS- PAGE电泳测定IgG纯度并制备兔抗金黄地鼠IgG抗体(second antibody,Ab2);用免疫双扩散法检测抗血清效价后,再用亲和层析纯化抗血清IgG( Ab2);采用改良过碘酸钠标记法制备兔抗金黄地鼠酶标抗体( rabbit anti-hamster IgG-HRP);用直接ELISA和Western-blot法对兔抗金黄地鼠IgG酶标抗体进行工作浓度测定;应用金黄地鼠酶标抗体对金黄地鼠仙台病毒进行酶免检测(IEA).结果 金黄地鼠血清IgG纯度达95％;兔抗金黄地鼠IgG抗体(Ab2)免疫双扩散效价为1(:)64;兔抗金黄地鼠IgG -HRP经直接ELISA和Western-Blot测定工作浓度分别为1∶5000和1∶2000;酶免(IEA)效价为1:2000.结论 高效快速纯化了金黄地鼠IgG,制备了金黄地鼠IgG-HRP,为金黄地鼠病原微生物的血清学检测提供了条件.     

黄鳝IgM的分离纯化及兔抗黄鳝IgM抗血清的制备

目的 分离纯化黄鳝血清免疫球蛋白,制备其兔抗血清,并检测抗血清的特异性。方法 用Protein A亲和层析的方法纯化黄鳝血清免疫球蛋白,通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋白的纯度,免疫大耳白兔制备抗血清,利用免疫双扩散检测抗血清的效价,通过western blotting检测抗血清的特异性。结果 纯化了黄鳝血清免疫球蛋白,免疫双扩散法测定兔抗黄鳝免疫球蛋白血清效价为1∶32,western blotting结果显示抗血清具有很好的特异性。结论 成功纯化了黄鳝免疫球蛋白,制备了兔抗黄鳝IgM抗血清,为建立黄鳝的血清学检测系统奠定了基础。     

貉血清IgG纯化及抗血清的制备

目的 制备高纯度貉血清IgG和兔抗貉IgG抗血清,作为建立多种动物抗体检测技术的储备。方法 采用Hitrap Protein A亲和层析及盐析再沉淀法纯化貉血清IgG,通过PAGE电泳和Western-Blot免疫印迹法对IgG作纯度及免疫活性检测;常规免疫法制备兔抗貉IgG血清。结果 貉血清IgG与Protein G虽有较强的结合力,但同时也结合血清中其他杂蛋白;用二步纯化法可从5 mL貉血清中纯化IgG约7 mg,电泳和免疫印迹测定显示,IgG纯度大于95%,常规免疫法制备抗血清免疫双扩散效价达1∶32。结论 建立了可行的貉血清IgG的纯化方法和高效价的兔抗貉血清IgG抗血清,为貉血清IgG二级抗体酶联物的制备储备了资源。     

三种鸡形目雉科禽类卵黄抗体的纯化及二抗的制备

目的 纯化三种鸡形目雉科的禽类孔雀、鹌鹑、贵妃鸡的卵黄抗体IgY,并且免疫家兔制备抗血清。方法 采用了水稀释法,HiTrap IgYPurification HP免疫亲和层析法和硫酸铵沉淀法纯化IgY。免疫家兔制备抗血清,免疫双扩散法测定效价。Protein-A亲和纯化兔抗IgY血清IgG。结果 经亲和纯化和盐析纯化,得到了孔雀、鹌鹑、贵妃鸡的卵黄抗体IgY,经SDS-PAGE检测为电泳纯,孔雀、鹌鹑、贵妃鸡的卵黄抗体IgY的相对分子质量约为180×10^3。免疫后经Protein-A亲和纯化后获得了兔抗IgY的IgG。结论 证实了孔雀、鹌鹑、贵妃鸡的卵黄抗体IgY的存在及其特性。雉科鸡形目禽类卵黄抗体的纯化方法 相似,可以推广到鸡形目其它禽类的卵黄抗体的纯化中,获得的抗血清可以进一步进行标记和今后抗原的检测。     

乌鳢血清免疫球蛋白IgM的分离纯化及其兔抗血清的制备

目的 分离纯化乌鳢血清免疫球蛋白,并制备其兔抗血清。方法 用Protein A亲和层析的方法纯化乌鳢血清免疫球蛋白,通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋白的纯度,测定其重链、轻链的分子量,免疫大耳白兔制备抗血清,利用免疫双扩散检测抗血清的效价。结果 纯化了乌鳢血清免疫球蛋白,SDS-PAGE测定其重链和轻链的相对分子质量分别为78×10^3和27×10^3左右,免疫双扩散法测定兔抗乌鳢免疫球蛋白抗血清效价为1∶32。结论 成功纯化了乌鳢免疫球蛋白,制备了兔抗乌鳢IgM抗血清,为研究乌鳢的免疫机制、建立乌鳢的血清学检测系统奠定了基础。     

人copineV蛋白多克隆抗体的制备

目的：制备兔抗人copineV多克隆抗体。方法：将copineV N端423bp（626-1048bp）构建到原核表达载体pET28a（＋）,转化大肠杆菌BL21（DE3）,在IPTG诱导下进行蛋白表达;以镍柱纯化后的蛋白为抗原,与等体积佐剂混合后免疫家免3次;用ELISA和Western印迹检测抗血清,用（NH4）2SO4沉淀法初步纯化抗体。结果：表达并纯化了copineV N端蛋白,ELISA检测表明抗血清具有高亲和性,Western印迹检测表明抗体能特异性识别内源性和过表达的copineV。结论：制备了具有高亲和性和特异性的抗人copineV多克隆抗体。     

采用杆状病毒/昆虫表达系统纯化蛋白制备抗hUTP14a多克隆抗体

为制备兔抗人hUTP14a多克隆抗体并鉴定其抗体的特异性,本研究通过杆状病毒/昆虫表达系统制备并纯化Flag-hUTP14a-his蛋白,免疫新西兰家兔。ELISA方法检测免疫兔的抗血清滴度达到1∶10~5(体积比)时取血清,并通过Protein A免疫亲和层析柱纯化抗体。在人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)中过表达Flag-hUTP14a,或用小干扰RNA(small interference RNA, siRNA)沉默内源的hUTP14a蛋白表达后,提取细胞总蛋白质。经Western印迹分析制备的多克隆抗体的特异性;通过细胞免疫化学染色、细胞免疫荧光、免疫组织化学染色和免疫沉淀(immunoprecipitation, IP)实验对hUTP14a抗体的特异性进行鉴定。研究证实,制备的抗hUTP14a多克隆抗体能够特异性识别内源及外源表达的hUTP14a蛋白。该抗体可以用于细胞免疫荧光、细胞免疫化学染色、免疫组织化学染色、Western印迹及免疫沉淀等技术,为进一步研究hUTP14a的生物学功能提供了特异性抗体。     

单克隆抗体与多克隆抗体配对ELISA方法比较

以人绒毛膜促性腺激素(HCG)为抗原,制备出对HCG的多克隆抗体和特异性单克隆抗体,并进行抗体纯化和特性分析,利用辣根过氧化物酶(HRP)分别对其进行了标记.采用双抗夹心ELISA试验,探讨了多克隆抗体与单克隆抗体配对的若干事项.结果表明,利用单克隆抗体和酶标多克隆抗体配对,并用含动物血清的稀释液稀释酶标抗体,可实现对检测原的高特异性和高灵敏度检测.