犬细小病毒单克隆抗体的制备及其与免疫血清在血凝抑制中的比较

将用犬细小病毒免疫的ＢＡＬＢ／ｃ小鼠的脾细胞与Ｓｐ２／０骨髓瘤细胞在聚乙二醇作用下融合,经筛选、克隆,得到６株稳定分泌犬细小病毒单克隆抗体的杂交瘤。用杂交瘤腹水作血凝抑制试验,检测分别含有犬细小病毒、猫泛白细胞减少症病毒和水貂肠炎病毒的标本,及ＣＰＶ感染犬粪便标本,并与免疫血清作对比。结果表明,用单克隆抗体作血凝抑制试验,比用免疫血清作具有特异性高、操作简便省时等优点,而二者敏感性一致。     

湖北猪场猪细小病毒的首次分离与鉴定

猪细小病毒是引起初产母猪繁殖障碍的主要病因之一,许多国家从初产母猪的流产、死产及木乃伊化胎儿中分离到猪细小病毒。我们从湖北省某猪场的初产母猪流产、死产及木乃伊化胎儿中分离到两株病毒。研究表明,它们可在PK15,Hela、BHK及Vero传代细胞系和胎猪肾、婴兔肾等原代细胞上产生特征性的细胞病变:对豚鼠红血球有血凝作用;对脂溶性溶剂不敏感,对热和酸有较强的抗性:对胰蛋白酶处理不受影响。对DNA合成抑制剂5—FVDR敏感。电镜观察发现这两株病毒大小为20nm左右,呈球形。两株病毒能被标准的细小病毒阳性血清中和。回感豚鼠,成功地从死产胎儿胎盘中收获到该病毒。按照国际病毒学分类原则,我们将这两株病毒鉴定为猪细小病毒,填补了湖北猪细小病毒的研究空白。     

猪细小病毒分子生物学研究进展

猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)是引起母猪繁殖障碍的主要病原之一,研究发现该病毒在进化史上相对保守,对宿主专一性高,但近年来相继发现的PPV2和PPV香港株(Porcine HoKovirus,PHoV)与PPV差异较大,对PPV、PPV2和PHoV的基因组结构、分子进化研究、复制培养现状及其蛋白表达方面研究进行了简单综述,为猪细小病毒多样性研究提供参考。     

抗细小病毒B19-VP2单克隆抗体的建立

制备抗细小病毒B19－VP2单克隆抗体,用于检测人血清中的B19抗原,辅助诊断相关疾病;也可用于制备人类细小病毒基因工程疫苗。用纯化的基因工程表达的B19－VP2蛋白免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞和小鼠骨髓瘤Sp2/0细胞融合,有限稀释法克隆细胞。ELISA及IF证明抗体特异性。克隆筛选出4株细胞,并初步建立了检测B19－VP2抗原的双抗体夹心酶联免疫吸附试验,为双抗体夹心法检测B19抗原为临床相关疾病诊断提供了检测手段。     

巨细胞病毒单克隆抗体的建立和应用

应用人巨细胞病毒(CMV)AD169株免疫BALB/C小鼠,取脾细胞与SP 2/0小鼠骨髓瘤细胞融合,得到4株(12H、3H、47C和6H)能分泌单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞。其中47C株McAb(滴度≥512 000)经辣根过氧化物酶标记,能与细胞培养中的AD169株和Davis株CMV发生特异性核内染色反应。14份出现CMV典型病变的临床阳性标本中,12份呈明显的阳性反应,另2份为弱阳性反应,而对正常细胞及感染其它病毒的细胞均无染色反应,说明该McAb具有较好的特异性。用于鉴定分离的毒株,一天内可出结果,比中和试验快速、简便。     

猪细小病毒结构蛋白VP1和VP2的基因免疫研究

利用真核表达载体pCIneo和pcDNA3.1( )分别构建了含有猪细小病毒VP1基因的pCIneo VP1和含有VP2基因的pCIneo VP2与pcDNA VP2三种真核表达质粒。将上述三种真核表达质粒分别转染ＩＢＲＳ－２细胞,利用间接ELISA检测表达情况,结果表明上述三种质粒均能在ＩＢＲＳ－２细胞表达,表达产物位于细胞中。在此基础上,利用这三种质粒分别以肌内注射的方式,间隔2周2次免疫小鼠,结果发现所有表达质粒均能诱导产生明显的细胞免疫和体液免疫,其中pCIneo VP1质粒诱导的体液免疫最强,与猪细小病毒灭活疫苗免疫组相当,pCIneo VP2诱导的细胞免疫应答强于PPV灭活组,pCIneo VP1和pCIneo VP2联合免疫并没有加强作用。     

应用套式PCR检测猪细小病毒

从猪细小病毒基因组的ＶＰ２基因上,选择两对引物进行套式聚合酶链反应体外扩增,产物经２％ａｇａｒｏｓｅ凝胶电泳和生物素标记的探针鉴定。证实具有特异性,敏感性实验证明,大套式ＰＣＲ能检测到１ ＴＣｉＤ５０的病毒量,在临床上应用方法能从不同的组织样品和粪便中检测出猪细小病毒,具有很高的敏感性。     

猪细小病毒LDR-PCR检测方法的建立和应用

为准确特异灵敏地检测猪细小病毒(PPV),建立一种新的LDR-PCR方法。首先在病毒的保守区内设计一对LDR探针,LDR探针两端各连有一段引物对应序列,以连接产物为模板进行PCR,琼脂糖凝胶电泳检测结果。以标准质粒为模板,通过对LDR反应的退火温度、连接酶浓度及探针浓度等反应条件进行优化,确定了LDR最佳的反应体系,并建立了LDR-PCR方法。结果表明,可以特异地检测PPV,与猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒(PCV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)无交叉反应;最低检测限为102个拷贝。利用建立的方法对41例临床样本进行检测,14份样品PPV阳性,与普通PCR检测结果符合率为97.6%。     

猪细小病毒vp2基因的表达和类病毒颗粒的构建

利用PCR方法从病毒基因组中获得了vp2完整的编码区并经测序后克隆到原核表达载体pET-32(a)上.在大肠杆菌中诱导表达了VP2与Trx-His-S Tag的融合蛋白,通过免疫家兔获得了高特异性的兔抗血清.另外,将vp2克隆到pFastBacDUAL载体上,利用昆虫表达系统,即AcMNPV的Bac-to-Bac系统对vp2进行了表达,经SDS-PAGE和Western blot分析,表达产物为64kD,并且该蛋白能在昆虫细胞中形成类病毒颗粒.     

表达猪细小病毒VP2蛋白的重组猪伪狂犬病毒在小鼠体内的免疫反应

为了研制出能够同时预防猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)和猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)的二联活疫苗,本研究将PPV VP2基因克隆到伪狂犬病毒通用转移质粒pG中,构建重组伪狂犬转移质粒pGVP2。利用脂质体转染法将重组质粒pGVP2和PRV HB98弱毒株DNA共转染至猪睾丸(ST)细胞,使其在ST细胞内发生同源重组,经5次绿色荧光空斑纯化重组病毒rPRV-VP2。分别用重组病毒rPRV-VP2、亲本PRV HB98弱毒株、商品化PPV灭活苗和DMEM细胞培养液免疫6周龄雌性昆明小鼠,2周后进行二免。一免后第7周用PRV强毒NY株对小鼠进行攻毒。结果获得表达VP2基因的重组病毒rPRV-VP2,经ELISA试验、血清中和试验(SN)、血凝抑制试验(HI)和流式细胞检测发现,重组病毒rPRV-VP2株可有效刺激小鼠机体产生抗PPV和PRV抗体,同时具有增强小鼠机体细胞免疫反应的能力,且对PRV强毒攻击具有保护作用。结果表明,重组病毒rPRV-VP2可作为同时预防PPV和PRV感染的重组疫苗候选株。     

Application of GP5 Protein to Develop Monoclonal Antibody against Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus

In this study,a panel of monoclonal antibodies (mAbs) against Porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV),named as 8C9 and4B4,were produced by fusing SP2/0 myeloma cells and spleen cells of BALB/c mice immunized with the PRRSV (TCID50=5.5),screened by the indirect ELISA and subjected to several limiting dilutions.mAbs were then identified by biological characterization.Among the two fusion cell strains,8C9 belonged to the IgG1 subclass and 4B4 belonged to the IgG2a subclass.The titers in cell...     

猪细小病毒核酸疫苗的构建及其对小鼠免疫原性的研究

将猪细小病毒VP2基因克隆至pCI-neo真核表达载体中,构建了pCIneo-VP2重组质粒,转染至PK-15细胞中,利用免疫荧光方法检测在体外表达情况;并以小鼠为动物模型,将pCIneo-VP2、pCI-neo重组质粒、猪细小病毒活疫苗和对照组通过肌肉注射进行免疫,检测免疫小鼠的淋巴细胞转化功能,特异性CTL杀伤活性和血清抗体滴度。结果显示,pCIneo-VP2在体外能够诱导PK-15细胞表达VP2蛋白,小鼠注射pCIneo-VP2质粒 1周后能够诱导机体产生抗体,4周时达到峰值,与活疫苗对照组产生的抗体滴度、诱导T淋巴细胞增殖和诱导强的细胞毒性基本一致。试验表明,构建的pCIneo-VP2能够有效诱导机体产生体液免疫和细胞免疫,为研制出高效、新型猪细小病毒疫苗提供了科学依据和试验依据。     

猪生长激素及其单克隆抗体的制备与纯化

本文介绍一种简便快捷提纯猪生长激素的方法。通过杂交瘤技术,首次获得抗猪生长激素的单克隆抗体,并讨论和比较从腹水纯化单克隆抗体的各种方法。     

单核细胞增生李斯特菌单克隆抗体的制备与鉴定

以单核细胞增生李斯特菌细胞碎片免疫BALB/c小鼠,间接ELISA法成功筛选获得2株稳定分泌抗LM的单克隆杂交瘤细胞株4A7、4H11.抗体效价为1∶160 000以及1∶20 000,亚型为IgG1、IgG2a,Dot-ELISA结果表明4A7和4H11单克隆抗体具有很好的属特异性,Western blot分析表明4A7、4H11抗体分别与单核细胞增生李斯特菌62 kDa以及32 kDa外膜蛋白抗原表位结合,胶体金免疫电镜实验进一步确证以上抗体可有效识别单核细胞增生李斯特菌细胞表面抗原.     

兔支气管败血波氏杆菌单克隆抗体的制备及鉴定

目的建立能稳定分泌抗兔支气管败血波氏杆菌（Bb）的单克隆抗体杂交瘤细胞株,为今后进一步建立该菌的免疫检测技术奠定基础。方法以Bb分离株BLJ05的灭活菌液为免疫原,腹腔免疫BALB/c小鼠,采用常规杂交瘤技术制备Bb单克隆抗体（McAb）,用间接ELISA、Western-blot等方法对McAb特性进行鉴定。结果获得两株能稳定分泌抗Bb单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为A7D5和D6B2,其小鼠腹水抗体效价分别为1∶409600和1∶102400;且不与兔大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、产气荚膜梭菌等兔的常见病原菌反应,特异性强。两株单抗亲和力实验表明A7D5亲和力略高于D6B2。ELISA相加试验表明它们针对相同的抗原表位。结论成功建立了两株能稳定分泌抗兔支气管败血波氏杆菌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,效价高、特异性强,为今后建立该菌的免疫检测技术建立奠定了基础。     

一氧化氮对猪细小病毒体外增殖的影响研究

本文研究了来源于不同前体物的一氧化氮(Nitro oxide,NO)对猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)体外增殖的影响.结果表明,NO前体物S-硝基-N-乙酰青霉胺(SNAP)、L-精氨酸(L-Arg)均能够有效地诱导PK-15细胞产生NO,进而显著地抑制PPV在PK-15细胞上的复制,其效果与前体物的浓度呈正相关,在浓度为100μmol/L和200μmol/L时,SNAP产生NO的能力与抑制病毒复制的作用要强于L-Arg.在病毒感染前6 h和3 h添加SNAP或L-Arg对病毒复制的抑制作用比在病毒感染后3 h和6 h添加的作用强,表明NO的抗病毒作用主要发生在病毒感染的初始阶段.此外,添加具有抑制L-Arg产生NO作用的N-硝基-L-精氨酸(L-NNA)能抵消L-Arg体外抗病毒的作用.     

抗传染性犬肝炎病毒单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备传染性犬肝炎病毒单克隆抗体。方法将用纯化的犬腺病毒1型（CAV-1）免疫的BALB／c小鼠脾细胞与SP2／0细胞在聚乙二醇作用下融合,通过酶联免疫吸附试验（ELISA）和免疫酶试验（1EA）筛选,以有限稀释法克隆3次,制备单克隆抗体,并对制备完成的单克隆抗体进行生物学鉴定。结果成功得到2株能稳定分泌抗CAV-1的单克隆抗体杂交瘤细胞,命名为1B、2H3,经鉴定其亚型分别为IgG2a和IgG2a,2株均为kappa链。腹水的ELISA效价可达10^7-10^8,IEA效价可达1：2560—1：5120。该单克隆抗体与CPV、CDV、FPV、CCV病毒无交叉反应。结论成功制备了抗CAV-1单克隆抗体,为进一步建立相关诊断方法奠定了基础。     

Preparation and Characterization of Monoclonal Antibodies to Serotonin Binding Protein

Serotonin binding protein (SBP) is a constituent of the synaptic vesicles of serotonergic neurons. Two types of SBP, with molecular masses of 45 kDa and 56 kDa, have been purified. To determine whether there are shared epitopes between the two forms of SBP, we raised and tested for cross-reactivity monoclonal antibodies (MAbs) against each form of SBP. We obtained 12 MAbs, all of which recognize both forms of SBP. Hybridoma clones were produced by fusing P3 X 63Ag8.653 mouse myeloma cells with spleen cells from a mouse that had been immunized with 45-kDa or 56-kDa SBP. Culture supernatants were screened for the presence of anti-SBP antibodies. MAb isotypes were determined by immunodiffusion, using immunoglobulin type-specific antisera. Each antibody to SBP consisted of only a single subclass of immunoglobulin (IgM). We obtained 12 MAbs, each of which interacted with both forms of SBP, as judged by enzyme-linked immunosorbent assay and immunoblot analysis. Ascites fluid to one clone (44-10) was obtained and affinity-purified. In the presence of goat anti-mouse IgM, the partially purified 44-10 antibodies quantitatively immunoprecipitated SBP from crude brain extracts. Immunoblotting revealed two major bands corresponding to 45 kDa and 56 kDa and a minor band corresponding to 68 kDa. MAb 44-10 blocked the binding of [3H]serotonin ([3H]5-HT) to 45-kDa and 56-kDa SBP in a concentration-dependent manner. The 68-kDa protein was found to bind [3H]5-HT. Sites reacting with MAB 44-10 were located immunocytochemically in sections of rat brain.(ABSTRACT TRUNCATED AT 250 WORDS)     

人宫颈癌基因蛋白单克隆抗体的制备、鉴定及初步应用

目的:制备人宫颈癌基因蛋白单克隆抗体并初步用于肝癌血清检测。方法:重组表达HCCR-1蛋白胞外区(第167th-360th氨基酸)进行动物免疫,用含有HCCR蛋白抗原表位的融合蛋白筛选阳性克隆。通过ELISA、Western Blot、免疫组化鉴定抗体性质,并用于肝癌血清样本检测。结果:获得3株抗人HCCR蛋白单克隆抗体,其中B3抗体特异性、灵敏度较好。ELISA结果表明B3只识别GST-HCCRep蛋白和His-HCCR蛋白,与其他蛋白没有交叉反应;B3可检测到10 mg/L的GST-HCCRep蛋白;B3抗体亲和力常数Kaff=1.86×107(L/mol);Western Blot结果表明该抗体可识别天然HCCR蛋白;免疫组化检测表明肝癌组织中有HCCR蛋白表达而正常组织中未见表达;肝癌患者血清HCCR阳性率达到75%。结论:成功制备了HCCR单克隆抗体,为建立新的肝癌早期诊断方法奠定了基础。     

猪流行性腹泻病毒单克隆抗体及其抗原表位的研究进展

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(PED virus,PEDV)引起的一种严重危害养猪生产的常见疫病。近年来,由于新的PEDV变异毒株的出现,许多国家的养猪业遭受了巨大的经济损失。PEDV也因此受到更多关注,关于PEDV的研究报道也日渐增多。基于国内外有关PEDV的最新研究进展,本文系统归纳和分析了PEDV结构蛋白和非结构蛋白单克隆抗体以及单克隆抗体识别的特异性抗原表位,以期为开发鉴别诊断方法和表位疫苗等提供信息。