昆虫几丁质酶的研究进展

综述了几丁质酶的特性,生理作用,基因结构和表达及其在植物保护和基因工程中的应用。     

转β-1,3-葡聚糖酶基因和几丁质酶基因棉花

为了提高棉花的抗枯、黄萎病的能力,用花粉管通道法,将烟草β-1,3-葡聚糖酶基因和菜豆几丁质酶基因导入棉花,获得了抗卡那霉素的转化植株。经PCR、PCR－Southern Blot检测,证明两种基因已插入到棉花基因组中。     

转几丁质酶基因黑杨的获得

以G1黑杨幼叶为外植体建立了组织培养高频再生体系 ,对传统的农杆菌介导法进行了改进 ,用来自于菜豆的几丁质酶基因 (CH5B)进行转化 ,经PCR和PCR Southern杂交鉴定 ,证实CH5B基因已整合入G1黑杨核基因组中。     

几丁质酶及其研究进展

本文从几丁质酶的分布、发育调节、可诱导性、分子生物学及抗病基因工程等方面近年来的进展进行了综合论述,并对其进一步的应用提出展望。     

几丁质酶的研究进展

几丁质是自然界中含量仅次于纤维素的第二大类多糖,已从各种细菌、真菌、植物、哺乳动物和昆虫中分离并鉴定出来。随着近年来对几丁质及其衍生物的了解,发现此类多糖的物理化学特性在现实中有非常广泛的应用。几丁质酶是一类分解几丁质的酶,广泛分布于细菌、真菌、植物、哺乳动物、昆虫等物种中,并发挥着重要作用。近年来国内外工作者对这些不同来源的几丁质酶做了深入研究,为其在医学和农业上更广泛的应用提供理论基础。     

谈谈植物中的几丁质酶

几丁质酶及其底物几丁质均广泛存在于自然界.由于几丁质酶及其降解产物在生物学、医学、化学、农业及环境科学等方面的潜在价值而越来越受到重视.着重介绍了几丁质酶的作用原理,植物的几丁质酶基因,植物中几丁质酶的特性以及几丁质酶在植物中的作用和在转基因植物中的应用.     

微生物几丁质酶研究进展

微生物几丁质酶不仅在生物降解几丁质方面起着重要作用,而且可通过水解病原真菌的细胞壁而有效地抑制其生长。到目前为止,人们已经分离和克隆出了大量的微生物几丁质酶及其基因。尽管这些几丁质酶各不相同,但它们却具有类同的蛋白质结构域:信号肽、催化结构域和几丁质结合结构域等。本文着重介绍几丁质酶的结构和分子特征、表达和调控机理,并且分析了该酶的应用前景。     

细菌几丁质酶研究进展

真菌病害是影响作物产量的重要原因 ,而几丁质酶能有效抑制其生长、水解其细胞壁。对研究较多的细菌几丁质酶及几丁质酶基因的分子生物学研究进展进行了综述 ,并对细菌几丁质酶基因利用存在的问题进行了探讨。     

杆状病毒几丁质酶基因结构与功能的研究进展

杆状病毒几丁质酶基因是杆状病毒的非必需基因,是高度保守的基因。该基因在杆状病毒复制晚期表达产生几丁质酶,该酶N端具信号肽,中部是酶的活性区,C端是酶的内质网结合区。杆状病毒几丁质酶同时具有内切和外切几丁质酶活性,主要功能是水解昆虫体内的组成型几丁质。杆状病毒几丁质酶对于虫体液化是必需的,同时它还是原组织蛋白酶(pro-V-Cath)的分子伴侣,并与病毒侵染机制相关联。杆状病毒的几丁质酶基因与细菌的几丁质酶基因可能源于共同的祖先。     

失活 ChiA 和 v-cath 基因的重组BmNPV 表达 hGM-CSF

利用 DNA 同源重组技术使家蚕核型多角体病毒的多角体蛋白基因取代 v-cath 、 ChiA 两基因的部分编码区域和共同的启动子区域,获得了 v-cath 、 ChiA 两基因同时失活的、可形成多角体的、并能表达人粒细胞 - 巨噬细胞集落刺激因子的重组病毒 BmNPVpolh+CP－ChiA－GMCSF+. 研究结果显示： v-cath 、 ChiA 两基因的失活不影响病毒的复制及多角体的形成,但感染细胞的存活时间比野生病毒感染的多 2 天,可明显改善外源基因在培养细胞和家蚕中的表达水平;感染 BmNPV polh+CP－ChiA－GMCSF+的家蚕幼虫体表保持正常,无野生病毒感染后引起的破皮流脓现象 .     

苏云金杆菌几丁质酶新基因的筛选和全长基因的扩增

以煮沸冻融法制备PCR扩增模板,利用苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）几丁质酶基因特异引物进行15个Bt血清变种的扩增分析,获得9个几丁质酶全长基因扩增产物。经克隆和序列测定,从Bt serovar.entomocidus HD109、Bt serovar canadensis HD224、Bt serovar、alesti HD16和Bt serovar.toumanoffi HD201等4个菌株中分离了几丁质酶新基因。     

转番茄几丁质酶基因西瓜植株的获得及其抗病性研究

构建了以CaMV35s启动子驱动的含有番茄几丁质酶基因（Chi3）的植物表达载体,通过冻融法导入根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株EHAl05中。用叶盘法转化西瓜（Citrullus lanatus）栽培种“中育1号”,通过PCR、Southern blot和RT-PCR鉴定,表明外源基因已成功整合到西瓜基闪组中,并获得表达。利用尖孢镰刀菌西瓜专化型进行的转基因植株叶片粗提液抑菌效果检测,表明转基因植株的抗病性均有一定程度的增强。     

大白菜几丁质酶CHB4基因的表达研究

根据本研究组已克隆的大白菜ClassⅣ类几丁质酶基因序列设计引物,通过RT-PCR反应扩增得到该几丁质酶成熟肽基因CHB4,构建原核表达载体pET-CHB4,利用IPTG诱导表达并对诱导表达参数进行优化,SDS-PAGE分析表明,该基因表达的蛋白分子量为28 kD左右,其表达产物主要以包涵体的形式存在,25℃并没有改变表达蛋白的可溶性,而在pH9.5的培养基条件下,诱导表达产物的上清液中却有重组蛋白条带出现。以酵母菌为指示菌做抑菌圈实验,结果显示IPTG浓度为0.6 mmol/L时抑菌效果最明显。几丁质酶的活力测定结果表明,当IPTG浓度为0.6 mmol/L时,几丁质酶活力达到最大值2.8 U/mL。     

电脉冲穿孔法将几丁质酶基因导入巨大芽胞杆菌

为了探索适宜于巨大芽胞杆菌电脉冲转化条件,将带有沙雷氏菌几丁质酶编码基因的穿梭质粒转化到植病生防菌—巨大芽胞杆菌B1301中。以芽胞杆菌B1301对数期细胞为感受态细胞,采用不同的电击转化条件进行转化,通过转化率和几丁质酶活性表达认为巨大芽胞杆菌的最佳电击转化条件为电压1000 V/mm,电容25μF,电阻400Ω,转化率为9.6×104/μg质粒,几丁质酶活性表达的菌株几率为41.67%。     

将菜豆几丁酶基因导入苹果砧木的研究

以苹果砧木八楞海棠（Ｍａｌｕｓｍｉｃｒｏｍａｌｕｓ）为实验材料,用微束激光穿刺法将菜豆几丁酶基因导入苹果叶片,成功地获得了转基因植株。实验结果表明,以苗龄２６天的小苗上部刚展开的叶片再生频率可达１００％。经高渗缓冲液预处理后用激光微束穿刺导入外源ＤＮＡ可得到较高的转化频率。在１５０个再生叶片中经卡那霉素筛选得到２５株绿苗,经ＰＣＲ扩增检测,３株呈阳性结果,表明外源几丁酶基因已整合到苹果的基因组ＤＮＡ中。     

环状芽孢杆菌C-2几丁酶基因的克隆

环状芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｕｓｃｉｒｃｕｌａｎｓ）Ｃ２总ＤＮＡ经ＰｓｔＩ部分酶切后分离２～１０ｋｂ的片段,插入质粒ｐＵＣ１９的ＰｓｔＩ位点,转化大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）,利用几丁质平板从约８０００个重组子中筛选到一个几丁酶基因阳性克隆（命名为ｐＣＨＴ１）。用１２种限制酶对重组质粒进行的酶切分析表明,重组质粒中的插入片段长３０ｋｂ,其中各有一个ＫｐｎＩ,ＳａｃＩ和ＳｓｐＩ位点。把该克隆片段反向插入ｐＵＣ１９的ＰｓｔＩ位点所得到的重组子同样具有几丁酶基因表达活性,说明此片段含有一个完整的几丁酶基因,其自身的启动子能被大肠杆菌转录系统所识别。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交证实了该片段来自于Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓＣ２基因组,且以单拷贝形式存在,它不能与来自于其它７株几丁酶产生菌的总ＤＮＡ杂交。     

谷子花粉介导法转几丁质酶基因的研究

以晋谷21号A不育系材料为受体,以西粒pGLⅡ-RC-1为供体,在10%浓度的蔗糖溶液中,加入花粉与含有质粒DNA,应用YKH-1型液体快速混合器进行震荡处理得到花粉处理液,然后辅以人工授粉的方法将花粉处理液滴入晋谷21号不育系的柱头上获得种子,将F1的种子经除草剂筛选和PCR检测,有目的基因特异带出现,实践证明,利用花粉介导法进行谷子几丁质酶基因转移方法可行,为谷子转基因提供了一个新方法。     

粘质沙雷氏菌几丁质酶chiB基因的克隆与序列分析

采用改进的方法提取粘质沙雷氏菌基因组DNA,通过PCR扩增,得到大小为1 500 bp特异性DNA片段(chiB基因),以pUC18质粒构建了pUC-ch iB克隆载体,转化至感受态细胞E.coliDH5α培养,并筛选出重组质粒。经测序分析,证明克隆片段与文献报道相一致。