用表达T7RNA聚合酶细胞系拯救麻疹病毒微复制子

构建稳定表达T7RNA聚合酶的细胞系,用于提高拯救麻疹病毒微复制子效率.PCR扩增T7RNA聚合酶基因,克隆到真核表达载体,转染Vero细胞,用G418筛选到稳定表达的细胞株Vero/pcDNA3-T7.用Westernblotting证明了T7RNA聚合酶在细胞中的表达.将T7启动子控制绿色荧光蛋白表达的质粒转染该细胞后,绿色荧光蛋白在细胞株中得到表达.反向插入报告基因的微复制子转染感染麻疹病毒的Vero/pcDNA3-T7细胞后,细胞中能够检测到报告基因的表达.用细胞系取代痘苗病毒系统,可以提高拯救效率.     

表达绿色荧光蛋白的重组鸡传染性支气管炎病毒的构建

为探讨鸡传染性支气管炎病毒(IBV)作为载体表达外源基因的可行性,本研究根据IBV H120疫苗株的全基因组序列设计引物,采用RT-PCR方法分10个片段对其基因组进行扩增,并克隆至pMD19-T载体中;同时构建IBV基因组5a基因编码区被增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因替换的重组质粒。采用体外拼接策略,将BsaI酶切处理的10个基因片段顺序连接,构建5a基因编码区被EGFP基因替换的基因组全长cDNA,其5’端具有完整的T7 RNA聚合酶启动子核心序列,3’端具有polyA尾巴结构。然后通过T7 RNA聚合酶体外转录系统合成病毒基因组RNA,脂质体转染BHK-21细胞进行病毒拯救。结果表明成功的从基因组全长cDNA拯救出重组病毒H120-5a/EGFP株,其在鸡胚中能有效的复制和传代,并表达绿色荧光蛋白;5a基因的缺失并不影响病毒对鸡胚的致病性。本研究为进一步开展IBV的分子致病机理、载体疫苗等研究奠定了基础。     

T7 RNA聚合酶表达系统的真核化及其偶联表达系统的建立

为了使T7RNA聚合酶(T7RNAP)表达系统真核化,首先,利用两种方法建立能够表达T7RNAP的真核细胞:(1)共转染表达T7RNAP的真核表达重组质粒于靶细胞;(2)利用稳定表达T7RNAP的BHK-21细胞系。然后,将FMDV内部核糖体进入位点(IRES)序列和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因定向克隆进原核载体pET-40a-c( )的T7启动子下游,得到的重组质粒pIERS-EGFP-E。用该质粒分别转染上述两种细胞,在紫外显微镜下都能够观察到绿色荧光,表明真核化的T7RNAP偶联表达系统建立。并利用流式细胞仪对偶联表达水平进行了分析。这为利用该系统真核高效表达外源蛋白奠定了坚实的基础。用实验证明了FMDV5′端含有IERS具有介导非帽依赖性的翻译的功能,为以IERS为基础的双顺反子表达系统的建立及深入研究IERS与相关蛋白的功能奠定了基础。T7RNAP偶联表达体系是一种良好的外源基因表达体系。     

利用脊髓灰质炎病毒5＇NCR和RNA聚合酶基因可提高外源基因表达

将含脊髓灰质炎病毒(PV)RNA聚合酶的不同长度基因片段克隆到载体pSG5质粒上,分别构建了4个表达RNA聚合酶的质粒.体外转录实验证明,pSG5-POL1.99和pSG5-POL2.03质粒转染细胞的提取物促进了特异的RNA转录,表明两质粒可表达RNA聚合酶.将PV的5＇NCR序列插在载体pGREEN LANTERN-1的CMV启动子下游,构建了pGREEN LANTERN-1-5＇NCR质粒;用LacZ基因替换GFP基因分别插入到PGREEN LANTERN-1和pGREEN LANTERN-1-5＇NCR质粒上,构建成 pLacZ LANTERN-1和pLacZ LANTERN-1-5＇NCR质粒.表达RNA聚合酶的质粒与pLacZ 5＇NCR调控表达报告基因的质粒共转染,明显提高了报告基因的表达水平,表明PV的表达调控元件和RNA聚合酶基因可用于构建外源基因高效表达载体.     

转录病毒载体介导的稳定表达口蹄疫病毒3D基因的BHK21细胞系的建立

[目的]研究口蹄疫病毒RNA聚合酶在BHK-21细胞中的稳定表达状况,为研究RNA聚合酶生物学活性及其基囚工程疫苗研制提供科学依据.[方法]从重组质粒pMD18-T-3D扩增口蹄疫病毒3D基因,通过分子克隆技术构建莺组逆转录病毒表达载体pBPSTR1-3D.用pBPSTR1-3D和pVSV-G双质粒瞬时转染GP2-293包装细胞,收获重组逆转录病毒,然后感染BHK-21细胞,嘌呤霉素持续筛选12 d后获得阳性克隆,并用有限稀释法挑选单个阳性细胞克隆.[结果]应用PCR、RT-PCR技术可从体外反复传代的阳性细胞中扩增到3D基因,证实目的外源基因能转录并被稳定整合进宿主细胞基因组中.经SDS-PAGE、Western blot、间接免疫荧光检测到在不同代次的阳性细胞中有目的蛋白表达.[结论]本试验利用逆转录病毒载体介导的基因转移技术,将外源基因插入到靶细胞的基因组中,构建了稳定表达口蹄疫病毒RNA聚合酶的包装细胞系,为研究3D基因表达及其蛋白定位提供了方便,也为下一步研究RNA聚合酶生物学功能和疫苗研制提供了科学依据.     

利用重组噬菌体诱导表达的大肠杆菌表达系统

将编码噬菌体T7RNA聚合酶的基因克隆至噬菌体M13mpl8RFDNA中,置于lac启动子的控制之下,得到了可表达T7 RNA聚合酶的重组噬菌体M13HEP。利用该噬菌体感染含T7启动子表达质粒的宿主菌以提供T7RNA聚合酶,可以诱导T7启动子控制下的外源基因的表达。该噬茵体诱导表达系统已成功地表达了多种外源基因,特别是一些表达产物对宿主菌有毒性的基因。同时,通过细菌接合将F',因子从大脑杆菌XL1-blue转至大肠杆菌HMS174,构建了新的大脑杆菌菌株HMSl74F,,使得T7表达质粒构建、表达及单链制备可以在同一菌株中完成,得到了一个完整的T7表达系统。     

噬菌体T7溶菌酶基因的克隆

以Pbr322及含有噬菌体T7 RNA聚合酶强启动子φ10的Pbr322衍生物作为克隆载体,经限制内切酶AvaⅡ+HaeⅢ切割的一段噬菌体T7 DNA片段分别克隆到Pbr322及其衍生质粒的BamHⅠ位点上。插入的DNA片段为632碱基对。该片段包括噬菌体T7基因3．5和T7 RNA聚合酶弱启动子φ3．8的全部编码序列。已知噬菌体T7基因3．5的功能为产生噬菌体T7溶菌酶,利用氯仿处理检测带有重组质粒的转化子胞内溶菌酶活力。证明两种克隆株整体细胞中,均有溶菌酶存在。用10一20％SDS-聚丙烯酰胺凝肢电泳检查噬菌体T7基因3．5蛋白带,结果表明T7基因3．5在Pbr322衍生质粒中的表达优于Pbr322。     

利用脊髓灰质炎病毒5'NCR和RNA聚合酶基因可提高外源基因表达

将含脊髓灰质炎病毒 (PV)RNA聚合酶的不同长度基因片段克隆到载体 pSG5质粒上 ,分别构建了 4个表达RNA聚合酶的质粒。体外转录实验证明 ,pSG5 POL1 99和 pSG5 POL2 0 3质粒转染细胞的提取物促进了特异的RNA转录 ,表明两质粒可表达RNA聚合酶。将PV的 5'NCR序列插在载体 pGREENLANTERN 1的CMV启动子下游 ,构建了 pGREENLANTERN 1 5'NCR质粒 ;用 LacZ基因替换GFP基因分别插入到PGREENLANTERN 1和pGREENLANTERN 1 5'NCR质粒上 ,构建成 pLacZLANTERN 1和 pLacZLANTERN 1 5'NCR质粒。表达RNA聚合酶的质粒与 pLacZ 5'NCR调控表达报告基因的质粒共转染 ,明显提高了报告基因的表达水平 ,表明PV的表达调控元件和RNA聚合酶基因可用于构建外源基因高效表达载体。     

慢病毒GV115-AIF siRNA 重组表达系统的构建及鉴定

目的:构建高效的慢病毒GV115-AIF si RNA重组表达系统。方法:根据目的基因AIF以及RNA干扰序列设计原则,利用设计软件设计了3个可能的AIF si RNA序列。应用全基因合成技术和亚克隆技术构建GV115-AIF si RNA重组质粒,并采用聚合酶链反应技术(PCR技术)和基因测序技术对GV115-AIF si RNA重组质粒鉴定。利用GV115病毒包装辅助p Helper 1.0质粒和p Helper 2.0质粒进行病毒包装。病毒包装后转染人胚肾293T细胞,通过应用逆转录定量PCR技术(RT-PCR技术)检测转染后对人胚肾293T细胞中AIF基因的敲减效率,筛选最高效的AIF si RNA基因序列。结果:GV115-AIF si RNA质粒PCR鉴定显示位于341bp附近的条带。测序结果与设计的基因序列完全吻合。3个可能的AIF si RNA序列中基因敲减效率最高的可达到88.3%。结论:成功构建高效的慢病毒GV115-AIF si RNA重组表达系统。     

One step engineering of T7-expression strains for protein production: increasing the host-range of the T7-expression system

The T7-expression system has been very useful for protein expression in Escherichia coli. However, it is often desirable to over-express proteins in species other than E. coli. Here, we constructed an inducible broad-host-range T7-expression transposon, which allows simple one-step construction of T7-expression strains in various species, providing the option to over-express proteins of interest in a broader host-range. This transposon contains the T7 RNA polymerase driven by the lacUV5 promoter, which is repressed by the lac-repressor. Leaky expression is prevented by the presence of T7-lysozyme on this construct. The complete T7-expression system is flanked by mariner transposon repeats of the suicidal R6Kgammaori plasmid, pBT20-Deltabla. Stable integration of the whole system is possible by a one-step selection for a Flp-excisable Gm(R)-marker. We showed the engineering of E. coli, Pseudomonas aeruginosa, Erwinia carotovora, Salmonella choleraesuis, Agrobacterium tumefaciens, and Chromobacterium violaceum strains with this construct and demonstrated the expression of the Burkholderia pseudomallei Asd protein in these hosts, by induction with isopropyl-beta-d-thiogalactopyranoside (IPTG).     

T7启动子-11碱基突变对转录影响的研究

T7噬菌体启动子能被T7RNA聚合酶和真核生物RNA聚合酶Ⅱ系统启动转录 ,为研究两个系统转录的关键碱基 ,将合成的T7噬菌体启动子 1 1变异体与报道基因CAT基因连在一起。体内CAT和体外狭缝RNA杂交实验显示 : 1 1碱基是T7RNA聚合酶和真核生物RNA聚合酶Ⅱ系统启动T7启动子的关键碱基之一。     

Electrostatic map of T7 DNA: comparative analysis of functional and electrostatic properties of T7 RNA polymerase-specific promoters

The entire T7 bacteriophage genome contains 39937 base pairs (Database NCBI RefSeq N1001604). Here, electrostatic potential distribution around double helical T7 DNA was calculated by Coulomb method using the computer program of Sorokin A.A. (lptolik@gmail.com). Electrostatic profiles of 17 promoters recognized by T7 phage-specific RNA polymerase were analyzed. It was shown that electrostatic profiles of all T7 RNA polymerase-specific promoters can be characterized by distinctive motifs which are specific for each promoter class. Comparative analysis of electrostatic profiles of native T7 promoters of different classes demonstrates that T7 RNA polymerase can differentiate them due to their electrostatic features.     

工程菌噬菌体T7溶菌酶的纯化和性质

用崔道珊等构建的噬菌体T7溶菌酶工程菌株,培养物经超声破碎和DE52,CM52柱层析纯化,我们得到电泳纯的T7溶菌酶,分子量为17000,最适反应pH为8.0.其热稳定性欠佳,保温37℃,5min即丧失酶活21%.     

原核表达系统T7RNA聚合酶/启动子在真核细胞中表达目的基因的实验研究

将目前高表达水平强大的原核表达系统之一T7 RNA聚合酶/启动子表达系统通过一系列改进引入真核细胞.通过转染真核细胞实验表明,采用真核启动子CMV调控T7 RNA聚合酶的表达和在T7启动子下游插入EMCV IRES序列两种解决方案能使该原核表达系统在真核细胞高效表达目的基因,且能适应不同的真核细胞环境,是一良好的细胞类型非依赖的表达体系.     

T7家族噬菌体感染宿主菌的起始——吸附和穿入

噬菌体和细菌互相作用的研究,是分子生物学的重要内容,在细菌感染性疾病的治疗等方面有重要的应用价值。噬菌体的感染从噬菌体吸附于宿主菌表面并将核酸注入开始。介绍了T7家族代表株T7噬菌体在吸附和穿入阶段需要的结构和具体过程,并简要综述了T7家族3个亚群的特征。     

Mutation of Phe102 to Ser in the carboxyl terminal helix of Escherichia coli thioredoxin affects the stability and processivity of T7 DNA polymerase

Processivity of T7 DNA polymerase relies on the coupling of its cofactor Escherichia coli thioredoxin (Trx) to gene 5 protein (gp5) at 1:1 stoichiometry. We designed a coexpression system for gp5 and Trx that allows in vivo reconstitution of subunits into a functional enzyme. The properties of this enzyme were compared with the activity of commercial T7 DNA polymerase. Examination of purified enzymes by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis revealed that the thioredoxin subunit of the two enzymes did not comigrate. To our surprise, we identified a mutation (Phe102 to Ser) in the Trx component from the commercial T7 DNA polymerase (gp5/TrxS102) that was not in the enzyme from the coexpression system (wild type gp5/Trx). A comparison of polymerase activity of the T7 DNA polymerases shows that both enzymes possessed similar specific activity but they were different in their residual activity at 37 degrees C. The half-life of gp5/TrxS102 was 7 min at 37 degrees C and 12 min for gp5/Trx. gp5/TrxS102 polymerase activity was reduced by fourfold with 3'-5' exonuclease activity as the prominent activity detected after 10 min of heat inactivation at 37 degrees C. Supplementation of reaction mixtures containing gp5/TrxS102 with exogenous nonmutant thioredoxin restored the enzyme activity levels. Pulse proteolysis was used to demonstrate that TrxS102 unfolded at lower urea concentrations than wild type thioredoxin. Thus, Ser substitution at position 102 affected the structural stability of thioredoxin resulting in a reduced binding affinity for gp5 and loss of processivity.