TFIID在配子发生和早期胚胎发育过程中的作用

配子发生以及胚胎早期发育过程受严格且有序的基因表达调控。多种转录因子与靶基因结合,激活基因的时空特异性表达,实现受精卵全能性的获得,完成母型基因组转录调控向合子基因组转录调控的转变以及随后胚胎细胞的分化调节。研究表明,TFIID转录因子家族在这些关键阶段起重要作用,在基因转录调节的起始阶段,TFIID转录因子家族成员作为通用转录因子被招募到靶基因的启动子上,与其他转录因子共同形成转录前起始复合物,起始转录。该文总结了TFIID转录因子的结构、作用方式,以及在配子发生和早期胚胎发育中的调控作用。     

母型-合子型过渡的研究进展

母型-合子型过渡,是许多动物胚胎发育的一个重要时期。在这一时期,大批合子型基因开始转录,胚胎发育由母型因子调控转为合子型基因调控,细胞周期逐步加长,细胞分裂不再同步。这些变化对于保证早期胚胎顺利过渡到后期发育阶段至关重要。目前母型-合子型过渡的分子机制还不是很清楚,但研究表明,启动母型-合子型过渡的因素主要集中在以下几个方面,如核质比、周期蛋白和周期蛋白依赖性激酶、DNA复制/损伤检测点、DNA结构的改变以及母型因子的降解和一些合子型基因的转录等。现主要对母型-合子型过渡的特征以及启动母型-合子型过渡的机制作一简要综述。     

母型mRNAs及其功能

早期的胚胎发育是受母型基因调控(Mat-crnal regulation)的,有关的发育信息按母型mRNAs形式被早期胚胎继承下来,并由这些mRNAs衍生的蛋白质调控发育过程,直至合子型基因被活化,过渡为合子型调控(Zygoticregulation,Paternal regulation)。所以母型信息的存在形式和功能,母型mRNAs的翻译     

兔胚胎时期特异性基因相关新片段的克隆

阶段特异性基因的表达是早期胚胎发育过程中的重要事件,对植入前胚胎基因表达模式的研究是进一步研究植入前胚胎发育调控机制的前提。本实验利用mRNA差异显示技术来研究兔(Oryctolagus cuniculus domestica)植入前各期胚胎的基因表达差异。在获得的42个阳性阶段特异性表达的基因中,有5个在NCBI和EMBL数据库中没有同源序列,登录EMBL,申请了登录号。这些新基因片段都是桑葚期特异表达的基因,而且在以后的囊胚期也有表达。兔由母源型调控向合子型调控的过渡是在8～16细胞期开始的,在桑葚期开始表达的这些基因片段应该是兔胚胎时期特异性基因。这些基因的克隆将为进一步研究兔的植入前胚胎发育模式奠定基础。     

组蛋白甲基化修饰酶与早期胚胎发育

早期胚胎发育是胚胎发育中细胞分裂与分化最为活跃的时期,也是合子型基因大规模转录的时期,而此时组蛋白的甲基化修饰也显示出动态学的变化。这一时期,在细胞内外信号的共同调控下,经历着一系列基因的激活与抑制,许多调控机制参与其中的调控。而近年来的研究表示,表观遗传学调控显示越来越重要的作用。组蛋白甲基化修饰是表观遗传学重要调控机制之一,在胚胎的早期发育过程中扮演着重要的角色。就近年来组蛋白甲基化修饰酶在早期胚胎发育过程中的作用与功能做一简要综述。     

小鼠胚胎ZGA中的基因表达及调控机制

哺乳动物早期胚胎发育的关键事件之一就是合子型基因激活,它决定着胚胎的正常发育与否。早期ZGA的起始必须依赖于源自母亲的母型蛋白,而这些蛋白的翻译后修饰过程,尤其是蛋白质磷酸化过程在ZGA中起重要作用。在小鼠中,伴随2细胞胚胎的形成,ZGA发生时选择性激活基因往往需要增强子的作用。由于合子钟以及2细胞胚胎期的转录抑制环境的影响,避免了那些应该在胚胎发育后期表达的基因的成熟前表达,使它们能按正确的发育时空顺序被选择性激活。目前,已经发现了在ZGA初期被激活的一些合子型基因,诸如hsp70、eIF-4C、U2afbp-rs等,对它们的研究已有了新的进展。     

核因子Y在细胞衰老中的作用

核因子Ｙ(ｎｕｃｌｅａｒｆａｃｔｏｒＹ ,ＮＦ Ｙ)也称作ＣＢＦ(ＣＣＡＡＴｂｏｘｂｉｎｄｉｎｇｆａｃｔｏｒ)、ＣＰ1 ,是结合ＣＣＡＡＴ盒的转录因子。它能识别真核基因启动子区域的 5′ ＣＴＧＡＴＴＧＧＹＹＲＲ 3′或 5′ ＹＹＲＲＣＣＡＡＴＣＡＧ 3′共有序列。有功能的ＮＦ Ｙ是一个异源三聚体蛋白 ,它包含三个不同的亚单位Ａ、Ｂ、Ｃ。细胞衰老是由细胞分裂的次数决定的。控制细胞分裂的机制之一是调控Ｇ1 /Ｓ期的基因表达。当细胞衰老时 ,由于Ｇ1 /Ｓ基因调控的转变 ,细胞不能进入Ｓ期而只停留在Ｇ1期。ＮＦ Ｙ正是通过与Ｇ1 /Ｓ…     

mRNA差异显示技术在动物早期胚胎发育相关基因研究中的应用

动物从卵裂开始的早期胚胎发育始终伴随着ｍＲＮＡ不断的合成与降解。最初受着受精卵内母体ｍＲＮＡ的控制。当这些ｍＲＮＡ在发育过程中逐渐被降解时,有些动物（如小鼠）在比较早的时期已有新基因的转录;而有些动物（如鱼类、两栖类）迟到囊胚中期以后,合子核的基因才开始转录新的ｍＲＮＡ。ｍＲＮＡ这种有规律的代谢活动控制着细胞的分化、胚层的形成以及模式形成（ｐａｔｅｒｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）。所有这些ｍＲＮＡ水平上的变化都可以用ｍＲＮＡ差异显示法（ｍＲＮＡｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｌｄｉｓｐｌａｙ）检测出来并进而获得与早期胚胎发育有关的基因。ｍＲＮＡ差异显示法是由Ｌｉａｎｇ和Ｐａｒｄｅｅ于１９９２年建立起来的,用于显示两种不同组织之间ｍＲＮＡ差异的方法。基于绝大多数ｍＲＮＡ有一个ｐｏｌｙ（Ａ）尾巴,选用一个较特殊的３’端引物─５’Ｔ１１ＭＮ３’,其中Ｍ可以是ｄＡＴＰ,ｄＣＴＰ,ｄＧＴＰ之一,而Ｎ可以是ｄＡＴＰ,ｄＴＴＰ,ｄＣＴＰ,ｄＧＴＰ之一,进行逆转录时,１／１２的ｍＲＮＡ可被逆转录为ｃＤＮＡ。这种ｃＤＮＡ第一链被用来ＰＣＲ扩增,所使用的３’端引物与逆转录引物相同,而５’端引物为１０个碱基的一段寡核苷酸,这类任意（ａｒｂｉｔｒａｒ     

银鲫转录调控因子lbh-b cDNA克隆与表达分析

Lbh (Limb-bud and heart)基因是脊椎动物中高度保守的转录调控因子, 在早期胚胎发育及某些人类疾病的发病过程中发挥着重要作用。我们前期在银鲫(Carassius gibelio)垂体转录组中筛选到一个在垂体中大量表达的基因lbh-b。为了进一步研究lbh基因在银鲫的表达特征, 首先采用RACE方法克隆了银鲫lbh基因家族的成员lbh-b基因(Cglbh-b)。Cglbh-b的cDNA全长1526 bp, 开放阅读框549 bp, 共编码182个氨基酸。生物信息学分析表明CgLbh-b蛋白与其他脊椎动物的Lbh蛋白同源性在68%以上, 可能也是无序蛋白质家族的成员之一。成体组织RT-PCR分析表明Cglbh-b仅在银鲫的垂体、端脑、卵巢及眼睛中表达。不同胚胎发育时期的表达分析表明, 在受精卵至原肠胚中Cglbh-b转录产物是以母源形式存在的mRNA, 其合子转录起始于尾芽期。胚胎整体原位杂交结果显示从受精后2d到受精后3d, Cglbh-b大量表达于脑和眼睛。此外, 随着卵子成熟Cglbh-b在银鲫垂体中的表达上调。这些结果暗示, Cglbh-b可能在调控银鲫脑和眼睛的发育以及卵子成熟过程中发挥着重要作用。     

动物胚胎发育早期母源性基因表达研究进展

动物早期胚胎发育是由贮存在受精卵内的母源性mRNAs和蛋白质控制的：卵母细胞成熟过程中母源性基因(maternal gene)表达并贮存产物．主要是由RNA和包装蛋白组成的RNP(ribonucleoprotein)颗粒．其中Y—box结合蛋白是主要的包装成分．它不仅参与了RNA的包装,并可能与RNP的亚细胞定位有关．卵子受精激发贮存的mRNA翻译并调节第一次卵裂。翻译起始因子eIF4E及其结合蛋白4E—BP(4E—binding protein)参与第一次卵裂的调节。母源性基因指导受精卵最初的数次卵裂．合子基因在随后的胚胎发育中起调控作用、母源性基因Tumorhead(TH)的表达产物TH蛋白能够影响所有卵裂球的增殖,而合子表达的TH蛋白具有外胚层特异性。     

优化外源基因在大肠杆菌中表达的翻译起始率的策略和方法(英文)

ｍＲＮＡ的翻译起始区（ＴＩＲ）的二级结构对翻译起始率有很大的影响。本文建立了一种改进外源基因在大肠杆菌中翻译起始率的系统。以人分裂细胞核抗原（ＰＣＮＡ）基因为模型,将ＰＣＮＡ基因５′端编码区的１１４ｂｐ的顺序插入质粒ｐＴＺ１９Ｒ中ＬａｃＺ′的５′端构成融合基因。用定点突变法在ＰＣＮＡ的ＡＵＧ的８位插入一个Ｓｈｉｎｅ／Ｄａｌｇａｒｎｏ（ＳＤ）顺序ＧＡＧＧＴ,再以合成的带部分随机序列寡核苷酸作引物,用ＰＣＲ法在ＳＤ顺序两侧,即ＳＤ上游６个碱基和ＳＤ与ＡＵＧ之间７个碱基,进行随机突变,它们与结构基因５′端序列形成各种可能的翻译起始区（ＴＩＲ）二级结构。重组质粒转化大肠杆菌株ＪＭ１０９（ＤＥ３）,５′ＰＣＮＡ－ｌａｃＺ′ｍＲＮＡ可通过诱导表达Ｔ７ＲＮＡ聚合酶而得到专一而有效的转录。通过在Ｘ－ｇａｌ板上蓝色筛选以及随后的杂交鉴定,共得到２６９个５′ＰＣＮＡ－ｌａｃＺ′融合质粒。从中选择８个不同蓝色的重组子进行β－ｇａｌ活性测定,结果表明它们的酶活性相差在２０倍以上。而ＲＮＡ点杂交表明它们在转录水平无明显的差异。由此提示,通过此策略和方法能得到一个在大肠杆菌中能高效表达的翻译起始区。     

银鲫pou2基因在胚胎发育过程中的时空表达图式

用RACE-PCR方法从原肠期SMART文库中扩增到银鲫pou2基因的全长cDNA,其全长为2421bp,开放阅读框为1416bp,编码471个氨基酸,与斑马鱼pou2基因的氨基酸序列一致性高达91.0%。我们用RT-PCR和整体原位杂交的方法研究了银鲫pou2基因在胚胎发育过程中的时空表达图式。RT-PCR结果显示,银鲫pou2基因有母源转录本,其合子基因在高囊胚期强烈表达,在50%下包期和90%下包期也有高量的转录本,但在100%下包期表达量急剧降低,至体节期时已经完全检测不到其转录本。胚胎整体原位杂交结果显示其母源转录本在所有的胚盘细胞中。在高囊胚期和50%下包期,高度表达的合子转录本仍在所有的胚盘细胞中,但至90%下包期时,pou2的表达向胚胎背部的正中线汇聚,集中在神经板的两侧区域和脑部的两条横向条带。在100%下包期时,pou2的表达集中在神经板的中间区域以及预期形成的中后脑区域。至体节期时,转录本消失,这与RT-PCR结果高度一致。银鲫pou2基因的表达图式提示该基因在胚胎发育的早期具有重要作用,它可能参与调控神经板的形成和中后脑细胞的发育命运。     

原核基因表达的调控

大部份原核基因在其天然宿主的染色体中是单拷贝的,但这些基因的产物在细胞中的分子数可由10到10~6个不等。表1列举了一些大肠杆菌基因产物在细胞中的分子数。每个基因产物的多少是基因表达与各级产物代谢之间平衡的结果,与转录起始频率,转录后加工、mRNA代谢、翻译起始频率、肽链延伸速度、翻译后加工、蛋白质的分泌和代谢等有关。这些过程的调控在很大程度上取决于基因本身的结构。     

早期胚胎发育合子基因组激活调控

动物早期胚胎发育始于分化成熟的雌雄配子经受精后重编程为全能性合子。在胚胎发育的初期,合子基因组的转录水平处于静默状态,母源物质调控占据主导地位。随着胚胎发育的进行,母源物质会经历分阶段的降解,合子基因组开始逐渐激活转录,标志着早期胚胎发育从母源性调控向合子基因组调控的转变,也称为母源-合子转换（maternal-zygotic transition,MZT）。其中一个关键的转折性事件就是合子基因组激活（zygotic genome activation,ZGA）,ZGA的正确发生对于早期胚胎发育和细胞命运决定至关重要。然而,目前对于ZGA的调控因子和具体的分子机制仍知之甚少。研究表明,ZGA在不同物种中存在较大差异,可能受到DNA甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA、染色质重塑以及ZGA相关因子等多种调控因素的影响。本文探讨了上述几种调控因素影响合子基因组激活的研究进展,对进一步研究早期胚胎ZGA的相关机制具有借鉴意义。     

猪早期胚胎发育中SOX2基因启动子活性分析

转录因子SOX2 (sex determining region Y-box2)在早期胚胎发育第一次谱系分化以及内细胞团多能性维持等方面具有重要的作用。但是目前有关SOX2基因启动子的系统研究较少,尤其是在猪(Sus scrofa)中尚无相关报道。为系统分析猪SOX2基因启动子在早期胚胎中的活性,本研究通过优化显微注射体系中绿色荧光蛋白表达载体种类和注射时间,构建了适合猪SOX2基因启动子活性分析的参照体系和显微注射体系;对猪SOX2基因翻译起始位点上游5000 bp区域进行转录因子结合位点的预测,发现该区域存在4个转录因子结合位点簇;针对上述区域设计并构建相应的缺失型SOX2基因启动子报告载体,利用建立的显微注射体系将其导入胚胎,通过mCherry荧光强度以及qRT-PCR定量分析SOX2基因启动子中不同转录因子结合位点簇对启动子活性的影响。结果表明,与全长SOX2基因启动子相比,SOX2基因翻译起始位点上游2254～2442 bp区域缺失后,猪4-细胞和8-细胞胚胎中SOX2基因启动子活性下降至17.8%,该缺失区域中仅包含两个NF-AT(nuclear factor of activated T cells)转录因子结合位点。因此,本研究结果推测猪SOX2基因启动子中NF-AT转录因子结合位点是影响猪早期胚胎SOX2基因启动子活性的关键位点。本研究为揭示猪早期胚胎发育中SOX2基因表达调控机制提供了数据支持。     

籼稻232蜡质基因转录起始位点的鉴定

Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ杂交分析和蜡质基因ｃＤＮＡ的序列分析表明水稻蜡质基因的转录本可能延伸到翻译起始密码子（ＡＴＧ）上游１２ｋｂ处。据此设计了２１Ｎｔ的寡核苷酸引物,并以籼稻２３２胚乳ＲＮＡ为模板,以引物延伸法确定籼稻２３２蜡质基因的转录起始点,籼稻蜡质基因的转录起始旁邻顺序ＣＴＣＡＣＣＡ与高等植物基因的转录起始点一致顺序ＣＴＣＡＴＣＡ仅相差１个碱基。通过顺序比较,对东乡野生稻蜡质基因中的转录起始位点的位置,以及对此两稻种中ＴＡＴＡ盒的可能顺序进行了讨论。     

斑马鱼中囊胚过渡调控机制

斑马鱼中囊胚过渡(MBT)始于受精卵的第10次卵裂,此时亦伴有细胞周期延长,分裂同步性丧失,合子型基因开始转录活化,胚胎细胞开始具备运动迁移能力等现象。斑马鱼MBT。的发生依赖于胚胎细胞的核质比,胚胎细胞周期中的G1时相则只有在合子型基因组开始被转录活化后才能出现。细胞周期检验点的激活可能也是受转录调控的,但中期检验点对DNA复制抑制状态的响应不仅在MBT前后、甚至在MBT前的不同阶段也可能有具体作用途径的差异。活化的P38蛋白在胚胎中的不对称分布是维持卵裂阶段细胞分裂同步性的关键因素。尽管大规模的合子型基因的表达发生在MBT开始后,也有少数与胚层分化有关的合子型基因是在MBT。前表达的,还有一些既有母型表达也有合子型表达的基因在MBT前后分别参与不同的信号途径来调控胚胎的发育与分化。     

p38在小鼠着床前胚胎中的表达(简报)(英文)

探讨p38 MAPK在小鼠着床前胚胎期的表达图式,并对其作用作初步分析。用免疫印迹法分析胚胎全裂解物中的p38蛋白。为考察p38在着床前发育中的作用,在胚胎培养液中添加p38专一性抑制剂SB203580。此外对同位素标记的胚胎作双向电泳分析,示踪ZGA(zygotic gene acti-vation,合子型基因激活)标志物TRC的表达情况。在卵母细胞中能检测到低水平的p38蛋白,而在合子中的检测度更低,表明p38是贮存于卵母细胞内的母型转录物,自减数分裂期随其它母型转录物一起逐步降解。到2细胞中期p38蛋白的表达量开始恢复,在4细胞时达到顶峰,在8细胞时又跌落。p38蛋白在2到4细胞期的表达量上升提示该蛋白在小鼠着床前胚胎发育中可能发挥一定作用。经与p38抑制剂SB203580共培养后的2细胞中期胚胎中仍能清晰检测到TRC,因而以TRC为标志的ZGA对SB203580不敏感。SB203580同样不能阻止胚胎发育到桑椹胚期。     

p38在小鼠着床前胚胎中的表达（简报）

探讨p38 MAPK在小鼠着床前胚胎期的表达图式,并对其作用作初步分析。用免疫印迹法分析胚胎全裂解物中的p38蛋白。为考察p38在着床前发育中的作用,在胚胎培养液中添加p38专一性抑制剂SB203580。此外对同位素标记的胚胎作双向电泳分析,示踪ZGA(zygotic gene activation,合子型基因激活)标志物TRC的表达情况。在卵母细胞中能检测到低水平的p38蛋白,而在合子中的检测度更低,表明p38是贮存于卵母细胞内的母型转录物,自减数分裂期随其它母型转录物一起逐步降解。到2细胞中期p38蛋白的表达量开始恢复,在4细胞时达到顶峰,在8细胞时又跌落。D38蛋白在2到4细胞期的表达量上升提示该蛋白在小鼠着床前胚胎发育中可能发挥一定作用。经与p38抑制剂SB203580共培养后的2细胞中期胚胎中仍能清晰检测到TRC,因而以TRC为标志的ZGA对SB203580不敏感。SB203580同样不能阻止胚胎发育到桑椹胚期。     

羟基脲促进HEL细胞分化机制的研究

以往研究表明, 用羟基脲诱导人红白血病细胞（ＨＥＬｃｅｌｌ）后, 能促进成年型β珠蛋白基因表达, 使ＨＥＬ细胞趋向终末分化。本文试图进一步揭示羟基脲诱导ＨＥＬ细胞分化的分子机制。ＧＭＳＡ 与Ｗｅｓｔｅｒｎ 印迹分析结果显示, 随着羟基脲诱导ＨＥＬ 细胞时间延长, 细胞核内的ＧＡＴＡ１ 转录因子的含量增加, 它与β珠蛋白基因５＇旁侧ＤＮＡ 序列内一个正调控序列（ＰＣＲ：－ ２２３～－ １９４ ｂｐ） 以及人工合成的ＧＡＴＡＤＮＡ 序列结合能力增加; 与此相反,细胞核内的ＧＡＴＡ２ 转录因子的含量下降, 它与ＧＡＴＡＤＮＡ 序列结合能力也下降。此外, 还检测到在羟基脲诱导ＨＥＬ细胞后, 核内与ＹＹ１ 类似的一个转录因子含量也迅速下降。实验结果表明ＧＡＴＡ２ 可能在红系细胞早期分化中起重要作用, 而ＧＡＴＡ１ 则在红系细胞终末分化过程中起调控作用。推测类似ＹＹ１ 的一个转录因子可能具有抑制ＨＥＬ细胞趋向终末分化的功能