利用甘油发酵耦联生产3-羟基丙酸及1,3-丙二醇重组菌的构建及筛选

在肺炎克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae)代谢甘油生产1,3-丙二醇(1,3-PD)的过程中,为了减少有毒中间产物3-羟基丙醛(3-HPA)的积累,可将其转化为3-羟基丙酸(3-HP),从而实现1,3-丙二醇和3-羟基丙酸的联产。克隆来自于酿酒酵母的NAD+依赖型的乙醛脱氢酶(ALDH)的基因aldh4,构建了表达载体pKP-aldh,转化K.pneumoniae,得到了有效表达乙醛脱氢酶的重组肺炎克雷伯杆菌(K.pneumoniae A+)。在此基础上,使用紫外诱变联合菌种驯化的方法对K.pneumoniae A+进行筛选,获得了可耐受较高3-HP浓度(≥35 g/L)的重组肺炎克雷伯杆菌K.pneumoniae A+5-3。发酵实验结果表明,K.pneumoniae A+5-3可将3-HPA转化为3-HP,能够同时利用甘油耦联生产3-HP和1,3-PD,产量分别达到5.0 g/L和74.5 g/L。     

触角具浅色环的七种脊茧蜂新种记述（膜翅目：茧蜂科：内茧蜂亚科）

在脊茧蜂属Aleiodes Wesmael中,有一些种类的触角具有稳定的浅色环,它们的体色一般都比较鲜艳。这些种类还可根据后翅径室及后足胫节距等特征再分成二类。属于后翅径室向外扩大,后足胫节距长于后基跗节1/3这一类群的,到目前为止,全世界共报道了5种,它们是:A.brownii(Baker)、A.Luzonensis(Baker)、A.insignicornis(Granger)、和A.speciosicornis(Granger)。我们在整理Aleiodes属的标本时又发现了属于这一类群的新种7个,它们分别是:华脊茧蜂A.aglaurus sp.nov.、俏脊茧蜂A.fuscus     

炭疽杆菌的分类地位与鉴定标准

<正> 炭疽杆菌按Bergey《细菌鉴定手册》(第8版,1974)的分类方法,属于杆菌科,需氧芽胞杆菌属,群Ⅰ中菌体宽在0.9以上的一族,其中包括炭疽杆菌(B.anthracis),蜡样杆菌(B.cereus),苏云金杆菌(B.thuringiensis)和巨大杆菌(B.me-gatherium)四个种。其中蜡样杆菌又包括三个变种。即蜡样杆菌荧光变种(B.cere-     

鲍曼不动杆菌IRS-PCR基因分型研究

目的 用低频限制性位点聚合酶链反应(IRS-PCR)对鲍曼不动杆菌进行基因分型,分析基因型与鲍曼不动杆菌耐药谱的关系,并初步探讨其在分子流行病学中的作用.方法 随机收集2008年8月至2009年8月临床分离的73株鲍曼不动杆菌,采用K-B法进行药物敏感试验确定鲍曼不动杆菌耐药谱;同时利用IRS-PCR对此73株鲍曼不动杆菌进行基因分型;并分析IRS-PCR分型与鲍曼不动耐药谱的关系;结合IRS-PCR分型结果与73株鲍曼不动杆菌感染病例的临床资料,分析在此时间段鲍曼不动杆菌在我院流行感染的情况.结果 药物敏感试验将73株鲍曼不动杆菌菌株分为A1(19株全耐药型)和A2 ～ A31(54株耐药谱型)31个药敏谱.IRS-PCR法将其分为A～W共23个基因型,其中A、C、B、D和E型为5种优势菌株,分别为14、11、10、8和6株.对比研究发现A1型菌株(15/19)主要集中在基因型A、C、D内,而基因型B包含A15型耐药菌株9株(69.2％),基因型E包含A3型耐药菌株3株(42.9％).A基因型在院内特别是ICU中心引起2次爆发流行,而C和D型主要在呼吸内科引起感染.结论 IRS-PCR基因分型与药敏分型有较高的一致性,且IRS-PCR基因分型在早期发现和预防感染暴发流行方面优于药敏分型.     

PlcR在炭疽芽胞杆菌A16R中的功能研究

炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)、蜡样芽胞杆菌(B. cereus)和苏云金芽胞杆菌(B. thuringiensis)均属于蜡样芽胞杆菌群,在遗传学上有很高的相似性。PlcR (Phospholipase C regulator)在蜡样芽胞杆菌中是十分重要的调控因子,但plcR基因在炭疽芽胞杆菌中发生一个无义突变导致在炭疽芽胞杆菌中产生一个截短PlcR蛋白。为了研究plcR基因对炭疽芽胞杆菌功能的影响,文章以蜡样芽胞杆菌CMCC6330基因组为模板,构建重组表达质粒pBE2A-plcR后导入炭疽芽胞杆菌疫苗株A16R中获得重组菌株,对其进行表型分析。结果显示,炭疽芽胞杆菌重组菌株的溶血活性基本没有恢复,但恢复了部分神经鞘磷脂酶活性,表明将蜡样芽胞杆菌的plcR基因导入炭疽芽胞杆菌后,可以直接激活神经鞘磷脂酶活性。     

人皮肤正常菌群分离株的生物学特性的研究

我们对由健康人皮肤上分离的菌株(F65、A14-1、ad_3和Bf_1、Bf_2五株菌)进行了较系统的生物学特性的研究,其生物学特征基本上符合表皮葡萄球菌、疮疱丙酸杆菌、干酪乳杆菌、青春双歧杆菌和婴儿双歧杆菌。做了抗生素、胆盐对羟基苯甲酸乙酯和对氯间苯二甲酚,以及(国际香型)氧化玫瑰等香精的敏感试验,并进行温度与时间、酸硷耐受性试验。     

MSO7A防治松毛虫的效果及其与HD-1、7216的比较

MSO_7A是1981年从松毛虫(Dendrolimus)死蛹体内筛选的一株苏芸金杆菌(Bccillus thuringiensis)新的野生菌株,简称7A。该菌株具有var Kurstaki的典型特征。对松毛虫的毒力LC_(50)是HD-1的3倍以上,是7216的5倍以上。林间用药量比HD-1节者4/5。     

固氮生物的类群

固氮生物有多种,一般都属于原核生物。通常都按照它们的固氮方式分成如下两大类。Ⅰ自生固氮生物 1.细菌(3目,11科,26属) (1)好气性细菌:棕色固氮菌(A.vinelandii),圆褐固氮菌(A.chrocoocum),贝氏固氮菌(A.beije—rinckii),活跃固氮菌(A.agile)等。     

地衣芽孢杆菌谷氨酸脱氢酶基因的克隆和特性

克隆了地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)谷氨酸脱氢酶基因(gdhA), 并研究其表达和功能. 发现野生型IRC-3 GDH-菌株和突变型IRC-8 GDH+菌株的gdhA基因都能互补大肠杆菌谷氨酸缺陷型菌Q100 GDH-的缺陷性状, 但突变型IRC-8 GDH+菌株的gdhA基因不能互补野生型IRC-3 GDH-菌株的谷氨酸缺陷性状. 经测序发现两者的核苷酸序列完全一致. gdhA基因在野生型IRC-3和突变型IRC-8中都能正常表达, 在野生型IRC-3细胞中未发现有抑制GDH活性的物质存在. 推测由于GDH翻译后调节的差异导致GDH表型的不同. 根据序列分析, 地衣芽孢杆菌GDH属于六聚体GDH中的家族Ⅰ, 而枯草芽孢杆菌GDH则属于家族Ⅱ, 两者间亲缘关系相距甚远.     

鼠李糖乳杆菌菌毛SpaA亚基的表达、抗体制备及其种属特异性研究

【目的】制备鼠李糖乳杆菌菌毛亚基Spa A多克隆抗体,研究其种属特异性。【方法】应用PCR方法从鼠李糖乳杆菌GG的基因组扩增出spa A,并连接到质粒p ET-28α(+)中。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达和镍柱纯化制备重组SpaA。通过免疫BALB/c小鼠获得多克隆抗体,利用全菌ELISA、Western和Dot-blot分析了SpaA在18株乳酸菌(12个种)中的分布特征。【结果】表达的重组SpaA分子量为36 k D,与预期大小一致;获得的Spa A抗体效价为1:12 800。Western结果显示抗体与天然Spa A具有良好的反应性。在测定的18株乳酸菌中,鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌3个种属菌株的spa A基因PCR和RT-PCR检测均为阳性。但全菌ELISA和Dot-blot结果显示,只有3株鼠李糖乳杆菌的全菌细胞与SpaA抗体呈特异性反应,而其它种属的菌株没有明显的交叉反应。【结论】尽管spa A基因在鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌中具有高度同源性,但SpaA蛋白只特异性地呈现在鼠李糖乳杆菌细胞表面。本研究中获得的Spa A抗体,为高黏附性鼠李糖乳杆菌的免疫磁珠分离及菌毛功能研究提供了工具。     

临床标本中的枸橼酸杆菌及其鉴定

枸橼酸杆菌(Citrobacter)属于肠菌科。1980年国际上公布了枸橼酸杆菌属包含三个菌种:弗劳地枸橼酸杆菌(C.freundii),异型枸橼酸杆菌(C.diversus)和柯氏枸橼酸杆菌(C.koseri)。为正确鉴定这类细菌,便于临床感染的治疗和病原学分析,我们对近两年从临床标本中分离到的枸橼酸杆菌的生化特性进行了分析研究,筛选出几项鉴别该菌的主要试验,作为这类细菌常规鉴定的方法。     

茅尾海桐花树根际放线菌的分离鉴定和抗菌活性研究

利用滤纸片扩散法,以大肠杆菌、蜡状芽胞杆菌和绿脓杆菌等为指示菌,对茅尾海桐花树根际土壤中分离的30株放线菌进行抑菌活性分析,发现其中有22株发酵液具有抗菌活性.经复筛有4株放线菌具有较强且广谱的抗菌活性,对大肠杆菌、蜡状芽胞杆菌和绿脓杆菌显示了较强的抑制活性,特别抑制临床多耐药菌肺炎克雷伯氏菌和鲍曼不动杆菌.通过形态特征、16S rRNA基因序列和生理生化分析,这4株放线菌属于链霉菌,其中S3、S4、S14分别与Streptomyces coelicolor (KF742497)、Streptomyces lateritius (AY999855)及Streptom yces variabilis (FJ486480)具有98.8％、98.6％、98.7％的相似性,S4在进化上与Streptomyces intermedius、Streptomyces silaceus和Streptomyces flavorectus在同一个分支,而S3和S14与其他菌株的进化关系较远,在生理生化及形态特征与相关的模式菌株有较明显差异,有可能是新的种.     

利用绿色荧光蛋白基因gfp研究芽胞杆菌的启动子活性

利用绿色荧光蛋白基因gfpmut3,分别标记苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)的cry3A启动子Pcry3A、BtI_BtII启动子PBtI_BtII和来自蜡状芽胞杆菌特异启动子P44-12以研究其表达差异。其中,Pcry3A和PBtI_BtII分别与gfpmut3构成融合基因,以调控gfpmut3在苏云金芽胞杆菌中的表达。将重组质粒pGFP_304(含P44-12)、pGFPExpA(含Pcry3A_ gfpmut3融合基因)和pGFPExpB(含PBtI_BtII_ gfpmut3融合基因)分别导入大肠杆菌(Escherichia coli)和苏云金芽胞杆菌后发现,P44-12和PBtI_BtII在大肠杆菌与苏云金芽胞杆菌中均可表达gfpmut3,其中PBtI_BtII在大肠杆菌中具有极强的启动基因表达的能力。而Pcry3A不能启动gfpmut3在大肠杆菌中表达,在苏云金芽胞杆菌中启动的gfpmut3表达的荧光强度也较弱。进一步通过荧光显微镜和生物活性检测器对含重组质粒pGFP_304、pGFPExpA和pGFPExpB的转化子分别进行荧光检测及微量热检测。结果表明,3种启动子驱动下的gfpmut3基因均可在苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMB171中表达并检测得到不同的发光类型。微量热法检测发现P44_12和PBtI_BtII启动gfpmut3表达的代谢热低于Pcry3A驱动gfpmut3表达的代谢热。     

低聚果糖体内外对肠道菌的影响

目的 :了解低聚果糖 (FOS)体内外对肠道菌双歧杆菌、类杆菌和肠杆菌科菌的增殖作用。方法 :FOS 1g/ (kg· bw· d) ,灌服 (ig)小鼠 ,连续 14 d后 ,取粪便 ,选择性培养基平板菌落计数法测各菌群。体外试验中 ,按 1%的 FOS添加到各人肠道分离菌培养液中 ,培养 2 4h后测其吸光度 A值和 p H值变化。结果 :ig FOS的小鼠肠道双歧杆菌和肠杆菌数量分别是 9.16± 0 .67和 8.3 3± 0 .70 (log10 N CFU/ g) ,高于对照组(P<0 .0 5)。 FOS体外对各肠道分离菌均有增殖作用 ,依大小分别是双歧杆菌、类杆菌和肠杆菌 ,其 A值分别增加了 0 .8～ 1.192、0 .80 2和 0 .198～ 0 .461,其 p H值分别降低了 1.5～ 1.68、1.2和 0 .2～ 0 .58。结论 :FOS体内外有相对选择性增殖双歧杆菌的作用 ,对类杆菌和肠杆菌也有调整作用     

3-甾酮-1-脱氢酶在不同表达体系中的表达研究

简单节杆菌3-甾酮-1-脱氢酶(KSDH),是甾体母核降解的关键酶,属于黄素蛋白类,并且是一种膜蛋白。膜蛋白的高效表达一直是一个难题。本文尝试利用三种不同的大肠杆菌表达体系,pET-30a/BL21(DE3)、pET-40b( )/BL21(DE3)和pTrc99A/JM109对C1,2位脱氢酶进行诱导表达,并对蛋白的表达量和酶活力进行比较分析,确定出最适的表达系统。     

土壤杆菌属的数值分类

对我国不同寄主植物上分离的77株土壤杆菌, 5个标准菌株和4个根瘤菌菌株进行了l02项表型特征测定,并用计算机进行数值分析。结果表明,这些菌株可归为5个群,其中4个群分别相当于《伯杰系统细菌学手册》第一卷中所记述的生物变型(biover)1,2,3和悬钩子土壤杆菌(A.rubi)。另外一个群与它们均不相同,是该属的一个新生物变型。本研究获得的A.rubi菌株是近50年来全世界重新发现这类菌株的唯一报道。     

鸭肝炎病毒基因组3'末端序列的克隆和分析

用3'RACE和RT-PCR扩增并克隆鸭肝炎病毒(Duck hepatitis virus,DHV)Ⅰ型毒株C80和Ⅰ型变异株E63的3'末端序列.分析结果显示,C80株和E63株基因组3'末端均包含1 359 nt的3D、终止密码子TGA、长314nt的3'UTR,而poly(A)尾分别含18个A和19个A.由2株DHV 3D核苷酸序列所推导的3D蛋白均含453个氨基酸,均包含KDELR、DxxxxD、GxxCSGxxxTxxxNS、YGDD和FLKR等小RNA病毒RNA聚合酶的特征基序,该结果进一步证实Ⅰ型DHV属于小RNA病毒科的成员.两株DHV与小RNA病毒科9个已知属之间3D蛋白的氨基酸序列同源性为16%～37%,介于属间3D蛋白的氨基酸序列同源性范围(18%～60%)之内;此外,Ⅰ型DHV的3'UTR在小RNA病毒科是最长的.用3D蛋白进行进化分析的结果表明,Ⅰ型DHV可能属于小RNA病毒科的一个独立的病毒属.     

耐多药鲍曼不动杆菌耐药基因检测结果的样本聚类分析

目的 调查一组耐药鲍曼不动杆菌菌株间的亲缘关系.方法 收集2010年1月至2010年12月浙江某医院ICU患者痰液标本中分离的耐药鲍曼不动杆菌共20株,采用聚合酶链反应(PCR)的方法分析3种与耐药相关的看家基因(carO、gyrA、parC)和55种水平转移获得与β-内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类耐药相关基因以及12种接合性质粒、转座子、插入序列、整合子等可移动遗传元件遗传标记,再对检测结果作样本聚类分析.结果 20株耐药鲍曼不动杆菌共检出3种与耐药相关的看家基因carO、gyrA、parC,4种获得性β-内酰胺类耐药基因(TEM-1、ADC-30、ADC-60、OXA-23),5种获得性氨基糖苷类耐药基因[aac(3)-Ⅰ、aac(6')-Ⅰ b、ant(3”)-Ⅰ、aph(3’)-Ⅰ、armA],2种抗菌制剂外排泵基因(adeB、qacE△1),5种可移动遗传元件的遗传标记(int Ⅰ 1、tnpU、tnp513、IS26、ISaba1).样本聚类分析提示,20株耐药鲍曼不动杆菌可分为A与B二个簇,A簇群均为多耐药(MDR)株;A簇群又可分为A1(ADC-60阳性)与A2簇群(ADC-30阳性),均为克隆传播.B簇群均为泛耐药(PDR)株,除8号株外为克隆传播.结论 MDR和PDR菌株中均存在克隆传播.获得菌株之间的亲缘关系对院内感染实时监测和控制院内感染意义重大.     

杆菌肽产生菌的分离鉴定及其发酵条件初步研究

杆菌肽在畜牧养殖业中应用广泛,开展菌种筛选工作十分必要。以低浓度杆菌肽为筛选方法,分离得到一株杆菌肽产生菌,鉴定并命名为地衣芽孢杆菌Y822(Bacillus licheninformis Y822)。该菌株发酵生产杆菌肽时,最适p H为7.0,溶氧能够促进产物肽积累。将B.licheninformis Y822传代5次,分别进行发酵试验,可得到(783.51±7.34)U/m L杆菌肽,其中A组分占(75.04±0.83)%。B.licheniformis Y822杆菌肽产量较高,生产能力稳定,并且产物中杆菌肽A组分含量高,具有较高的工业应用价值。     

枯草芽孢杆菌JA产生的脂肽类抗生素－iturin A的纯化 及电喷雾质谱鉴定

枯草芽孢杆菌JA产生的抗生素对植物病原真菌具有广谱抗性,明确抗生素的种类是进一步研究的基础.用6mol/L盐酸沉淀JA菌株的去菌体培养基,再用甲醇抽提获得抗生素的粗提物.利用反相HPLC系统,将粗提物过Diamonsil C18柱,收集有抗小麦赤霉病等病原真菌活性的化合物1、2.运用电喷雾质谱法(ESI/MS)测得其分子量分别为1042.4D和1056.5D.再利用碰撞诱导解离(CID)技术获得化合物的典型结构特征离子碎片,结果表明分子量为1042.4D的化合物一级结构为Pro-Asn-Tyr-βAA-Asn-Tyr-Asn-Gln(βAA为14个碳原子的氨基脂肪酸),属于脂iturin A.化合物1、2为相差一个亚甲基(-CH2)的iturin A同系物.研究结果提供了一种从枯草芽孢杆菌发酵液中快速分离纯化和鉴定脂肽类抗生素iturin A的新方法.