重组腺病毒介导的人尿激酶原突变体在山羊乳汁中的表达

构建携带人尿激酶原突变体cDNA的重组腺病毒,通过该腺病毒介导实现外源基因在山羊乳腺中表达。通过大肠杆菌内同源重组将人尿激酶原突变体cDNA插入到腺病毒载体中,经过293细胞包装获得重组腺病毒,直接注射到泌乳山羊乳腺,收集感染后1~4天的乳汁,利用纤维蛋白溶圈试验、Western blot、ELISA检测乳清中尿激酶原突变体的表达。结果显示病毒注射后1~4天乳清中均可检测到尿激酶原的表达,其表达量可达0.41mg/ml。该方法可以实现重组蛋白在山羊乳腺的短期表达,可能是大规模生产临床医疗蛋白的一条经济有效的途径。     

人尿激酶原cDNA序列缺失突变体的构建及表达

采用PCR重叠延伸法和基因重组技术构建了人尿激酶原cDNA序列中缺失150～156位氮基酸的突变体,以COS-7细胞中获得暂时性表达以及在CHO细胞中稳定高效表达,其表达水平为450～500IU／10⁶cell／24h,表达产物经SDS-PAGE电转溶实验和westemblot分析证明,细胞分泌的Pro-UK突变体与天然Pro-UK以及完整全长DNA序列表达Pro-UK的分子量相同,为54kDa．绝大多数为单链,比完整cDNA序列表达产物的单链比例明显增高,与纤维蛋白的亲和性有所提高。     

人尿激酶原乳腺定位转基因小鼠的建立

应用大鼠β乳酪蛋白基因的上游调控序列和人尿激酶原ｃＤＮＡ构建成功了乳腺定位表达载体．用显微注射的手段导入到受精卵的雄前核,从注射的３００枚受精卵中,１４０枚被移植到９只假孕的受体小鼠．结果从获得的子一代小鼠中,经ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ证实,有３只转基因阳性的小鼠．     

表达人溶菌酶基因牛乳腺特异表达载体的构建

利用高保真PCR法,分别扩增了牛乳腺酪蛋白基因的1.8kb和1.1kb的5'和3'调控 序列,克隆入TA载体.经测序鉴定后,利用DNA重组技术依次亚克隆入改造过的真核表达载体 pcDNA3(切除CMV启动子),并插入人溶菌酶基因(hLYZ)的cDNA, 构建成牛乳腺特异表达 载体.获得的重组载体经限制性内切酶酶切鉴定、PCR验证等表明,成功克隆了酪蛋白基因5 '和3'的调控区,并成功构建了表达人溶菌酶基因的牛乳腺特异表达载体.     

hNoc4L基因重组慢病毒表达载体的构建与鉴定

核糖体前体的形成和核运输需要多种核仁复合物的参与,hNoc4L是酿酒酵母S.cerevisiae的核仁复合物相关蛋白4的同源蛋白,并含有保守的Noc结构域,但其功能未知。为了构建hNoc4L基因过表达的慢病毒载体,本实验通过将EF1α启动子替换原shRNA慢病毒载体pll3.7的U6启动子,成功构建了慢病毒表达载体pll3.7-EF1,并进一步得到了hNoc4L基因过表达的慢病毒载体。利用慢病毒包装系统对不同物种的细胞进行感染,以此检测该重组慢病毒载体的包装效率,并通过构建的hNoc4L过表达的RAW264.7稳定细胞系检测了该载体的免疫原性和稳定转染能力。结果表明成功构建了高效、长期稳定表达和免疫原性低的hNoc4L特异性表达的慢病毒载体,为进一步研究hNoc4L蛋白在哺乳动物核糖体生物发生中的调控作用奠定了基础。     

新型用于艾滋病基因治疗的结合白喉毒素突变体的慢病毒载体

慢病毒载体作为基因治疗的工具之一备受关注,尤其是基于HIV-1构建的慢病毒载体.结合笔者的研究工作,对特异性识别HIV阳性细胞的非整合性依赖Rev并结合白喉毒素突变体的新型慢病毒载体构建以及抗白喉毒素细胞系的建立作了介绍.     

miR-455慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的：构建人源microRNA-455（miR-455）慢病毒载体,并鉴定成熟has-miR-455在细胞内的表达水平。方法：提取siHa细胞中的人基因组DNA,设计并合成人miR-455的上下游引物,PCR扩增目的基因,将其中表达miR-455的结构经酶切后插入慢病毒转移质粒pWPT-GFP,构建成pWPT-GFP-pri-miR-455,在293T细胞中与pMD2G、pSPAX2包装产生慢病毒,并用含慢病毒的上清感染SiHa细胞。结果：测序结果证明插入质粒载体中的miR-455前体序列完全正确,慢病毒载体构建成功并获得相应的慢病毒;重组慢病毒质粒pWPT-GFP-pri-miR-455感染SiHa细胞后上调miR-455的表达近40倍。结论：构建了miR-455的慢病毒载体,并能在293T细胞中表达,产生的慢病毒能成功感染SiHa细胞。为进一步研究miR-455的功能,以及利用慢病毒进行基因治疗奠定了基础。     

PIG7慢病毒表达载体的构建

目的:构建一个含有PIG7基因ORF区的表达载体pPRRL-PIG7-IRES,为研究PIG7基因的功能打下基础。方法:采用RT-PCR方法从经苯丁酸钠处理过的Kasumi-1细胞获得PIG7基因SIMPLE转录本的ORF片段,再用酶切-连接的方法将目的片段亚克隆入慢病毒表达质粒PRRL.SIN.CPPT.PGK/GFP.WPRE。结果:PIG7基因ORF区成功亚克隆入了慢病毒表达质粒PRRL.SIN.CPPT.PGK/GFP.WPRE。结论:成功完成了PIG7慢病毒表达载体的构建,为研究PIG7基因的功能打下了基础。     

慢病毒重组同源盒基因HOXA4表达载体的构建及其感染人脐带间充质干细胞的实验性研究

目的 构建携带同源基因HOXA4的慢病毒表达载体,并测定其对人脐带间充质干细胞的感染效率.方法 使用酶切及PCR技术从含有HOXA4基因的质粒克隆模版HOXA4-MSCV逆转录载体中获取目的 基因HOXA4,并将HOXA4基因重组到慢病毒载体表达质粒上Lenti-GFP-CTB,通过酶切、测序验证HOXA4基因后,将Lenti-GFP-HOXA4质粒、和辅助包装质粒pRsv-REV、pMDlg-pRRE、PMD2G共同转染人胚胎肾上皮细胞系293T细胞,获得携带HOXA4基因的重组慢病毒Lentiviral-HOXA4;然后感染人脐带间充质干细胞,通过荧光显微镜及流式细胞术检测其感染效率.结果 成功构建携带HOXA4基因的慢病毒表达载体Lentiviral-HOXA4,并获得高纯度的慢病毒浓缩液.经检测病毒滴度达2.11×108 TU/ml.成功转染HOXA4基因的脐带间充质干细胞表达绿色荧光蛋白,当病毒感染复数（MOI）值为60时转染效率最高,达（95.4±4.3）%.结论 成功构建携带人HOXA4基因的慢病毒,并可以在体外有效转染人脐带间充质干细胞.     

乳腺生物反应器制备中表达载体的发展

腺生物反应器拥有巨大的开发价值,但开发成功的例子却寥寥可数,主要的原因是外源基因的表达量较低,达不到开发生产的要求。提高外源基因表达量的关键在于乳腺生物反应器表达载体的构建。近年来,这方面的新思路、新方法不断出现,本文对此进行了综述。     

Transgenic Mice Expressing Recombinant Human Protein C Exhibit Defects in Lactation and Impaired Mammary Gland Development

To determine if the production of recombinant human protein C (rHPC) could be increased in milk, we created two lines of mice homozygous for the mouse whey acidic protein (WAP)/human protein C (HPC) transgene. Females of both lines had normal growth, activity and fertility, but failed to lactate normally and were unable to raise litters. Histological analyses of mammary glands from lactating homozygous females showed barely distended alveoli filled with dense-staining milk. Epithelial cells within these alveoli had distinct, centrally located nuclei and contained intracellular lipid droplets. Hemizygous animals derived from these lines were able to lactate and raised normal sized litters. Northern blot analysis showed that the 6.4 homozygous (6.4H) line expressed the transgene at higher levels then corresponding hemizygous (6.4) animals, but the 4.2 homozygous (4.2H) line expressed the transgene at lower levels than the 4.2 hemizygous line. The 6.4H line also had increased rHPC levels in the milk as revealed by western blot analysis. The 4.2H, 6.4, and 6.4H lines showed decreased and/or delayed expression of WAP, -casein, and -lactalbumin mRNA's compared to wild type animals during lactogenesis. The 4.2 line showed decreased mRNA expression for -casein and -lactalbumin, but normal or higher expression of WAP during lactogenesis. Elevated levels of some proteins were detected in the milk of transgenic mice. From these results, it is concluded that expression of rHPC induced a lactational phenotype that involves abnormal morphological, biochemical, and functional differentiation of mammary epithelial cells. However, the induction of this phenotype does not appear to be directly related to the level of rHPC mRNA expression, thus suggesting that the basis of this phenotype may involve secondary, rather than primary, effects of rHPC on mammary gland development.Deceased.     

乳腺生物反应器特异高效表达载体的构建

乳腺生物反应器具有广阔的开发前景,而提高目的基因的表达量是该领域一个重要的研究课题。因此,选用强的非特异性启动子pCAG,而不是乳腺特异性启动子来实现高效表达;通过Cre/loxP系统和山羊β-乳球蛋白启动区（pBLG）表达Cre重组酶来实现载体的自删除以达到乳腺特异表达的目的。方法：构建含PolyA终止信号的Cre乳腺特异表达元件PolyA-pBLG-cre,插至强启动子pCAG驱动的报告基因lacZ表达载体中,构建成乳腺特异表达载体pCBCZ（pCAG-loxP-PolyA-pBLG-cre-loxP-lacZ）。转染细胞实验结果：PCR鉴定确认pCBCZ载体在小鼠乳腺上皮细胞（HC11）中发生Cre-loxP同源重组。X-Gal染色表明载体能驱动lacZ在HC11细胞中高效表达β-半乳糖苷酶,而在NIH 3T3细胞中仅少量表达。结论：构建的pCBCZ载体能高效驱动外源基因在乳腺细胞中表达,且具有较好的乳腺特异性,为研发乳腺生物反应器表达载体提供新的方法。     

Dynamic Control of Oligosaccharide Modification in the Mammary Gland: Linking Recombinant Human Erythropoietin

We analyzed two transgenic mouse lines that secrete rhEPO in their milk to assess the dynamic control of N-linked oligosaccharides. Since pharmaceutically available epoetin α and β are produced in CHO cells, we compared transgenic mammary gland-derived rhEPO to its CHO cell-derived counterpart. The major glycosyltransferases that determine the N-oligosaccharides patterns of rhEPO include N-acetylglycosaminyltransferase (GnT) and α1,3/4 fucosyltransferase (Fuc-TIV), GnT-III, -V and Fuc-TIV expression in the mouse mammary gland is significantly higher than that in Chinese hamster ovary (CHO)-derived cells, where the protein is not detectable. The data suggest that N-linked sugar chain patterns of recombinant glycoproteins, produced by the mammary gland differ, since GnT-III alters the sugar pattern extensively. In our experiments, rhEPO produced by the transgenic mice contains more tetra-acidic oligosaccharide structures than epoetin α derived from CHO cells, a rhEPO that is widely used therapeutically. Accordingly, we examined milk-derived rhEPO activity, both in vitro and in vivo. The rhEPO protein purified from the milk of mammary glands upregulates the EPO receptor-mediated expression of the STAT5 gene in MCF-7 cells in a dose-dependent manner, similar to the effects of epoetin α. Furthermore, direct injection of rhEPO into the mouse tail vein leads to an increase in the levels of blood components, such as red blood cells and platelets. In light of these findings, we suggest that the mammary glands of transgenic animals provide a sufficient environment to generate rhEPO with post-translational modifications for biopharmaceutical use. These authors are equal contributors to this work.     

乳腺生物反应器表达载体的检测方法

乳腺生物反应器研究和开发的周期长 ,成本大 ,风险高 ,在生产转基因动物之前有必要对乳腺特异性表达载体构建的合理性和有效性进行检测。综述了国内外载体检测研究的进展 ,以及这些检测方法在转基因小鼠、动物乳腺内表达法和细胞培养中的应用     

人尿激酶原突变体的构建及其特性的研究

由于人尿激酶原（pro-UK）存在凝血酶和纤溶酶原激活剂抑制剂（PAI-1）的作用位点,在生产和治疗过程中容易失去活性。采用PCR介导的定点突变技术对pro-UK基因进行了突变,构建了3种人pro-UK突变体, 分别将蛋白序列中的凝血酶作用位点Arg¹⁵⁶突变成His¹⁵⁶,构建成pro-UKM1;将PAI-1的作用位点Arg¹⁷⁸、Arg¹⁷⁹、Arg¹⁸¹突变为Lys¹⁷⁸、Lys¹⁷⁹、His¹⁸¹构建成pro-UKM2;同时将凝血酶和PAI-1的作用位点突变构建成pro-UKM3。分别在CHO细胞中获得稳定表达。并对3种突变体进行了SDS-PAGE纤维蛋白自显影和Western blot分析,证明3种细胞表达的pro-UKM与天然尿激酶原带型一致,绝大多数为单链。体外溶栓试验表明,pro-UKM1对凝血酶有抵抗性,pro-UKM2对PAI有抵抗性,pro-Ukm3能有效抵抗凝血酶和PAI的活性抑制。特别是pro-UKM3具有开发成新型溶血栓药物的潜力     

乳蛋白调控元件和乳腺表达载体的研究进展

利用转基因动物乳腺生物反应器生产重组蛋白是一项极具潜力和开发价值的生物技术,但成功的例子并不多,主要是由于乳蛋白的表达调控机制还未完全阐明,构建的表达载体不足以克服位置效应的影响,使得外源基因的表达难以预期。目前乳腺生物反应器研究的热点是对乳蛋白表达调控元件进行更深入的研究,构建基于酵母人工染色体、细菌人工染色体的经过修饰的乳蛋白基因座载体。简要综述了乳蛋白表达调控元件和表达载体的研究进展。