S-腺苷酰L-甲硫氨酸 (SAM)对 HL-60细胞 DNA甲基化酶活力和甲基化水平的影响(英文)

 以 S-腺苷酰 - L-甲硫氨酸 (SAM)为诱导物 ,在 1 0 μmol/L最佳浓度下造成 1 6%的 HL- 60细胞分化 .HPLC检测结果表明 ,细胞基因组 DNA甲基化水平升高 .通过3H甲基同位素参入法研究细胞 DNA甲基化酶活力 ,则发现在细胞分化过程中酶活力未见升高 .说明细胞基因组甲基化水平升高并不是胞内 DNA甲基化酶催化能力改变的结果 ,而是由于 SAM进入细胞提供过量甲基造成的 .     

分子生物学技术讲座（二）——分子克隆中所用的酶

限制性内切酶及其它DNA与RNA修饰酶是分子克隆技术的基本工具。1限制性内切醉和DNA甲基化酶限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性内切酶识别序列的特定的DNA序列或附近的序列,并在此切割DNA双链。它可以分成3类：Ⅰ类和Ⅲ类在同一蛋白分子中兼有修饰（甲基化）作用及依赖于ATP的限制（切割）活性。Ⅰ类酶结合于识别序列,但随机切割DNA;Ⅲ类酶能在识别序列位点切割DNA。在分子克隆中1类和皿类酶都不常用。D类限制一修饰系统限制性内切醇和修饰（甲基化）酶不在同一蛋白分子中,限制性内切酶能专一地切割识别序列,并不依…     

洋葱伯克霍尔德氏菌HMW DNA的制备及酶切研究

高质量粘粒基因组文库构建的关键是HMW DNA的长度至少为粘粒载体容量的10倍,通常粘粒载体的容量为30～50 kb,因此提取的HMW DNA应不小于500 kb.HMW DNA在制备时不能受到任何物理的剪切力,以免DNA断裂和损伤.利用琼脂糖凝胶包埋制备的DNA胶块经裂解和纯化后发现其DNA长度远大于500 kb,明显优于商品化试剂盒提取和酚抽提法.用BamHⅠ、Sau3AⅠ、XbaⅠ和HindⅢ对DNA胶块进行不完全酶切研究表明,构建文库常用的Sau3AⅠ并不适合胶块内酶切反应,而BamHⅠ酶切B.cepacia HMW-DNA效果较好,产生的DNA片段集中在20～50 kb之间,完全适合粘粒基因组文库的构建,为B.cepacia大插入片段基因组文库的构建以及功能基因组的研究奠定了良好的理论基础.     

利用锁核酸化学偶联FokⅠ核酸酶靶向切割HBV基因的体外实验

乙肝病毒(HBV)是有缺口的双链DNA病毒,侵入人体肝细胞后形成共价闭合环状DNA(ccc DNA)持续复制,并在逆转录过程中随机整合入宿主基因组。慢性乙型肝炎感染者平均每个细胞中含有33个ccc DNA拷贝,半衰期长达35~57 d,很难从体内彻底清除。利用锁核酸抑制HBV转录,是乙肝治疗的新策略。此外,利用基因组编辑技术靶向切割HBV基因组,有望从源头治愈乙型肝炎。基于锁核酸与双链DNA形成三股螺旋的能力、抵御核酸酶及聚合酶的稳定性以及对单碱基错配的敏感性,本研究以靶向切割乙型肝炎病毒为例,设计构建锁核酸修饰的寡核苷酸作为DNA结合域,有效增强对靶基因的特异性识别;同时利用FokⅠ核酸酶分子量小、二聚化时才具有酶活等特点,设计构建FokⅠ切割域二聚体重组蛋白作为DNA切割域;进而通过双功能交联剂GMBS,建立了5′端氨基(-NH2)修饰的锁核酸与N端巯基(-SH)修饰的FokⅠ核酸酶定向化学偶联的方法,并在体外验证了新型工具对HBV基因的靶向切割。该方法为此后在体内进行高特异性、无整合风险的抗病毒基因治疗提供了全新的技术思路。     

卡介苗菌基因组DNA对小鼠腹腔巨噬细胞激活效应的初步研究

为了比较研究卡介苗菌基因组DNA和卡介苗菌激活小鼠腹腔巨噬细胞的抗结核免疫应答过程及免疫作用,用卡介苗菌基因组DNA、卡介苗菌和生理盐水分别皮内注射小鼠第30、60 d后,分别采用Griess法、化学法、ELISA法检测小鼠腹腔巨噬细胞产生的NO、H2O2以及IL-12、TNF-α的表达.研究结果,卡介苗菌基因组DNA和卡介苗菌皮内接种小鼠后能显著诱导小鼠腹腔巨噬细胞分泌表达IL-12和TNF-α.卡介苗菌基因组DNA组和卡介苗菌组相比较,无明显差异,与生理盐水组比较,其差异均有统计学意义(P<0,05);卡介苗菌基因组DNA和卡介苗菌皮内接种小鼠后也能诱导小鼠腹腔巨噬细胞产生NO、H2O2,卡介苗菌基因组DNA组和卡介苗菌组相比较,无明显差异,与未免疫组比较均具有统计学意义(P<0.05).研究结果表明,卡介苗菌基因组DNA皮内接种小鼠后能诱导小鼠腹腔巨噬细胞活化并产生较强的激活效应,且该效应于卡介苗菌无明显差异.     

枝干树皮宏基因组DNA的提取

旨在得到一种适用于提取多种枝干树皮的高质量DNA的方法。参考前人提取植物DNA的经验,综合了研磨时加PVP、缓冲液洗涤、SDS与CTAB结合使用、高浓度KAc低温冻融、高浓度Na Cl条件下异丙醇沉淀、DNA完全溶解后加微量RNase A处理等操作,所得5种基因组DNA浓度介于190-970 ng/μL,纯度都很高,皆能被限制性内切酶切割,都可用作模板扩增到细菌16S r RNA基因片段,以苹果树皮DNA为模板扩增到苹果BIP和PDI基因且苹果树皮基因组DNA经测序公司检测,质量满足高通量测序法研究微生物多样性对环境宏基因组的要求。     

黄鳝二价体上微量DNaseⅠ敏感性和限制性内切酶原位切割分析

采用DNase Ⅰ超敏感性分析和限制性内切酶介导的原位切口平移技术(Restriction Enzyme Nick Translation,RE-NT)对黄鳝二价体基因组结构进行了分析研究。已知DNaseⅠ超敏感性与潜在活性基因分布密切相关。结果表明,经DNaseⅠ介导的原位切口平移处理,在黄鳍二价体上可展现类D带带型,而由限制性内切酶介导的原位切口平移结果显示,AluⅠ和MspⅠ均在黄鳝二价体上诱导产生类G带带型,HpaⅡ和HaeⅢ则优先切割5号二价体上一特定区域,诱导出一段由标记信号所构成的类C带,对上述结果进行了分析和讨论。     

MPTP诱导的帕金森病小鼠模型黑质脑组织DNA甲基化研究

为研究DNA甲基化在帕金森病发病机制中的作用,本研究用环境毒素1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)连续腹腔给药诱导小鼠帕金森病(Parkison's disease,PD)模型,应用ELISA检测小鼠黑质脑组织总体甲基化水平,应用实时荧光定量PCR方法检测DNA甲基转移酶表达水平,探讨MPTP诱导的小鼠PD模型黑质部位是否存在DNA甲基化异常.进一步应用甲基化DNA免疫共沉淀结合DNA甲基化芯片方法,构建MPTP诱导的小鼠PD模型黑质脑组织DNA甲基化谱,并寻找DNA甲基化修饰异常的PD相关基因对其进行验证.结果表明,模型组小鼠黑质脑组织DNA总体甲基化水平较对照组显著降低,Dnmt1的表达水平显著增高.利用DNA甲基化芯片在全基因组内筛选出甲基化差异修饰位点共48个,涉及44个基因,这些甲基化差异基因参与信号转导、分子转运、转录调控、发育、细胞分化、凋亡调控、氧化应激、蛋白质降解等生物学过程.在甲基化差异修饰基因中,对Uchl1基因及Arih2基因进行了甲基化水平以及表达水平的验证.结果表明,模型组小鼠黑质脑组织Uchl1启动子区域甲基化水平较对照组增高,m RNA及蛋白质表达水平降低,Arih2启动子区域甲基化水平较对照组降低,m RNA及蛋白质表达水平增高.实验结果进一步证实,DNA甲基化修饰异常在帕金森病发病机制中有重要作用,环境因素(如MPTP)可以通过改变DNA甲基化修饰参与帕金森病的发生发展.     

单粒干燥大豆种子基因组DNA提取的有效方法

大豆基因组DNA的提取是进行大豆分子生物学研究的基础.以大豆干燥的种子为材料,将SDS法和CTAB法结合在一起并进行了一定的改进,有效的提取了基因组DNA.通过电泳、紫外分光光度计检测和ISSR标记分析验证这种方法是提取大豆干种子基因组DNA的有效方法.     

人eNOS复制缺陷型重组腺病毒的构建

目的:构建以巨型细胞病毒(CMV)为启动子的heNCS重组腺病毒转移载体.方法和结果:将heNOS cDNA全长亚克隆到穿梭质粒启动子CMV的下游,通过I-Ceu Ⅰ和PI-SceⅠ两个稀有酶切位点将目的基因heNOS与腺病毒质粒DNA(pAdeno-X)进行体外连接,获得重组腺病毒质粒DNA(pAdeno-heNOS),后者经限制性内切酶PacⅠ切割,利用脂质体转染法获得heNOS重组腺病毒.PCR双引物法鉴定是否成功构建heNCS重组腺病毒.结论:PCR双引物检测含有heNOS片段,表明成功构建了heNOS重组腺病毒转移载体AdhCMV-heNOS.     

紫茎泽兰高分子量核DNA制备方法的研究

以紫茎泽兰暗培养幼嫩叶片为材料,在细胞核提取缓冲液中加入PVP、抗坏血酸和氨基甲酸钠3种强抗氧化剂,较好地去除了多糖多酚等次生代谢物,经低熔点琼脂糖包埋细胞核及蛋白酶K原位裂解DNA胶块,以获得大分子量DNA;最后分别采用2种不同的限制性内切酶(BamH Ⅰ和HindⅢ)和5个浓度梯度(0 U、0.2U、0.4U、0.6U、0.8 U)进行酶切,并对不同的回收方法进行比较分析.结果表明:经脉冲电泳检测,本方法提取的DNA片段长度＞600 kb,基本无细胞器DNA和蛋白质污染;酶切条件以0.4U酶浓度HindⅢ的效果最好,酶切后的DNA片段主要集中在100～300 kb之间,DNA片段大小满足构建BAC文库的要求;对回收方法进行比较分析,电洗脱法回收的大片段DNA浓度远远大于琼脂糖酶切法,大于8mg·L-1,这完全能够满足构建大片段基因组文库对DNA浓度的要求.     

重组人apoE基因表达活性和转基因小鼠研究

人apoE基因组DNA,去除其自身启动子,代之以小鼠金属硫蛋白启动子,重组质粒经脂质体介导转入小鼠NIH／3T3细胞后,以人apoE基因组DNA／EcoRⅠ片段为探针检测mRNA表达,可见apoEmRNA杂交信号很强,经重金属诱导后杂交信号更强,表明MT启动子功能良好,pME表达正常．将人apoE基因组DNA用显微注射法导入小鼠受精卵雄性原核,再将胚胎移植入假孕母鼠输卵管内,仔鼠分娩四周后,自鼠尾提取DNA,鉴定人apoEDNA在小鼠染色体上的整合,最终得到有人apoE基因整合的转基因首建鼠．     

大麦β-1,3-葡聚糖酶基因(GⅢ)启动子在转基因水稻中的诱导表达

将大麦β-1,3-葡聚糖酶同功酶基因(GⅢ)启动子(PGⅢ)与其报告基因gus(β-葡聚糖酸醛苷酶基因)耦联,构建植物表达载体,通过农杆菌介导法转化水稻.PCR、DNA印迹法结果显示,构建的pGⅢ-gus表达载体已整合到水稻基因组DNA中.GUS组织化学染色、RNA印迹法及荧光法结果显示,该启动子驱动的gus在水稻叶片中为低水平表达;而用水扬酸(SA)与稻瘟菌来源的激发子处理,可诱导gus的高水平表达.T1代种子的GUS组织化学染色结果也表明,SA与激发子可以诱导高水平的PGⅢ活性.这些结果表明PGⅢ是一种强诱导型启动子,并可能是一种病原菌诱导型的启动子.     

大肠杆菌噬菌体T4基因42和43DNA片段无性繁殖系的鉴定和分析

含胞嘧啶的T4 DNA用核酸内切酶Eco RI、Sal Ⅰ、和Hind Ⅲ切割,特别是用Eco RI不完全切割,所得片段以质粒pBR 322作载体,在大肠杆菌E.coli KH 802菌株中进行了无性繁殖。5,000个无性繁殖系经标记获救法作遗传鉴定,筛选基因42和43的无性繁殖系,并对其所带T4 DNA片段的图位和有关基因的功能表达进行了初步分析。试验证明,10个无性繁殖系带有基因43片段,其中CC-20还带有全部imm基因及基因42;基因43内B22和B263突变位点之间有一个Eco RI酶切位点,基因42或imm内也有一个酶切位点,无性繁     

鲎素的抗菌靶点初探

采用体外抑菌法测定鲎素的抑菌动力学特点,钼酸铵比色法和紫外吸收法分别检测细菌与鲎素共同孵育前后无机磷和大分子泄漏情况,扫描电镜和透射电镜观察细菌与鲎素共同孵育前后细菌形态和结构的变化,紫外吸收法和凝胶电泳法分别观察鲎素对细菌基因组DNA和质粒DNA结构的影响,质粒转化实验检测鲎素对质粒DNA复制和转录功能的影响.结果表明,鲎素对革兰氏阳性菌和阴性菌具有不同的抑菌动力学特点,经鲎素处理的细菌,胞内无机磷和大分子泄漏显著,细胞壁膜和菌体遭到不同程度的破坏,鲎素可与细菌基因组DNA和质粒DNA结合,高浓度鲎素有可能使DNA发生断裂,进而使质粒DNA复制和转录功能受到抑制.上述结果提示,鲎素的抗菌靶点至少包括细胞壁膜和菌体DNA.     

脉冲场凝胶电泳对铜绿假单胞菌的分子检测与相关性分析

目的应用PFGE对医院环境物体表面分离到的铜绿假单胞菌进行相关性检测与分析,探讨PFGE在监测和控制医院感染方面的意义。方法选择SpeⅠ酶对铜绿假单胞菌染色体DNA进行酶切,选用适宜的实验条件采用脉冲场凝胶电泳技术分析电泳酶切指纹图谱,了解其流行状况。结果14株铜绿假单胞菌基因组DNA经SpeⅠ限制性内切酶酶切后电泳,在30~800 kb之间产生18~24条大小不同的DNA切割片段区带。可分为9个带型。结论PFGE具有分辨力高,重复性好的特点,是铜绿假单胞菌分子流行病学分析的理想方法。     

一种改良的启动子序列克隆的染色体步查法

利用染色体步行法,从已知DNA序列克隆侧翼未知序列是非常有效的方法之一,但由于所选用的特定限制性内切酶对目标基因组不能酶解成合适大小的片段,因而受PCR扩增能力的局限,往往扩增不出有效产物. 针对这一点,这里我们介绍一种简单有效的改良方法,它包括以下步骤：首先用不同的限制性内切酶(包括平末端和粘性末端) 酶解目标基因组DNA,接着,选择能将基因组酶切成弥散、分布均匀的限制性内切酶,如DraⅠ和HindⅢ,合成相对应的接头;然后,选择弥散的、分布均匀的限制性内切酶的酶解产物,构建成含相应接头的基因组DNA文库,用作PCR的模板;最后,用接头引物和特异引物,通过巢式PCR扩增目的片段,获得了理想的扩增效果.采用改进后的染色体步查法,有效地从较复杂的棉花核DNA中克隆出6个棉花启动子序列.