利用Tn5定位诱变筛选紫云英根瘤菌Exo^—变种

利用Ｔｎ５定位诱变方法,对质粒ｐＪＢＢ５进行Ｔｎ５插入诱变,得到１０个Ｔｎ５在５９ｋｂＢ５外源片段上有不同插入位点的质粒ＴＮ１１,ＴＮ１１２,ＴＮ２２,ＴＮ２３,ＴＮ３１,ＴＮ４１,ＴＮ９１,ＴＮ１０１,ＴＮ１３１,ＴＮ１４１。将Ｔｎ１１等分别转移到已经含有不相容质粒ｐＰＨ１ＪＩ的紫云英根瘤菌１０７菌株中,使之发生同源变换。通过抗性选择及表型鉴别,筛选到３株菌落表型干燥（Ｍｕｃ－）的酸性胞外多糖（ＥＰＳ）合成缺陷菌株（Ｅｘｏ－）１０７（ＴＮ２２）,１０７（ＴＮ１０１）,１０７（ＴＮ１３１）。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析证明这３株变种的Ｔｎ５插入确实是同源交换而不是转座产生,表明经过适当改良的Ｔｎ５定位诱变法可以应用于紫云英根瘤菌Ｅｘｏ－变种的筛选。     

利用Tn5gusA5对大豆慢生根瘤菌lrp基因的诱变

通过对重组质粒ｐＧＸＮ３００中的 ２．３ｋｂ ＥｃｏＲＩ片段测序分析发现,其上有一完整的ｌｒｐ基因和部分 ｐｕｔＡ基因,与 Ｋｉｎｇ ＮＤ等［１］报道的 Ｂ．ｊａｐｏｎｉｃｕｍ的ｌｒｐ基因ＤＮＡ序列有 ８８％同源性。利用 Ｔｎ５ ｇｕｓＡ５定位 诱变方法,对质粒ｐＧＸＮ３００进行插入诱变,得到２．３ｋｂ　ＥｃｏＲＩ片段上有Ｔｎ５ｇｕｓＡ５插入位点的质粒ｐＧＸＮ３００－ Ｔ３８,将ｐＧＸＮ３００－Ｔ３８转移到大豆馒生根瘤苗（Ｂ．ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）ＧＸ２０１中,得到的ＧＸ２０１转移接合子与不相容 质粒ｐＰＨ１ＪＩ发生同源双交换。通过抗性及ｇｕｓＡ活性检测,筛选到一ｌｒｐ基因突变株。Ｓｏｕｔｈｅｍ杂交分析证 明这突变株的 Ｔｎ５ ｇｕｓＡ５插入确实是同源交换而不是转座产生,表明 Ｔｎ５ ｇｕｓＡ５ 诱变可以应用于大豆慢生根 瘤菌中的突变林筛选。     

质粒exoR‘恢复紫云英根瘤菌胞外多糖缺陷型变种有效结瘤能力

以ＰＭＮ２作为载体质粒,应用体内克隆技术,从紫云英根瘤菌胞外多糖缺陷型变种ＮＡ－１１中,分离到ｘｅｏＲ＇质粒,该杂合质粒带有Ｔｎ５及其插入位点两侧的根瘤菌中,不仅可纠正紫云英根瘤菌Ｅｘｏ＾－变种的胞外多糖合成缺陷,也能恢复该变种使宿主植物根部结瘤的能力。     

Tn5—Mob转座系统对紫云英根瘤菌SR72的诱变和诱动作用

通过接合作用将携带有转座子 Tn5—Mob 的“自杀”性载体质粒 pSUP5011引入紫云英根瘤菌 SR72,得到卡那霉素抗性(Km~r)菌落的频率为6.99×10~(-6),测得受体菌的 Km~r 自发突变频率<10~(-8)。从对1071个 Km~r 突变体进行的植物砂培结瘤试验中筛选出结瘤不固氮(Nod~ ,Fix~-)突变株17个,不结瘤(Nod~-)突变株4个。另外,还从近3000个 Km~r 突变体中选出腺苷营养缺陷型突变株3个。通过 Tn5探针进行的菌落原位杂交试验证明:这21个共生固氮突变株中均含有 Tn5序列,进一步通过接合作用将协助质粒 RP4—4(Tc~r)引入 Nod~ ,Fix~ 突变株,获得了含有 Tn5—Mob 和 RP4—4的新突变株 SR72ZR(Km~r,Tc~r),但试图通过它们的协同作用将SR72中的大质粒诱动转移到根癌农杆菌 A136的试验未获成功.     

维生素C生产用菌系2980产酸菌基因转移的筛选模型及转座子Tn5诱变

维生素C的生产目前国内广泛采用由产酸菌(Gluconobacter oxydans)与伴生菌(Bacillus megaterium)组成的2980菌系,在2980中G.oxydans单独生长传代困难,其生长和产酸需要B.megaterium参与。以Bacillus subtilis Ki-2-132(pUB110)作为伴生菌与原2980的G.oxydans组合,获得稳定产酸的新菌系。在此基础上建立了适合我国混菌发酵产酸菌外源基因(Kanr)转移的筛选模型。同时报道了以携带有自杀性载体P1：：Tn5的大肠杆菌E.coli W3110为供体菌对G.oxydans进行Tn5诱变的条件和结果。     

紫云英根瘤菌结瘤基因的定位研究

以根瘤菌nod ABC基因的结构同源性为依据,对紫云英根瘸菌结瘤基因(nod)进行了定位。结果表明,紫云英根瘤菌菌株7653R的nod基因同时存在于小质粒pR37653Ra和大质粒pRa7653Rb上;S52的nod基因位于小质粒pRa52a上;SR72的nod基因单拷贝位于小质粒pRa72a上,含有部分nod ABC基因的BamHI、HiadIII和Pstl酶切片段分别为22.4kb、11．9kb和2．2kb,EcoRl酶切片段为4．6kb和3．0kb;HR104的nod基因也是单拷贝,仅存在于小质粒PRal04a中,含有部分nod ABC基因的 BaraHI、EcoRL和Pstl酶切片段分别为 22．4kb、9．1kb和2．2kb。     

高温胁迫对根瘤菌Tn5在土壤中的存活及其表型表达的影响

研究了３株弗氏中华根瘤菌（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｆｒｅｄｉｉ）Ｔｎｓ突变株于适宜温度和高温胁迫两种条件下在土壤中的存活和Ｔｎｓ表型的表达．在适宜温度（２８℃）条件下的灭菌和未灭菌土壤中的存活研究表明生物因素抑制了突变株和野生型的生长．但野生型和突变株的存活种群密度之间无显著差异（Ｐ＝０．０１）．在高温胁迫（４０℃）条件下,土壤中野生型和突变株的种群密度迅速下降,其中部分ＯＮ－２和ＯＮ－３细胞丢失了Ｔｎｓ表型,说明部分细菌的Ｔｎ５表型在高温胁迫条件下不能表达．     

转座子Tn5诱变慢生大豆根瘤菌

用pSUP1011载体系统,Tn5诱变慢生大豆根瘤菌110、123,其KmR菌落出现频率为5x10-8一5x 10-7。Tn5的SmR。基因能在慢生大豆根瘤菌中表达。用卡那霉素加链霉素来筛选插入变株,可完全排除自然突变的干扰。从4450个KmR变株中检出营养缺陷型7株,其中His-(4)、Glu-(1)和Trp-(2),吸氢功能缺陷型10株,其中2株His-同时是吸氢缺陷(Hup-)和共生固氮缺陷(Nif-),其原养型回变体(回变频率为0.5×10-8)都同时恢复了吸氢与固氮功能,又失去了对卡那霉素的抗性。4株对氧特别敏感的Hup-缺陷型,在培养状态下无吸氢活性,但结瘤固氮时不放氢。     

质粒exoR′恢复紫云英根瘤菌胞外多糖缺陷型变种有效结瘤能力

以ＰＭＮ２作为载体质粒,应用体内克隆技术,从紫云英根瘤菌胞外多糖缺陷型变种ＮＡ－１１中,分离到ｅｘｏＲ′质粒,该杂合质粒带有Ｔｎ５及其插入位点两侧的根瘤菌ＤＮＡ片段。ｅｘｏＲ′质粒能稳定地存在于紫云英根瘤菌中,不仅可纠正紫云英根瘤菌Ｅｘｏ－变种（Ｎｄｖ－）的胞外多糖合成缺陷,也能恢复该变种使宿生植物根部结瘤的能力。     

Tn5-Mob系统诱导根瘤菌属之间耐盐和共生性状的转移

本实验通过质粒pSUP501l及其辅助质粒RP4将Tn5-Mob随机插入苜蓿根瘤菌(Rhizo-bium meliloti 042B)的基因组中,得到86株接合子SR。随机选取4株SR,通过辅助质粒R68．45的三亲本杂交,将它们的DNA片段引入慢生型大豆根瘤菌(Bradyrhizobium,japo—nicum USDA 110),获得106株接合子BSR。大部分BSR菌株获得了生长快速的特性和耐盐性,一般能耐0．3—0．5m01／L Nacl,其中有些菌株能产生黑色素。将9o株BSR回接大豆和苜蓿植株,发现47株能在大豆和苜蓿植株结瘤,但在苜蓿卜无固氮活性;26株只能在大豆植株结瘤固氮;13株只能在苜蓿植株结瘤而不固氮;4株在大豆和菖蓿植株均不结瘤。其中,获得了4株耐盐性和固氮酶活性强的接合子。     

紫云英根瘤菌胞外多糖缺失变种及其结瘤性状的变化

根据紫云英根瘤菌在寄主豆科植物紫云英上的结瘤能力,经转座子Tn5诱变获得的18株Exo~-变种可分为4种结瘤类群(A-D):A类变种诱导植物产生小的瘤状突起,不具固氮能力;B类变种形成无效根瘤;C类变种产生固氮效率降低的根瘤;D类变种丧失了结瘤能力。电镜分析显示:无效瘤和瘤状突起中不存在类菌体区,根瘤细胞均为不含细菌的空细胞,侵染线不能穿透到根瘤细胞中。说明紫云英根瘤菌胞外多糖很可能参与有效根瘤的形成。     

紫云英根瘤菌胞外多糖缺陷型变种的分离及遗传分析

经转座子Tn5诱变,获得20株紫云英根瘤菌菌株109胞外多糖(Exopolysaccharide,EPS)缺陷型(Eps-deficient,Exo-)变种。这些变种仍都是原养型,在含不同的碳底物或不同浓度碳底物的固体培养基上,菌落型态均无改变。与亲本菌相比,变种的EPS产量明显降低。所有变种未能在其宿主植物紫云英上结瘤。利用载体质粒pMN2,经Exo-变种与大肠杆菌受体菌交配,通过选择Tn5卡那霉素抗性标记的转移,构建成带有Tn5及菌株109多糖基因DNA片段的R－prime质粒。R-prime质粒能稳定地存在于菌株109中。大部分变种的Exc-表型能被R-prime质粒互补,但R-prime质粒未能使这些Exo-变种恢复有效结瘤的共生能力。根据互补结果,20株Exo-变种分为6种不同的互补群,其中5种互补群的多糖位点在遗传上是连锁的。     

利用Tn51063转座诱变法分离苜蓿中华根瘤菌042BMnoeB基因的研究

采用三亲本杂交方法将带有Tn51063（含luxAB）的质粒pRL1063a导入苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)042BM,进行转座子插入诱变,在含有氯霉素、卡那霉素的TY平板上筛选接合子。通过结瘤试验,从1000个突变株中,筛选到3个结瘤突变株042BMR5、042BMR11和 042BRM29。它们都表现出发光酶活性,表明转座子正向插入到基因组中的某个启动子下游。Southern杂交结果证实,转座子均为单一位点插入。对042BMR5突变株基因组进行反向PCR,扩增位于Tn51063两端的侧翼序列。测序结果表明,转座子插入到苜蓿中华根瘤菌的共生质粒pSymA noeB基因内。根据基因组中noeB上游和下游序列扩增出042BM noeB,其与苜蓿中华根瘤菌1021 noeB的同源性为98％,而与NoeB蛋白的氨基酸序列相似性为95％。疏水性分析发现,NoeB是一个跨膜蛋白,在N末端有4个跨膜区,其中包含3个初级螺旋和1个次级螺旋。     

紫云英根瘤菌糖基转移酶基因exoL的定位突变及序列分析

利用转座子Tn5对质粒pJB-B6既定位诱变,经同源交换,筛选获得一株Rhizobiumhuakuii107胞外糖合成缺陷（Exo－）变种RH983。三亲本杂交实验显示,pJB-B6及其亚克隆pJB-B601均可纠正变种RH983的胞外多糖合成缺陷。pJB-B601的2．3kbDNA片段的核苷酸顺序表明,该片段内存在一个完整的开放阅读框架（ORF）。ORF全长1170bp,编码390个氨基酸的蛋白,该蛋白与Rhi－zobiummeliloti的糖基转移酶ExoL有56．7％．的同源性,称为RhexoL。利用启动子探测质粒,构建了RhexoL-lacZ转录融合子,发现RhexoL基因5’上游有较强的启动子活性。     

粪产碱菌的Tn5转座诱变及吲哚乙酸生物合成特性的研究

粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)A1501的吲哚乙酸(IAA)合成需要外源色氨酸参与。在不含色氨酸的限制性培养基中,A1501能良好生长,但不能合成IAA,表明在A1501中存在一条依赖于色氨酸的IAA合成途径。A1501的IAA合成具有菌体密度依赖特性。采用Tn5转座诱变技术构建A1501的突变库,从3500多株Tn5转染子中分离到一株色氨酸营养缺陷型突变株AT63。该Tn5突变株在不含色氨酸的限制性培养基上不能生长,但仍能进行IAA的生物合成,每毫升菌体密度等于10的突变株菌体的IAA合成量为224μg。对突变株AT63的研究表明在A1501中至少存在两条IAA合成途径：一条以色氨酸为合成前体,另一条以吲哚-3-磷酸甘油为前体。Southern杂交结果表明突变株中Tn5插入位点可能位于编码色氨酸合成酶基因上。     

转座子Tn5-Mob对菜豆根瘤菌共生基因的诱变、转移和初步定位

转座子Tn5-Mob在质粒RP4-4配合下能诱动(Mobilization)菜豆根瘤菌RCR3622内源质粒的诱动转移。在种间根瘤菌杂交过程中,二个巨型质粒的转移频率均大于10~(-3);分子量约为285kb的psym3622是带有结瘤(nod)和产黑素(mel)基因的共生质粒(Symbiotic plasmid);这二个基因的最大距离不超过70kb左右。另一个分子量约为135kb的质粒在试验中为不具结瘤功能的隐蔽质粒。将psym3622共生质粒导入不结瘤(Nod-)的豌豆根瘤菌菌株B151,能够使后者在菜豆植物上表达结瘤的特性,形成无效根瘤。将psym3622共生质粒导入不结瘤的菜豆根瘤菌菌株JI8400,能够在菜豆植物上形成正常发育的有效根瘤。     

应用Tn5—1uxAB—sacB基因盒对根瘤菌巨型质粒进行定向标记,缺失或消除

根瘤菌是农业生产实际中应用最多的微生物肥料。随着遗传工程技术的发展和农业生产实际的需求,遗传改良根瘤菌势必要进入田间应用（l）。如何对根瘤菌在田间的应用情况如占瘤率、与土著根瘤菌的竞争生存情况等进行监测,我们采用了发光酶基因工XXAB（2）对根瘤菌实行标记。考虑到发光酶基因在根瘤菌基因组中的不同标记位置,对根瘤菌的应用情况会产生影响,特别是对标记基因的活性强弱和标记基因的稳定性造成影响,从而影响监测结果和随后的安全性评价。因此我们首先对含发光酶基因的载体进行了改造（3）,以利于对根瘤菌的染色体和巨型…     

利用Tn5转座子介导突变提高大肠杆菌丁醇生产水平

目前,对于构建高产丁醇大肠杆菌工程菌株的工作,主要是对丁醇通路和相关途径的基因进行理性改造。为进一步提升菌株的丁醇生产能力,需要发掘基因组上可影响丁醇生产能力的基因,但这很难通过已有认识或计算机模型进行预测。本工作以一株实验室前期构建的产丁醇大肠杆菌工程菌株为研究对象,利用Tn5转座子构建了一个含有1 196个菌株的突变文库。丙酮酸是丁醇的前体,并且在发酵终产物中,副产物丙酮酸的含量与丁醇的含量呈反相关,因此,可以利用丙酮酸的含量来间接反映丁醇的含量,而丙酮酸可用二硝基苯肼显色法进行快速测定,基于此,建立了96孔板——酶标仪快速筛选方法。利用该方法成功筛选到了比对照菌株丁醇产量提高了29%、49%、56%的3个突变体菌株。利用反向PCR及测序的方法,确定了其转座子插入位置分别为:pyk A、tdk、cad C基因。这些基因可以作为进一步提高菌株丁醇产量的靶点,同时这种利用Tn5转座子筛选基因靶标的策略也为构建其他微生物细胞工厂提供了新思路。     

荧光假单胞菌Tn5转座诱变及对青枯病生防特性

目的：利用Tn5转座诱变荧光假单胞菌PF20001,研究所获得的突变株对青枯病的生防效果。方法：利用三亲本杂交方式,将带有转座子Tn5的Tn5-102（含luxAB）的质粒pTR102成功地转入PF20001,利用平板相互拮抗法分析突变株对青枯病致病菌的拮抗作用。结果：通过诱导Tn5转座,得到荧光假单胞菌PF20001的Tn5插入突变库。经平板相互拮抗实验发现,菌株PF20001-lux-48拮抗圈明显大于野生型（半径达0.35cm）。用Tn5-lux特异引物进行PCR扩增,结果显示只有以该突变株的DNA为模板才能得到300bp的扩增产物,证实该菌株基因组中有Tn5插入。结论：Tn5的插入使菌株PF20001对青枯病生物防治能力增强。