小鼠pEGFP-Hoxa11真核表达载体的构建及表达

目的 构建和鉴定Hoxa11和EGFP双基因共表达真核载体.方法 采用DNA重组技术,将目的 基因Hoxa11克隆至含有报告基因EGFP的pEGFP-N1真核表达载体中,构建的真核表达载体pEGFP-Hoxa11经PCR,双酶切及基因测序鉴定;转染至CHO细胞,荧光显微镜下观察重组质粒的表达,提取细胞蛋白Western印迹检测蛋白表达.结果 pEGFP-Hoxa11重组质粒构建成功.构建的真核表达载体pEGFP-Hoxa11能在CHO细胞中有效表达.结论 成功构建了共表达Hoxa11和EGFP的真核表达载体,并能在CHO细胞中有效表达.为进一步研究Hoxa11的功能提供实验基础.     

结核分枝杆菌Rv1884基因真核表达质粒的构建及表达

目的:构建结核分枝杆菌Rv1884基因真核表达载体。方法:PCR扩增Rv1884基因,测序正确后克隆入真核表达载体pcDNA3.1(-);经酶切鉴定正确的重组质粒酶以阳离子聚合物转染P815细胞后,以RT-PCR方法检测mRNA的表达,以间接免疫荧光技术检测目的蛋白的表达。结果:构建了重组质粒pcDNA-Rv1884;RT-PCR结果证明Rv1884可在P815细胞中转录;用间接免疫荧光检测,表达有Rv1884蛋白的细胞着染。结论:构建了结核分枝杆菌Rv1884基因的真核表达载体pcDNA-Rv1884,Rv1884基因可以在P815细胞中表达。     

沙眼衣原体真核表达质粒pcDNA4/CT703的构建及其表达

目的：构建含沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis, Ct）基因CT703的真核重组表达质粒pcDNA4/CT703,并检测其在HeLa细胞中的表达.方法：利用RT-PCR扩增CT703基因,然后将其亚克隆到真核表达载体pcDNA4,PCR、双酶切和测序检测重组质粒.将正确的重组质粒瞬时转染HeLa细胞,免疫荧光和Western Blot实验检测重组质粒目的蛋白表达. 结果：经PCR、双酶切和测序鉴定后,成功构建了真核重组表达质粒pcDNA4/CT703,将其转染HeLa细胞后,免疫荧光和Western Blot实验能检测到目的蛋白的表达.结论：成功构建了重组质粒pcDNA4/CT703,并能在HeLa细胞中表达,为进一步研究CT703的功能奠定了基础.     

人DC-SIGN真核表达载体的构建及其在A549细胞中的表达

目的:构建人DC-SIGN基因真核表达质粒,观察其在人肺腺癌细胞A549中的表达.为进一步研究DC-SIGN的作用奠定实验基础.方法:用PCR的方法扩增编码DC-SIGN的基因序列,将其克隆到真核表达载体pCDNA中,酶切及测序鉴定重组质粒.将构建的重组质粒转染到A549细胞中,用Western Blotting和免疫荧光等方法检测DC-SIGN基因的表达.结果: 从人cDNA文库中得到1 215bp的DC-SIGN序列后,重组到pCDNA载体中,经酶切及测序鉴定,成功构建pCDNA-DC-SIGN重组质粒.重组质粒转染A549细胞,经Western blotting检测,发现在约55kDa处有特异条带,与理论大小相符.应用免疫荧光技术检测DC-SIGN可在A549细胞内的表达.荧光显示Myf5蛋白定位在细胞浆中.建立表达DC-SIGN的细胞株.结论:成功构建了人DC-SIGN的真核表达载体,并建立了人DC-SIGN的真核表达细胞株.     

结核分枝杆菌esat6-mpt64融合基因真核表达载体的构建

目的:构建结核分枝杆菌分泌蛋白基因esat6-mpt64的真核表达载体。方法:用PCR法从结核分枝杆菌H37Rv株基因组中分别扩增esat6、mpt64基因,插入pGEM-T-easy载体,序列测定正确后,将其亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1( );重组质粒经酶切鉴定正确后,用LipofectAMINE2000转染COS-7细胞;用RT-PCR检测mRNA的表达,用间接免疫荧光技术检测目的蛋白的表达。结果:RT-PCR表明esat6-mpt64融合基因可在COS-7细胞中转录;用间接免疫荧光检测,有表达蛋白的细胞着染。结论:构建了真核表达载体pcDNA-esat6-mpt64,并在真核COS-7细胞中表达。     

小鼠B7-H4基因的真核表达及其对淋巴细胞增殖的影响

目的构建小鼠B7-H4胞外段的真核表达载体,观察其在体外对淋巴细胞增殖的影响,为深入研究B7-H4在T细胞活化及移植排斥反应中的作用提供实验材料。方法提取小鼠肺、脾脏总RNA,RT-PCR反转录cDNA,以此为模板,扩增B7-H4胞外段基因,将其导入pGEM-T Easy载体,构建TA-mB7-H4质粒。用XBaI和HindIII双酶切后琼脂糖凝胶电泳分析和测序鉴定。将测序证实的mB7-H4酶切后装入MYC-HIS-EGFP-N荧光表达载体中,构建B7-H4-EGFP真核表达载体,转化JM109感受态细菌,提取重组质粒,酶切后琼脂糖凝胶电泳分析和测序鉴定。同时构建control-EGFP载体。应用脂质体法将重组质粒转染CHO细胞,经G418筛选,获得稳定表达B7-H4-EGFP的CHO细胞株,用MTT分析其分别对BALB/c小鼠、C57小鼠淋巴细胞和二者混合淋巴细胞增殖的影响。结果经测序证实,所克隆的小鼠B7-H4 cDNA和构建的重组质粒基因序列正确;转染的CHO细胞能稳定地表达跨膜型重组蛋白B7-H4;表达的B7-H4对淋巴细胞增殖具有明显抑制作用。结论成功构建了B7-H4真核表达系统,能表达有生物学活性的B7-H4分子,为进一步探讨B7-H4在T细胞活化和移植排斥反应中的作用奠定了基础。     

结核分枝杆菌Rv3586结构域基因真核表达载体的构建及鉴定

目的:构建结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)环二腺苷酸(cyclic diadenosine monophosphate,c-di-AMP)合成酶Rv3586结构域基因的真核表达载体,并在COS-7细胞中表达。方法:以Mtb基因组为模板PCR扩增Rv3586三个结构域基因,分别克隆入pEGFP-N3真核表达质粒,用菌落PCR、质粒酶切和测序方法对插入序列进行鉴定。通过脂质体将重组质粒转染COS-7细胞,间接免疫荧光法检测目的基因在COS-7细胞内的表达。结果:PCR成功扩增出Rv3586三个结构域基因,菌落PCR、质粒酶切和质粒测序鉴定结果表明成功插入目的片段,包含Rv3586的三个结构域基因的真核表达载体构建成功。间接免疫荧光法结果显示,Rv3586三个结构域蛋白在COS-7细胞中表达成功。结论:成功构建Rv3586三个结构域基因的真核表达载体,并在COS-7细胞中表达成功,为后续Mtb Rv3586结构域的功能和应用研究奠定了基础。     

中国春小麦puroindoline a基因的克隆及其真核表达载体的构建

目的:puroindoline(pin)基因在控制麦类作物的籽粒硬度中起着重要作用。构建真核表达载体pcDNA3.1( )-pina-gfp,为pina基因在哺乳细胞中的表达提供基础。方法:利用PCR方法从中国春小麦基因组中克隆到了pina基因,将其插入真核表达载体pcDNA3.1( )-gfp,用PCR和酶切鉴定重组子。结果:PCR和酶切鉴定表明,所构建的真核表达重组质粒为pcDNA3.1( )-pina-gfp;将该片段克隆到pCF-T载体中,经测序验证,表明其为目的基因。结论:构建的pina基因真核表达载体pcDNA3.1( )-pina-gfp为pina基因在哺乳动物细胞中的表达提供了基础。     

结核分枝杆菌Ag85B-Esat6-HspX融合基因真核表达载体的构建

目的构建结核分枝杆菌Ag85B-Esat6-HspX融合基因,并对其在体外真核细胞中进行表达。方法用PCR法从结核分枝杆菌H37Rv株基因组中分别扩增Ag85B、Esat6、HspX基因,插入到pUC19-T载体,序列测定正确后,将融合基因再次克隆到真核表达载体pcDNA3.1（-）。重组质粒经酶切鉴定并测序正确后,用MegaTran1.0转染293T细胞,并用Western-Blot检测目的蛋白的表达。结果 Western-blot检测到分子量大小约65 kDa的目的蛋白。结论成功地构建了结核分枝杆菌Ag85B-Esat6-HspX融合基因的真核表达载体,且该重组载体可在体外真核细胞中获得特异性的表达。     

APC11基因真核表达质粒构建及鉴定

目的克隆扩增APC11开放阅读框基因片段,构建其真核表达重组质粒,为后续研究其功能做准备。方法按照GenBank中人APC11序列设计引物,以HeLa细胞cDNA为模板,扩增出基因片段。该片段与真核表达载体pEGFP-C1连接,得到的重组质粒经双酶切和测序鉴定后用Western印迹检验表达。结果扩增片段长度为285bp,重组真核表达质粒经双酶切鉴定后测序鉴定正确。Western印迹证实pEGFP—C1-APC11在真核细胞内表达。结论成功克隆了APC11基因并构建了pEGFP—C1-APC11真核表达重组质粒,Western印迹证实其表达良好,对该基因功能的深入研究打下了坚实基础。     

高山被孢霉ATCC16266△^6—脂肪酸脱氢酶基因在酿酒酵母中的表达

△^6－脂肪酸脱氢酶基因是形成γ－亚麻酸的关键酶。从含有高山被孢霉△^6－脂肪酸脱氢酶基因的重组质粒pT-MACL6中,酶切出1.4kb的目的片段,亚克隆到大肠杆菌和酿酒酵母的穿梭表达载体pYES2.0,在大肠杆菌中筛选到含有目的基因的重组质粒pYMAD6,用醋酸昔方法转化到酿洒酵母的缺陷型菌株INCSc1中,在SC－Ura合成培养基中,选择得到酿酒酵母工程株YMAD6。在合适的培养基及培养条件下,加入外源底物亚油酸,经半乳糖诱导后,收集菌体。通过GC－MS对酵母工程株进行脂肪酸色谱分析,结果表明,产生了31.6％的γ－亚麻酸,边是迄今为止,国内外△^6－脂肪酸脱氢酶基因在酿酒酵母中表达量最高的报道。     

HIV—1辅受体配体的融合表达载体的构建及表达

应用PCR扩增RANTES－KDEL基因,鉴定后与真核表达载体pCMV-S/K连接,构建成HIV－1辅受体的配体,趋化因子RANTES和SDF－1的融合表达载体pCMV-R-K-S-K,酶切鉴定和测序证明成功构建了pCMV-R-K-S-K融合表达载体。脂质体介导pCMV-R-K-S-K转染HeLa细胞,间接免疫荧光证实了RANTES和SDF－1可高效表达于HeLa细胞。细胞表明构建的pCMV-R-K-S-K融合表达载体能在HeLa细胞中高效表达,可用于下一步的HIV－1感染实验。     

Stathmin SiRNA表达载体抑制stathmin的表达

目的:构建stathmin特异性SiRNA质粒表达载体,探讨其对鼻咽癌5-8F细胞stathmin的沉默作用.方法:合成用于stathmin基因特异性干扰表达的DNA片段,经退火形成双链DNA片段,片段克隆到质粒表达载体pGenesil 1.1上.载体导入JM109菌株进行筛选与扩增,采用酶切和测序对克隆表达载体进行鉴定.应用脂质体将鉴定后的重组表达质粒载体转入鼻咽癌5 -8F细胞,RT-PCR与Western Blot分析stathmin基因表达.结果:经酶切和测序鉴定,插入SiRNA质粒表达载体的stathmin特异性碱基序列和方向正确.重组质粒表达载体转染鼻咽癌细胞后,细胞转染效率达78.8 ±6.8％,stathmin基因在鼻咽癌中的表达明显下降.结论:构建的stathmin基因SiRNA质粒表达载体能抑制stathmin的表达.     

外源基因在昆虫杆状病毒表达系统中的表达

随着杆状病毒载体和筛选方法的不断改进,通过Bac-to-Bac方法可以使杆状病毒最大重组率达到100%,缩短了构建重组载体的时间,极大提高了工作效率。另外,研究者开发了一些新的宿主域扩大的昆虫杆状病毒载体,能够在家蚕或蛹内进行高水平表达重组蛋白。昆虫杆状病毒表达系统具有完备的翻译后加工修饰功能和高效表达外源蛋白的能力等特点,是一种非常理想的真核表达系统。利用该表达系统现已成功表达了约千种外源蛋白。以重组杆状病毒为载体的昆虫表达系统、外源基因在该表达系统中的表达情况及在农业领域中的应用进行了介绍。     

重组人肝素酶在毕赤酵母中的表达

目的:建立肝素酶表达系统,大量制备人肝素酶,用于肝素酶的深入研究,及其抑制剂筛选模型的建立。方法:采用RT-PCR方法从肝癌细胞HepG2中克隆肝素酶全长cDNA,转入毕赤酵母表达体系,经甲醇诱导表达。结果:四唑蓝活性检测结果表明,表达产物具有肝素酶活性;Western印迹证实表达产物可被肝素酶抗体识别。结论:表达产物中含具有肝素酶活性的重组人肝素酶。     

HIV-1辅受体配体的融合表达载体的构建及表达

应用PCR扩增RANTES-KDEL基因,鉴定后与真核表达载体pCMV-S/K连接,构建成HIV-1辅受体的配体、趋化因子RANTES和SDF-1的融合表达载体pCMV-R-K-S-K,酶切鉴定和测序证明成功构建了pCMV-R-K-S-K融合表达载体.脂质体介导pCMV-R-K-S-K转染HeLa细胞,间接免疫荧光证实RANTES和SDF-1可高效表达于HeLa细胞.结果表明构建的pCMV-R-K-S-K融合表达载体能在HeLa细胞中高效表达,可用于下一步的HIV-1感染实验.     

Expression of Concern

“MiRNA‐218 regulates osteoclast differentiation and inflammation response in periodontitis rats through MMP9”, Cell. Microbiol. 2019;21:e12979, by Jie Guo, Xuemin Zeng, Jie Miao, Chunpeng Liu, Fulan Wei, Dongxu Liu, Zhong Zheng, Kang Ting, Chunling Wang, and Yi Liu. The Editors of Cellular Microbiology and the publisher John Wiley & Sons agree to publish an Expression of Concern regarding the above article, published online in Cellular Microbiology on November 16, 2018, in Wiley Online Library ( https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/cmi.12979 ). In September 2019, the journal was contacted regarding concerns about the data presented in Figures 6 and 7 because of high level of similarities in the graphs presented in these figures. The different bars in the graphs show identical height. The standard deviation bars are also of identical length. Although one graph expresses the number of TRAP‐positive cells (Figure 6b) and the other graphs express the relative mRNA expression of different osteoclast‐related genes (Figure 6c‐g), all graphs are identical. The bars in the graphs in Figure 7 that represent 5 different osteoclast genes show the same height. Figures 6 and 7 show identical mRNA expression for a series of different genes: V‐ATPase, NFATc1, CTSK, DC‐STAMP and TRAP. In December 2019, the journal requested the authors to provide the raw data of the experiments presented in the article and for explanations of the similarities. The authors responded that the similarities were due to unintentional errors and provided Excel spread sheets containing processed data in March 2020. The data provided in the Excel sheets that were sent by the authors were analyzed and it was concluded that the calculations as shown in the Excel sheets are correct. However, the concerns raised regarding similarities in the heights of bars representing different parameters and narrow range of standard deviations presented in Figures 6–7 remained. The authors disagree with the concerns raised. In addition, the editors were concerned by manipulations of western blot images to represent single bands instead of doublets for COL1 in Figures 5 and 8 and for MMP9 in Figures 3A and C, 4C, 5A and D, and 8A. The first issue concerning COL1 bands has been addressed and corrected during the peer‐review process. The latter has been clarified after publication and following a request from the editors for the raw data of all figures in the article. In the published article, western blots of MMP‐9 in Figures 3A and C, 4C, 5A and D, and 8A show active‐MMP‐9 only and do not include pro‐MMP‐9 bands that were present in the original western blot experiments. The authors explained that on the original blots that were provided during the peer‐review process, MMP‐9 show doublets that represent pro‐MMP‐9 and active‐MMP‐9. As no significant difference was found for pro‐MMP‐9, the authors only presented single bands for active‐MMP‐9 in the publication version. The authors’ institution, Shandong University, did not respond to a request from the Publisher and the Editor‐in‐Chief to investigate whether the data arose from the originally reported experiments, are unmodified, and are suitable for publication. As a result, the journal is issuing this expression of concern to readers.