Vero细胞培养A/Shanghai/CN02/2013(H7N9)Va流感病毒适宜条件研究

目的:优化Vero细胞培养H7N9流感病毒的培养条件,建立细胞培养病毒高产培养系统。方法:采用不同病毒接种MOI、培养温度、pH值和TPCK胰酶等条件优化培养H7N9流感病毒Vero细胞适应株A/Shanghai/CN02/2013(H7N9)Va的条件,并将其连续传代后扩大至细胞工厂大规模培养。结果:Vero细胞高产H7N9流感病毒培养条件为DMEM/F12和MEM以1∶1混合,并添加0.3 mg/mL牛血清白蛋白、1%谷氨酰胺、0.5%双抗和1.5μg/mL TPCK胰蛋白酶,pH为7.4时,连续传代病毒血凝效价保持在512,扩大至细胞工厂大规模培养病毒产量稳定。结论:建立的Vero细胞培养H7N9流感病毒条件,能够持续稳定高产,并适用于细胞工厂大规模培养,有望用于H7N9流感细胞疫苗的大规模制备。     

重组人禽流感H7N9疫苗株在Vero细胞上的适应性和传代稳定性研究

本文主要研究重组人感染高致病性禽流感H7N9株作为主工作种子批在Vero细胞连续传代中的高产特性和传代稳定性,为疫苗开发提供前期研究。将重组获得的H7N9流感病毒Vero细胞适应株(A/Anhui/1/2013Va)按照病毒感染复数(MOI) 0. 01的病毒量接种于Vero细胞,并连续传15代。血凝试验检测每代病毒血凝效价,并绘制病毒在Vero细胞上的生长曲线;每代病毒用MDCK细胞检测病毒的感染性滴度;通过单向免疫扩散试验对重组病毒H7N9的第1及第16代进行型别鉴定;取第1、5及16代病毒,用鸡胚半数感染量及致死量检测病毒在传代过程中毒力变化;分别提取第1和16代H7N9流感病毒的RNA,反转录及克隆后测序,对比病毒在连续传代过程中血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因的变化。试验结果表明:在连续传代过程中,病毒效价越来越趋于稳定,血凝效价稳定维持在384～448;病毒感染性滴度维持在7 Log10TCID50/mL左右;病毒在传代过程中毒力未发生显著变化; HA和NA在连续传代过程中并未出现因基因变异导致的编码氨基酸改变的状况。H7N9安徽株病毒在Vero细胞传代过程中不仅产量稳定,其毒力和基因也很稳定,可以将其作为H7N9流感疫苗候选株。     

季节性流感裂解疫苗在小鼠中针对同型与异型流感病毒的免疫保护效力

为了研究季节性流感裂解疫苗在小鼠中针对甲型流感病毒同型同株、同型异株、异型异株攻击的免疫保护效力及其与诱发的血凝抑制(HI)抗体滴度的关系,本研究使用我国2008~2009年度季节性流感裂解疫苗中不同剂量的甲1型流感病毒H1N1(疫苗株病毒A/Brisbane/59/2007(H1N1)-like)和甲3型流感病毒的H3N2(疫苗株病毒A/Brisbane/10/2007(H3N2)-like)疫苗组分免疫BALB/c小鼠,首先确定了能在小鼠中诱发血HI抗体滴度达到40的疫苗免疫剂量;然后以此剂量免疫小鼠,分别使用同型同株流感病毒(鼠肺适应株A/Brisbane/59/2007(H1N1)-like virus(MA))(简称A1)和同型异株流感病毒(鼠肺适应株A/Purto Rico/8/34(H1N1))(简称PR8)攻击H1N1疫苗免疫小鼠,使用异型异株流感病毒A1攻击H3N2疫苗免疫小鼠,通过体重变化和存活率情况,探讨季节性流感疫苗在小鼠中针对甲型流感病毒同型同株、同型异株、异型异株攻击的保护效力。结果显示,季节性流感裂解疫苗H1N1和H3N2组分按照HA不同剂量0.15μg、0.5μg、1.5μg、5μg和15μg免疫小鼠后,所诱发的HI抗体滴度随免疫剂量的增加而增强,1.5μgHA即可以诱发免疫小鼠HI抗体滴度达到40;以此剂量免疫小鼠,分别使用3LD50、10LD50、30LD50、100LD50、300LD50、1 000LD50和3 000LD50的同型同株流感病毒A1进行攻击,1.5μgH1N1疫苗可以100%保护小鼠抵御高至1000LD50同型同株流感病毒A1的攻击,15μg甚至可以100%保护3 000LD50同型同株流感病毒A1的攻击,但是这两个剂量免疫的小鼠在低至3LD50同型异株流感病毒PR8的攻击后都全部死亡;使用可以诱发HI抗体滴度达到140的15μg H3N2疫苗免疫小鼠,在低至3LD50异型异株流感病毒A1的攻击后亦全部死亡。以上结果表明,季节性流感疫苗可使小鼠HI抗体滴度达到40的疫苗免疫剂量为1.5μg,该免疫剂量可以有效保护小鼠抵御同型同株流感病毒的攻击,但是难以保护小鼠抵御同型异株与异型异株流感病毒的攻击,这一结果为建立以季节性流感疫苗为参考的免疫保护评价体系提供了实验依据。     

人源中和性抗高致病性禽流感病毒H5N1基因工程全抗体的研制

运用噬菌体表面呈现技术,从禽流感病人恢复期血中获得淋巴细胞,通过基因工程手段,构建了人源抗H5NI禽流感病毒基因工程抗体文库.用纯化的人源H5N1禽流感病毒颗粒(A/Anhui/1/2005)及重组血凝素蛋白HA(A/Viet Nam/1203/2004)对Fab噬菌体抗体库进行富集筛选,成功地获得了抗禽流感病毒H5N1血凝素蛋白HA的人源单抗Fab段基因,并在大肠杆菌中获得有效表达.通过序列测定确定抗体轻重链型别,然后将阳性克隆的轻链和重链Fd段基因分别克隆入全抗体表达载体pAC-L-Fc后转染昆虫Sf9细胞,利用杆状病毒/昆虫细胞系统实现全抗体的分泌型表达.用ELISA、IFA和流式细胞术对所获人源单抗的功能特性进行鉴定.结果表明,我们获得了2株特异性针对H5N1禽流感病毒血凝素蛋白HA而与甲1型和甲3型人流感病毒无交叉反应的人源单抗(AVFlulgG01、AVFlulgG03).微量中和试验结果表明,除A/Guangdong/1/2006外,AVFlu-IgG01能够广泛地中和HA基因进化上属于Clade 2的中国南方、北方及中部地区的H5N1禽流感病毒分离株,同时还对属于Clade Ⅰ的越南H5N1分离株A/Viet Nam/1203/2004具有中和活性;AVFluIgG03虽然不能中和A/Viet Nam/1203/2004,但是对属于Clade 2的所有中国H5N1分离株均具有中和作用.人源中和性抗禽流感病毒H5N1基因工程全抗体的获得不仅为高致病性禽流感病毒H5N1的预防和治疗带来了希望,同时也为其疫苗研制提供了新的思路.     

作者更正启事

正应作者要求,本刊2018年第6期778～782页刊登的研究报告《Vero细胞培养A/Shanghai/CN02/2013(H7N9)Va流感病毒适宜条件研究》(作者:非成瑞等)一文中,毒株编号有误。正确的文题应为《Vero细胞培养A/Shanghai/02/2013(H7N9)Va流感病毒适宜条件研究》,所涉及的毒株编号应为"A/Shanghai/02/2013(H7N9)Va",     

抗禽流感病毒H5N1亚型单克隆抗体制备初报

目的制备禽流感H5N1亚型病毒的单克隆抗体,为相关研究提供工具。方法以禽流感H5N1亚型病毒免疫BALBc小鼠,取其脾细胞和SP20细胞融合,用血凝抑制试验(HI)和酶联免疫反应(ELISA)检测培养上清,并将阳性融合细胞稀释克隆化3次直至100%孔均为阳性,筛选阳性克隆株,运用免疫荧光法评估单克隆抗体检测病毒感染的犬肾细胞(MDCK)。结果得到三株稳定分泌抗体的细胞并命名为F8、F9、G11,抗体亚型鉴定结果分别为IgG1、IgG2a和IgG2b;在免疫荧光法单克隆抗体能够检测出感染MDCK细胞的病毒。结论建立了3株抗禽流感H5N1亚型病毒的单克隆抗体细胞株,其产生的一株高特异性的McAbG11能够用于H5N1亚型禽流感病毒感染诊断,并可能应用于禽流感病毒H5N1亚型感染的防治。     

小鼠对重组痘苗病毒表达流感病毒血凝素的免疫反应

实验比较了小鼠对表达流感病毒A/NJ/11/76(H1N1)和A/Jap/305/57(H2N2)血凝素基因的痘苗病毒重组株HSW2和VInf1的免疫反应,两株重组病毒经静脉或静脉加鼻腔免疫小鼠后都产生相应血凝抑制抗体;用不同剂量的痘苗病毒重组株HSW2皮内接种家兔也产生相应抗体,且抗体滴度与接种的病毒量成正比关系,但用痘苗病毒野毒株免疫的家兔未测到抗体,这两株痘苗病毒重组株免疫的小鼠,能保护小鼠对流感病毒母株的攻击,HSW2和VInf1的保护指数分别为3.3和3.9个对数,但这两株病毒未能诱导细胞毒性T细胞反应。     

百合无症病毒单克隆抗体的制备及检测应用

用百合无症病毒(Lilysymptomlessvirus,LSV)免疫的BALBC鼠脾细胞与SP20鼠骨髓瘤细胞融合,经筛选克隆,获得4株能稳定传代并分泌抗LSV单克隆抗体(MAb)的杂交瘤细胞(2A2、5H9、5H2和5E12),并分别制备它们的单抗腹水。4株单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10-6,5H9和5E12的抗体类型及亚类均为IgG1,而2A2和5H2均为IgG3,4株单克隆抗体的轻链均为κ链。利用单克隆抗体建立了抗原包被间接ELISA(ACP-ELISA)检测LSV的方法。病叶作1300倍稀释、提纯LSV病毒浓度为18ngmL(每孔的病毒绝对量为1.8ng)时,该方法仍能检测到病毒。利用ACP-ELISA检测了田间样品,发现LSV在百合上发病很普遍。     

抗Dysbindin-1多肽双抗夹心ELISA的建立及在肝癌中的应用

目的:制备抗人Dysbindin-1特异性单克隆抗体,建立DAS-ELISA检测体系,并初步应用于肝癌血清的检测。方法:采用合成免疫原免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术制备抗Dysbindin-1单克隆抗体,用HRP标记单克隆抗体,ELISA和SDS-PAGE电泳法检测抗体的亚类、滴度;采用DAS-ELISA技术制备Dysbindin-1检测试剂盒,检测正常、肝硬化及肝癌患者各30例血清并比较其差异。结果:细胞融合后获得了4株稳定产生抗Dysbindin-1单克隆抗体的杂交瘤细胞株(1C6A11、1E8H3、2D1C11、5B6D4),抗体亚类分别为IgG2b,IgG2b,IgG1和IgG2a,杂交瘤细胞诱生的腹水抗体效价达106以上,通过抗体配对实验筛选确定2D1C11作为包被抗体,1E8H3作为酶标抗体。该ELISA方法线性范围为62.5-1000ng/mL,检测限为62.5ng/mL;应用该方法检测显示正常组与肝硬化组及肝癌组间差异显著(P0.001),Dysbindin-1诊断肝癌的敏感性和特异性分别为90%和93.3%。结论:Dysbindin-1可以成为新的候选的肝癌血清标志物,抗Dysbindin-1多肽双抗夹心ELISA体系可以初步应用于肝癌的早期诊断。     

2015-2020年大连市流感病毒分离鉴定情况分析

对2015-2020年大连市流感病毒分离鉴定情况进行对比分析, 为大连市流感防控工作提供参考。

采集大连市2家国家级流感监测哨点医院的流感样病例咽拭子样本, 用MDCK细胞和鸡胚分别进行病毒分离培养, 并采用HA试验和HI试验对分离的病毒滴度和型别进行鉴定。

2015-2020年共分离培养流感病毒核酸检测阳性的咽拭子1 055份, 其中MDCK细胞分离出流感病毒501株, 鸡胚分离出流感病毒72株, 总体病毒分离率54.31%。MDCK细胞分离出A(H1N1)、A(H3N2)、B(Victoria)和B(Yamagata)型病毒, 鸡胚对A(H3N2)型病毒不敏感, 但可以分离出A(H1N1)、B(Victoria)和B(Yamagata)型病毒。每年的优势毒株虽不同, 但分离流感病毒的月份均在流行季内, 与北方流行形势一致。

MDCK细胞与鸡胚的流感病毒分离率不同。大连市每年流感流行的优势株和流行程度虽不同, 但流行程度处于相对平稳状态。