芪合酶基因Fm-STS在何首乌毛状根中的过量表达及dsRNA干扰

目的:建立一套探究植物基因功能的方法体系,验证由芪合酶基因保守序列通过RACE扩增技术在何首乌中得到的基因Fm -STS的功能.方法:由含CaMV 35S启动子驱动的gfp基因的植物转基因表达基础质粒pBIN-35S-GFP构建过表达质粒pBIN-35S-STS-GFP(阳性)和双链RNA干扰重组质粒pBIN-35S-正向-反向-GFP(阴性),并同空白表达质粒pBIN-35S-GFP(空白)均导入野生型发根农杆菌ATCC15834中,转化何首乌外植体,诱导生成毛状根并培养,对毛状根进行高效液相色谱分析以及实时荧光定量检测.结果:在过表达组、空白组和干扰组中毛状根中发根农杆菌Ri质粒中的rolB基因和外源基因gfp均有表达,高效液相色谱法分析芪合物二苯乙烯苷含量依次为4.67mg/g、2.18mg/g和0.65 mg/g,在mRNA水平上测试荧光定量检测基因Fm-STS表达量:RNAi组是空白组的1/433.53,过表达组是空白组的2.41倍.结论:结果表明过量表达与双链RNA干扰相结合在植物基因功能研究中有良好的应用,何首乌中芪合酶Fm-STS是二苯乙烯苷主要的合成酶.     

何首乌不同部位二苯乙烯苷含量以及芪合酶FM-STS时空表达差异

目的:探究何首乌不同部位主要有效成分二苯乙烯苷含量差异以及相对应部位何首乌芪合酶基因FM-STS表达差并.方法:通过液氮碾磨提取广东德庆同一株何首乌根茎叶中的RNA以及用50％稀乙醇过夜浸提芪合物二苯乙烯苷;使用乙腈和水为流动相(体积比为20∶80),利用高效液相色谱分析其二苯乙烯苷含量差异;采用实时荧光定量PCR分析芪合酶基因Fm-STS表达差异,以β-actin作为内参对照,2-△△CT公式计算各组别中FM-STS的含量.结果:根茎叶中芪合物二苯乙烯苷含量依次为14.62mg/g、1.78mg/g和0.47mg/g(干重),在mRNA水平上检测基因Fm-STS表达量为叶片中最高,根是叶的1/10倍,茎是叶的1/64倍.结论:芪合酶基因FM-STS主要在何首乌叶片中表达,二苯乙烯苷主要在叶片中合成,进而转移到根块中富集.     

含gfp植物转基因表达载体的构建及在矮牵牛转基因不定根中的高效表达

利用pBIN19、pGFP和pCHS质粒, 成功构建了CaMV 35S启动子驱动的gfp基因的植物转基因表达载体pBIN-35S-GFP, 并导入野生型发根农杆菌K599。矮牵牛的转化实验表明, 矮牵牛离体叶片被发根农杆菌K599(带pBIN-35S-GFP质粒)感染生根率达45%。对诱导的不定根基因组DNA的PCR检测表明, 不定根基因组中含有发根农杆菌K599 Ri质粒中的rolB基因和外源gfp基因;转基因不定根在蓝色光激发下能发出强烈的绿色荧光, 表明构建的转基因载体pBIN-35S-GFP能实现gfp基因的高效表达。该载体在CaMV 35S启动子的两端各有一个多克隆位点, 可以方便地进行启动子替换, 用于研究不同启动子的功能。此外, 该载体在gfp基因的5'端含有多克隆位点, 在3'端含有EcoRⅠ和BsmⅠ两个单一酶切位点, 可以方便地在5'端连接上目标基因, 表达含GFP的融合蛋白, 进行目标基因编码蛋白的亚细胞定位; 也可以方便地切除gfp基因, 连上需要的目的基因进行转化。     

何首乌毛状根培养及其活性成分的产生

利用发根农杆菌LBA940 2诱导药用植物何首乌产生毛状根。PCR扩增和Southern印迹杂交实验证实发根农杆菌中Ri质粒的T-DNA片段已整合进入植物核基因组中。经过基本培养基的筛选和毛状根生长动力学的考察 ,确立了何首乌毛状根在MS培养基中的最佳继代时间为 30d左右。HPLC实验测定结果显示 ,毛状根培养物中大黄酸的含量是原植物的 2 85倍     

何首乌毛状根的诱导和培养(简报)

发根农杆菌（Agrobacteriumrhizogenes）侵染后,通过其Ri质粒的T－DNA片段在植物细胞基因组中整合,诱导形成毛状根（hairyroot）l’l。利用生长迅速、生产效能高而稳定的毛状根培养物生产药用植物的次生物质,已有不少报道「一习。但未见发根农杆菌对何首乌遗传转化的报道。何首乌（Polygonu。。ltij7orumThunb．）为常用中药,其块根为乌须发、悦颜色、益精养血和抗衰老的要药。本文报道发根农杆菌对何首乌遗传转化的实验结果,为今后用毛状根培养物生产何首乌的次生物质打下基础。l材料和方法细菌菌株及培养发根农杆菌（Agrobacteri…     

特异性过表达SQS1基因的甘草毛状根培养体系的建立

目的:建立根特异性过表达鲨烯合酶(SQS)基因的甘草毛状根培养体系。方法:构建根特异性过表达甘草SQS1基因的发根农杆菌ACCC10060工程菌;侵染甘草无菌苗胚轴,共培养48 h,以诱导毛状根的形成;多次除菌后,利用PCR法及测序法对诱导获得的甘草毛状根进行验证。结果:PCR结果显示扩增得到了长度约为730、580和1400 bp的基因片段,分别与烟草根特异性启动子TobRB7、发根农杆菌rolC基因和甘草SQS1基因长度一致;测序结果进一步确定了PCR扩增序列的正确性,从而证明了甘草根特异性过表达SQS1基因毛状根诱导成功。结论:获得了大量生长良好的特异性过表达SQS1基因的甘草毛状根,为研究功能基因SQS1与甘草酸次生代谢的相关性,及提高甘草毛状根中的甘草酸含量奠定了良好的实验基础。     

发根农杆菌介导丹参牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶1基因RNA干扰载体的转化

目的：利用发根农杆菌ACCC10060介导丹参牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶1基因（SmGGPS1）RNA干扰（RNAi）载体转化丹参叶片,生成SmGGPS1的RNAi转基因毛状根。方法：根据已克隆到的SmGGPS1特异区域设计并合成2段RNAi序列,分别插入RNAi双元载体pK7GWIWG2D（Ⅱ）中,构建2个含卡那霉素（Kan）和绿色荧光蛋白（GFP）双筛选标记的植物表达载体pK7GWIWG2D（Ⅱ）-SmGGPS1-RNAi2和pK7GWIWG2D（Ⅱ）-SmGGPS1-RNAi3;利用带有上述2个RNAi载体的发根农杆菌ACCC10060侵染丹参叶片,诱导生成转基因毛状根;通过Kan抗性筛选和GFP绿色荧光观察统计转化率。结果：分别得到SmGGPS1-RNAi2和SmGGPS1-RNAi3转基因毛状根301根和399根,平均转化率为60.34%。结论：首次建立了发根农杆菌介导的外源基因转化丹参的体系。     

商陆毛状根的诱导、培养及其扼甙的产生

发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）R1601感染商陆叶片外植体1周后,在其切口处产生毛状根,20d后产生毛状根的外植体比例达70%,毛状根可直接从叶片外植体叶脉处或从叶脉处产生的愈伤组织上产生,毛状根能在无激素的MS培养基上自主生长,其呼吸速率比对照根提高85.6%,冠瘿碱检测和PCR扩增结果表明,发根农杆菌RiT-DNA的冠瘿碱合成酶基因及其Ri质粒的rol基因均已在商陆毛状根基因组中得到表达。毛状根中总皂甙含量约为自然根的1.54倍,但其多糖含量则仅为非转化根的70%。     

发根农杆菌Ri质粒在药用植物生物工程中的应用

发根农杆菌(Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ)与根癌农杆菌(Ａ.ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ)属于根瘤菌科,均为革兰氏阴性菌[1]。它们在侵染植物后引起的症状不同,含有Ｔｉ质粒的根癌农杆菌在侵染植物后形成冠瘿瘤(ｃｒｏｗｎｇａｌｌ),而含有Ｒｉ质粒的发根农杆菌表现与其不同,它在感染植物后在植物的伤口部位诱发产生毛状根(ｈａｉｒｙｒｏｏｔ)。由发根农杆菌侵染植物诱导产生的毛状根具有生长快、分枝多、根毛多等特点。发根农杆菌Ｒｉ质粒与根癌农杆菌Ｔｉ质粒结构相似,都具有高效率转移的Ｔ-ＤＮＡ区和致病的Ｖｉｒ区…     

烟草毛状根诱导及其茄尼醇含量初探

茄尼醇是合成泛醌类药物的重要中间体。以发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)W.T15834感染烟草叶片诱导产生毛状根, 探讨其茄尼醇含量变化。结果显示, 获得的毛状根能在无外源生长调节剂的MS固体和液体培养基上自主生长, 但在液体培养基中培养的毛状根生长更迅速, 也不会形成愈伤组织。甘露碱检测及PCR结果证实, 发根农杆菌Ri质粒的rolB基因已在烟草(Nicotiana tabacum)毛状根基因组中整合并得到表达。用改进的HPLC法测定烟草毛状根中的茄尼醇含量, 其结果为对照根(种子萌发产生的幼苗根)的1.12倍, 但仍比废弃烟叶中茄尼醇含量低43.2％。     

Investigation of the mechanism of temperature sensitivity of the electroreceptors of ampullae of lorenzini

In experiments on Black Sea skates (Raja clavata), the potential of the receptor epithelium of the ampullae of Lorenzini and spike activity of single nerve fibers connected to them were investigated during electrical and temperature stimulation. Usually the potential within the canal was between 0 and –2 mV, and the input resistance of the ampulla 250–400 k. Heating of the region of the receptor epithelium was accompanied by a negative wave of potential, an increase in input resistance, and inhibition of spike activity. With worsening of the animal's condition the transepithelial potential became positive (up to +10 mV) but the input resistance of the ampulla during stimulation with a positive current was nonlinear in some cases: a regenerative spike of positive polarity appeared in the channel. During heating, the spike response was sometimes reversed in sign. It is suggested that fluctuations of the transepithelial potential and spike responses to temperature stimulation reflect changes in the potential difference on the basal membrane of the receptor cells, which is described by a relationship of the Nernst's or Goldman's equation type.I. P. Pavlov Institute of Physiology, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. I. M. Sechenov, Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. Pacific Institute of Oceanology, Far Eastern Scientific Center, Academy of Sciences of the USSR, Vladivostok. Translated from Neirofiziologiya, Vol. 12, No. 1, pp. 67–74, January–February, 1980.