回转模拟失重对心肌成纤维细胞Ⅰ型胶原代谢的影响

为探讨模拟失重对心肌成纤维细胞Ⅰ型胶原代谢的影响 ,本研究采用回转器模拟失重效应 ,通过免疫细胞化学和反转录聚合酶链式反应 (RT PCR)研究了回转模拟失重对原代培养的新生大鼠心肌成纤维细胞Ⅰ型胶原蛋白及mRNA表达 ,以及胶原降解抑制物———金属蛋白酶组织抑制因子 (Tissueinhibitorofmetallopro teinase ,TIMP)mRNA表达的影响。免疫细胞化学染色显示回转组Ⅰ型胶原蛋白沉积增加 ;RT PCR分析显示Ⅰ型胶原α1链 (TypeⅠcollagenα1chain ,ColⅠA1)mRNA表达没有明显变化 ,TIMP 1、TIMP 2及TIMP 3的mRNA表达均增强。提示在回转模拟失重条件下 ,心肌成纤维细胞Ⅰ型胶原蛋白沉积增加 ,作为胶原降解抑制物的TIMP可能是造成胶原沉积的原因     

粗纤维调节素对小鼠成纤维细胞Ⅰ型前胶原基因表达的影响

为了确定粗纤维调节素（Ｕｎ） 是否具有促进成纤维细胞Ⅰ型胶原合成的作用, 我们采用地高辛原位杂交和斑点杂交技术, 观察了Ｕｎ 对小鼠成纤维细胞（ＮＩＨ／３Ｔ３） Ⅰ型前胶原ｍ ＲＮＡ转录的影响; 结果发现Ｕｎ 对体外培养的３Ｔ３ 细胞Ⅰ型前胶原基因转录具有促进作用; 提示Ｕｎ 不仅作为一种细胞外基质而存在, 并且还有促进胶原合成的功能。     

缺氧和DDPH对人胚肺成纤维细胞前胶原mRNA表达的影响

用核酸原位杂交和图像分析等方法,观察直接缺氧（Ｈ）和缺氧猪肺动脉内皮细胞条件培养液（ＨＥＣＣＭ）对人胚肺成纤维细胞（ＫＭＢ１７）的前胶原ｐｒｏα１（Ⅰ）,ｐｒｏα１（Ⅲ）ｍＲＮＡ表达和抗高血压药１－（２,６－二甲基苯氧基）－２－（３,４－二甲氧基苯乙氨基）丙烷盐酸盐（ＤＤＰＨ）对此过程的影响。结果发现,Ｈ和ＨＥＣＣＭ均可使ＫＭＢ１７的两型前胶原ｍＲＮＡ表达量增高,明显高于对照组（Ｐ＜０．０１）。ＤＤＰＨ对ＨＥＣＣＭ组细胞的Ⅰ,Ⅲ两型前胶原ｍＲＮＡ表达增高均有显著的抑制作用（抑制率分别为－４３．９７％和－５６．２２％）,而对Ｈ组仅抑制ｐｒｏα１（Ⅰ）前胶原ｍＲＮＡ的过量表达（－５３．５８％）。提示缺氧可直接或通过肺动脉内皮细胞的介导,促进人胚肺成纤维细胞的Ⅰ、Ⅲ两型前胶原ｍＲＮＡ表达,ＤＤＰＨ在基因转录水平上对此过程有抑制作用     

低氧时肾上腺髓质素对人胚肺成纤维细胞胶原合成和转化生长因子β1表达的影响

观察低长因子β1(TGF-β1)表达的影响.体外培养人胚肺成纤维细胞,分常氧和低氧24、48、72 h组,用[3H]-脯氨酸掺入法反映细胞总胶原合成和分泌,ELISA法检测细胞上清液中TGF-β1活化蛋白质含量.低氧24、48、72 h,细胞总胶原合成和分泌分别是常氧组的125.88%和124.74%、183.44%和165.73%、152.55%和172.93%(P＜0.01).低氧24、72 h,ADM(10-7mol/L)组细胞胶原合成分泌减少了19.24%和20.76%(P＜0.01)、9.57%(P＜0.05)和10.98%(P＜0.01);低氧48 h,ADM(10-9、10-8、10-7mol/L)组胶原合成分泌分别降低了5.57%(P＜0.05)和9.19%(P＞0.05)、11.09%(P＜0.01)和14.49%(P＜0.05)、35.41%(P＜0.01)和18.57%(P＜0.05).低氧48 h,细胞培养液中TGF-β1上升了24.17%(P＜0.05),加入ADM(10-7mol/L),TGF-β1比对照组下降了17.53%(P＜0.05);低氧72 h,ADM(10-7mol/L)组TGF-β1下降了19.49%(P＜0.05).低氧时ADM通过阻碍成纤维细胞胶原合成而影响低氧性肺血管改建及损伤组织修复过程,ADM与TGF-β1可能通过相互拮抗,共同调节成纤维细胞胶原的生成.     

RNA干扰Dnmt1和Dnmt3b对小鼠胚胎成纤维细胞凋亡和基因组DNA甲基化水平的影响

DNA甲基转移酶1(DNMT1)负责DNA甲基化维持,DNA甲基转移酶3b(DNMT3b)主要负责DNA从头甲基化,在体细胞中同时干扰Dnmt1、Dnmt3b表达会给细胞带来何种影响还未见报道。实验以小鼠胚胎成纤维细胞为实验对象,用RNA干扰方法对Dnmt1和Dnmt3b进行敲低,研究分别干扰和同时干扰这两个基因对小鼠胚胎成纤维细胞凋亡、基因组甲基化水平的影响。研究发现,si RNA转染后24 h,Dnmt3b干扰组和Dnmt1+Dnmt3b同时干扰组细胞的增殖细胞核抗原(PCNA)mRNA水平显著降低(P0.05);转染后48h,Dnmt3b单独干扰组、Dnmt1+Dnmt3b同时干扰组中细胞凋亡显著增加(P0.05);Dnmt3b单独干扰组细胞基因组甲基化水平下降32%(P0.01),Dnmt1+Dnmt3b同时干扰组细胞的基因组甲基化水平下降约44%(P0.01)。结果表明,DNMT3b在小鼠胚胎成纤维细胞正常增殖、基因组甲基化水平的维持上具有重要作用。     

转染Smad7基因的人Tenon囊成纤维细胞Smad2及Ⅰ型胶原蛋白表达的改变(简报)

大量研究表明,TGF-β作为一种具有多种功能的生长因子,是全身瘢痕愈合的重要刺激因素.在人眼部参与多种眼部纤维化的过程。尤其在促进青光眼滤过术后结膜瘢痕形成中起重要作用。Smad蛋白家族在TGF-β超家族的信号转导中具有重要的作用。Smad7主要通过抑制TGF书受体介导的Smad2、Smad3磷酸化来拮抗TGF-β的信号转导,被认为是TGF-β超家族信号转导自我调节的一种负反馈信号。     

人胚肺成纤维细胞与人肺腺癌细胞共同培养时的形态学变化

本文在混合培养的基础上建立了一种新的细胞培养技术。选用人肺腺癌细胞和人胚肺成纤维细胞,将两者按一定顺序定位培养在同一容器内的盖玻片上。在两种细胞相遇后,于不同时间取出长有细胞的盖片制成光镜和电镜标本。透射电镜标本采用了经过改进的原位包埋、水平切片法,使两种不同类型的细胞之间在定位培养时的超微结构变化得到充分显示。观察结果表明：两种细胞定位培养４天时,光镜观察未见明显的形态学改变,但电镜下已显示出变化;培养７天时,光镜及电镜观察均可见到与肿瘤细胞接触的成纤维细胞有损伤,与成纤维细胞接触的肿瘤细胞胞膜亦有破损。细胞化学染色显示肿瘤细胞周围的成纤维细胞内琥珀酸脱氢酶（ＳＤＨ）活性降低。     

腺病毒载体介导的GFP基因在鸭胚成纤维细胞中的表达及RNA干扰

目的：建立在鸭胚成纤维细胞（DEF）中进行RNA干扰（RNAi）的技术平台,为鸭基因组功能的研究提供新的技术手段。方法：以绿色荧光蛋白（GFP）基因为报告基因,脂质体转染化学合成的GFP特异小干扰RNA（GFP-siRNA）,用流式细胞仪测定GFP-siRNA对重组腺病毒（Adv-GFP）介导的GFP基因在DEF中表达的干扰效果。结果：200MOI（感染复数）Adv-GFP介导的GFP基因在DEF中表达效率最高,为31．20％±3．1l％,对DEF的活力无明显影响;GFP-siRNA能有效干扰GFP基因在DEF中的表达,相对抑制率为98．56％。结论：在DEF中进行RNAi是可行的,Adv-GFP是介导外源基因在DEF中表达较为理想的载体;首次建立了在DEF中进行RNAi的技术平台,为鸭基因组的功能等研究提供了新的技术手段。     

烹调油烟挥发性有机物对人胚肺二倍体成纤维细胞活性氧水平的影响

目的：研究烹调油烟挥发性有机物（COFVOCs）对人胚肺二倍体成纤维细胞（HEIF）活性氧（ROS）水平的影响。方法：用活性炭采集烹调油烟挥发性有机物,对HELF进行染毒,采用MTT试验测得半数抑制浓度（IC50）,设计剂量和暴露时间,设立添加和不添加维生素C组,以2′,7′-二氯双氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）和双氢罗丹明123（DHR123）进行标记,通过流式细胞术检测细胞ROS水平。结果：COFVOCs刺激HELF12、24、48h的IC50分别是104．9、111．9和127．2μg／mL;HEIF胞质内ROS平均荧光强度随COFVOCs剂量增加而增高;线粒体内ROS24、48h暴露于0．8、4μg／mL剂量与阴性对照组相比有统计学差异;维生素C预处理后,ROS平均荧光强度较未预处理时均有所降低,100μg／mL剂量组前后差异有统计学意义。结论：COFVOCs可引起HELF内ROS水平升高,维生素C对细胞的ROS升高有一定的抑制作用。     

阻断Notch信号的角质形成细胞对成纤维细胞胶原合成的影响

目的:本课题组前期工作已经证明阻断Notch信号对角质形成细胞的分泌功能有所影响,使其分泌的多种促纤维化因子发生改变.本实验将探讨在复合培养的条件下,通过调节角质形成细胞中的Notch信号,了解其对成纤维细胞collagen-1合成的影响.方法:运用角质形成细胞-成纤维细胞复合培养的模型,于复合培养前3天进行血清刺激或者γ-分泌酶抑制剂DAPT阻断角质形成细胞中的Notch信号,即在角质形成细胞分化前进行干预.然后提升至气液交界面使其达到复层生长和终末分化,后与成纤维细胞共培养,观察阻断Notch信号后的角质形成细胞对成纤维细胞合成collagen-1的影响.结果:在分化前,给予角质形成细胞血清刺激,在复合培养0小时,Notch-1、Jagged-1表达明显升高(P＜0.05),在复合培养第一天,p21表达上调、p63表达下降(P＜0.05),表明在复合培养时,角质形成细胞中的Notch信号明显活化.通过在血清刺激前给予DAPT预处理,在复合培养0小时,角质形成细胞中Notch信号下游分子p21和p63的表达恢复至无血清刺激水平(P＜0.05),表明DAPT组确实阻断了角质形成细胞中的Notch信号.而DAPT组的成纤维细胞collagen-1的表达相对于血清刺激组明显下降,而与无血清组无明显差异,表明阻断Notch信号后的角质形成细胞在复合培养条件下,确实能够抑制成纤维细胞collagen-1的表达,使其合成collagen-1的量恢复至无血清刺激水平.结论:DAPT能够阻断Notch信号的活化,用阻断Notch信号后的角质形成细胞与成纤维细胞共培养,能够明显抑制成纤维细胞合成Ⅰ型胶原的能力,从而抑制瘢痕的增生.     

TNF-α和IL-13对人肺成纤维细胞胶原蛋白生成的影响

以胶原蛋白过量沉积为主要特征的纤维化是临床肺部疾患常见的病理现象。该研究利用RT-PCR技术检测不同剂量TNF-α和IL-13对人肺成纤维细胞IL-13Rα1、IL-13Rα2和Ⅰ型胶原蛋白转录水平的影响;ELISA检测细胞培养上清sIL-13Rα2分泌量;羟脯氨酸法定量分析各组肺成纤维细胞胶原蛋白生成情况。结果发现:在实验剂量条件下,TNF-α和IL-13对人肺成纤维细胞IL-13Rα1的表达无显著影响;两者均能不同程度地上调IL-13Rα2的表达;与对照组相比,TNF-α对胶原蛋白的表达有下调作用,IL-13则无显著影响。     

人Ⅰ型胶原基因第一内含子调节转录的研究

人Ⅰ型胶原α1(Ⅰ)链(COLⅠA1)基因内含子序列在不同细胞内有不同的转录调节活性.报道了含人COLⅠA1基因内含子Ⅰ不同区段(+544～+855和+820～+1 093)的重组质粒pSCEP-CAT和pSCIP-CAT的构建并转染人胚肌腱成纤维细胞和Tca 8113舌癌细胞.地高辛标记抗CAT-ELISA检测结果显示:pSCEP-CAT在两种细胞均获表达;pSCIP-CAT在人成纤维细胞未表达,但在舌癌细胞其表达量明显高于pSCEP-CAT.这表明人COLⅠA1基因内含子Ⅰ+544～+855区段增强氯霉素乙酰转移酶(CAT)表达;+820～+1093区段则抑制人成纤维细胞但显著增强舌癌细胞的CAT表达.     

人胚肺成纤维细胞WI-38中AngⅡ信号转导途径的研究

本文采用免疫荧光染色、凝胶阻滞电泳(EMSA)和Western blot等方法,观察AngⅡ刺激人胚肺二倍体成纤维细胞WI-38细胞前后,细胞中信号转导子和转录激活子STAT3、STAT1的活化状态,进而了解AngⅡ的信号转导通路.结果显示AngⅡ通过其AT1受体诱导WI-38细胞中STAT3、STAT1的磷酸化,形成以磷酸化的STAT3同源二聚体SIF-A为主的复合物,并转位入核与DNA结合,参与调控基因的表达;AngⅡ的作用存在量效及时效效应,10-3mmol/L的AngⅡ刺激60min能最强诱导WI-38细胞STAT3、STAT1的活化.因此JAK/STAT途径参与介导了An-gⅡ在WI-38中的信号转导.     

柯萨奇病毒B3型感染引起HeLa细胞内源性小干扰RNA的变化

探究柯萨奇病毒B3型(Coxsackie virus type B3, CVB3)感染的细胞是否诱导内源性小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)的产生。以CVB3接种HeLa细胞,在细胞培养箱(5% CO2、37 ℃)孵育1 h。随后加入含2%血清的细胞维持液,继续培养3 h和6 h后收集细胞。用高通量测序(二代测序) 试剂盒提取细胞RNA,并反转录合成cDNA,构建文库,上机测序。过滤数据,去除插入片段过长的序列、低质量序列、poly A序列和小片段序列,与已知的小RNA数据库比对鉴定siRNA。通过茎-环反转录-聚合酶链反应,证实内源性siRNA在感染CVB3后的表达。结果显示,感染CVB3 3 h和6 h后,HeLa细胞产生了多种内源性siRNA。其中内源性siRNA(novel_sir3502和novel_sir2806)在感染后3 h和6 h均可持续表达。经比对,novel_sir3502和 novel_sir2806均可以识别45S和28S核糖体前体RNA。结果提示,CVB3感染可能干扰核糖体成熟。     

人参不同部位皂甙对衰老的人胚肺成纤维细胞影响的细胞化学研究

应用细胞化学的定性、定位,显微分光光度计定量分析的方法,测定人参不同部位皂甙对低代龄和高代龄人胚肺成纤维细胞内多糖类(PAS反应)、酸性非特异性酯酶(ANAE)、碱性磷酸酶(ALP)、酸性磷酸酶(ACP)、单胺氧化酶(MAO)含量的影响,实验结果表明:人参根、果、茎叶皂甙(SRG、SFG、SSLG)使低代龄细胞的多糖类、MAO含量下降或上升,对ANAE台量没有显著影响。但对高代龄细胞,SFG、SRG、SSLG则显著增加了多糖类、ANAE、ALP、ACP的相对含量,同时降低了MAO的含量。本文提示,人参不同部位皂甙均可以提高衰老细胞内多糖类,ALP、ACP、ANAE的相对含量,降低MAO的含量,而对年青细胞的影响则很不一致。     

地塞米松和肺成纤维细胞对大鼠胎肺表面活性物质合成的影响

为提高ＤＥＸ对新生儿呼吸窘迫综合征（ＮＲＤＳ）的防治,本文研究了地塞米松（ＤＥＸ）促进肺表面活性物质（ＰＳ）合成的作用机制。用分离培养的２０天大鼠胚胎肺泡Ⅱ型细胞为材料,观察了单独用ＤＥＸ、用与不用ＤＥＸ刺激后的成纤维细胞条件培养液（ＤＥＸＦＣＭ、ＦＣＭ）对肺泡Ⅱ型细胞ＰＳ中磷脂合成及特异性肺表面活性物质蛋白质ＳＰＢ、ＳＰＣｍＲＮＡ表达的影响。结果表明,ＤＥＸ本身及未用ＤＥＸ刺激的ＦＣＭ对肺泡Ⅱ型细胞的上述三种指标均没有影响,而ＤＥＸ刺激后的ＤＥＸＦＣＭ使这三个指标有不同程度的增加效应。提示糖皮质激素刺激肺泡Ⅱ型细胞ＰＳ合成增加是由成纤维细胞介导的     

人胚肺成纤维细胞WI—38中AngII信号转导途径的研究

本采用免疫荧光染色、凝胶阻滞电泳（EMSA）和Western blot等方法,观察AngII刺激人胚肺二倍体成纤维细胞WI-38细胞前后,细胞中信号转导子和转录激活子STAT3、STAT1的活化状态,进而了解AngII的信号转导通路。结果显示AngII通过其AT1受体诱导WI-38细胞中STAT3、STAT1的磷酸化,形成以磷酸化的STAT3同源二聚体SIF-A为主的复合物,并转位入核与DNA结合,参与调控基因的表达;AngII的作用存在量效及时效效应,10^-3mmol/L的AngII刺激60min能最强诱导WI-38细胞STAT3、STAT1的活化。因此JAK/STAT途径参与介导了An-gII在WI-38中的信号转导。     

肝素对成纤维细胞促增殖作用的研究

应用核仁组成区相关嗜银蛋白（ＡｇＮＯＲｓ）染色和抗Ⅲ型胶原以及抗５－溴脱氧尿苷单抗免疫组化技术,观察了肝素对体外培养的ＮＩＨ／３Ｔ３成纤维细胞增殖的影响,发现：（１）肝素能促使成纤维细胞数量增加,如０．１ｍｇ／Ｌ浓度的肝素在培养第３天成纤维细胞数量相当于对照值的１．３倍;（２）对成纤维细胞ＡｇＮＯＲｓ的合成显示出明显的促进作用,如０．２ｍｇ／Ｌ浓度的肝素培养第３天,其ＡｇＮＯＲｓ数量为对照值的２．７倍;（３）进一步分析肝素对成纤维细胞ＤＮＡ和Ⅲ型胶原合成的影响,结果表明,加入０．２ｍｇ／Ｌ肝素培养第３天,Ｓ期成纤维细胞和Ⅲ型胶原阳性细胞数分别为对照值的２．７倍和１．８倍。上述实验结果为探讨肥大细胞分秘的活性介质参与器官纤维化作用的机理进而采取相应的对抗措施提供了依据     

STAT3小干扰RNA的构建及对缺氧复氧人肾小管上皮细胞凋亡的影响

目的:构建信号转导与转录因子3(STAT3)小干扰RNA(siRNA)表达载体,并观察其对缺氧复氧后人肾小管上皮细胞(HKC)凋亡的影响。方法:设计3对人STAT3 siRNA靶序列,用DNA重组技术克隆至质粒pRNAT-U6.1/neo中,构建重组质粒pRNAT-U6.1-STAT3 siRNA,检测并筛选出最佳抑制效率的siRNA质粒载体。重组质粒转染至缺氧复氧后HKC细胞,Western blotting和Real Time-PCR测定STAT3蛋白和mRNA表达量,流式细胞仪测定细胞凋亡,间接荧光法测定Bcl-2和Bax表达的变化。结果:靶向STAT3基因表达的质粒载体构建成功,并筛选出抑制效率最佳的重组质粒。缺氧复氧后HKC细胞STAT3表达、凋亡率和Bax/Bcl-2比值增加;缺氧复氧后HKC细胞转染重组质粒后STAT3表达、凋亡率和Bax/Bcl-2比值明显降低。结论:成功构建并筛选最佳抑制效率的靶向STAT3的重组质粒载体。该载体可有效抑制缺氧复氧后HKC细胞中STAT3信号转导通路的活化,并进一步通过上调Bcl-2、下调Bax蛋白的表达,从而抑制细胞凋亡。     

敲减FST基因对猪成纤维细胞中相关基因表达的影响

旨在获得敲减FST基因的猪胎儿成纤维细胞,并探讨对相关基因表达的影响。将构建成功并鉴定准确的发夹RNA真核表达载体FR1-shRNA利用脂质体转染至猪胎儿成纤维细胞中,并进行G418筛选,获得稳定转染细胞株,并利用Real-time检测了相关基因表达的变化。结果表明,在稳定转染的细胞株中,FST基因的表达受到显著抑制,结果导致了ActivinRⅡA、Myostatin和Bmp4基因的表达出现下调趋势,并且极显著地降低MyoD基因的表达。