用乙脑病毒减毒株单克隆抗体分析乙脑病毒强毒株和减毒株的抗原差别

用乙型脑炎(乙脑)病毒强毒株免疫制备的单克隆抗体(McAb)分析证明强毒株之间的抗原差别,已有研究报道。本实验用乙脑病毒减毒活疫苗2-8株免疫制备的McAb分析强毒株和减毒株之间的抗原差别。 一、乙脑病毒株 2-8株和5-3株均为减毒活疫苗株。SA14株和A2株均为强毒株,SA14株是2-8株和5-3株的母株,A2株是国内实验室标准株。     

大规模区带离心纯化Vero细胞乙脑疫苗

本文报道一种适合疫苗生产的大规模纯化Ｖｅｒｏ细胞乙脑疫苗的方法。原疫苗经适当浓缩和去除ＤＮＡ处理后,用不连续蔗糖梯度（３６％和６０％）。３２６００ｇ,速率区带离心４ｈ。纯化后疫苗的效力比中国参考疫苗高出６倍以上,补体结合抗原比中国参考疫苗高４～８倍。总蛋白含量低于３０μｇ／ｍＬ,牛血清含量降至０．５μｇ／ｍＬ以下,细胞残余ＤＮＡ低于１００ｐｇ／０．５ｍＬ。用此法连续制备三批纯化疫苗,其纯度和效力均高于日本鼠脑纯化疫苗。此法对于制备其它纯化Ｖｅｒｏ细胞疫苗也具有一定的参考意义。     

乙脑病毒的自然循环与生态阻断

流行性乙型脑炎常简称乙型脑炎或乙脑,国际上称为日本脑炎（Japanese encephalitis）,是一种发生于亚太地区的由乙脑病毒引起的中枢神经系统的媒介病毒传染病。乙脑流行的国家人口约有30亿,每年有3万一5万人发病,有约1万-1．5万人死亡,并有大量儿童由于神经损伤造成后遗症而致残。我国是乙脑流行严重的国家之一。虽然乙脑流行地区仍在扩大,但基本上滞留在亚洲。本文综述乙脑病毒在自然界的循环规律,寻找生态阻断的方法以控制乙脑的流行。     

小瓶冻干乙脑活疫苗的冻干工艺条件探索

冻干乙脑活疫苗采用小瓶灌装的生产工艺,有利于产品的内在质量和包装质量进一步提高。但其冻干工艺条件与采用安瓿灌装时的冻干工艺条件相比,存在较大差异。这主要是由于容器改变,小瓶与冻干箱板层之间无装瓶用的托底钢盘,小瓶瓶口放置有开口胶塞等原因所致。本文通过...     

乙脑病毒持续感染株preM区序列分析

为了研究乙型脑炎病毒持续感染株preM区域基因序列变异及其意义,我们将两种乙脑病毒野生株(JaGAr-01株和Nakayama株)分别感染人肝癌KN73细胞,经过多次细胞传代后建立乙脑病毒持续感染模型,收集感染细胞经反复冻融获取变异病毒。利用preM区特异引物进行RT-PCR法得到两种病毒的preM区基因片段,应用基因测序反应进行序列分析,并对两种病毒株preM区序列进行比较。preM区基因测序结果显示,与JaGAr-01野生株比较,JaGAr-01持续感染变异株(JaG-per)有1个核苷酸上碱基发生变异(第26位U→G)并导致相应氨基酸发生置换(第9位亮氨酸→精氨酸);Nakayama持续感染变异株(Nak-per)与其野生株相比则有11个核苷酸上碱基存在差异(第26位U→G,第37位G→A,第39位C→U,第45位U→C,第51位U→C,第99位U→C,第126位U→C,第165位C→U,第189位C→U,第195位C→U,第198位U→C),但仅有其中第26位、第37位、第39位的碱基变异引起相应编码的氨基酸发生置换(第9位亮氨酸→精氨酸及第13位缬氨酸→异亮氨酸)。对比还发现变异后的JaGAr-01持续感染株与Nakayama持续感染株的基因序列相同。认为乙脑病毒持续感染变异株preM区存在基因变异,这种变异可能与该区参与病毒持续感染及维持病毒生物学特性有关。     

乙脑病毒持续感染株preM区序列分析

为了研究乙型脑炎病毒持续感染株preM区域基因序列变异及其意义,我们将两种乙脑病毒野生株(JaGAr-01株和Nakayama株)分别感染人肝癌KN73细胞,经过多次细胞传代后建立乙脑病毒持续感染模型,收集感染细胞经反复冻融获取变异病毒.利用preM区特异引物进行RT-PCR法得到两种病毒的preM区基因片段,应用基因测序反应进行序列分析,并对两种病毒株preM区序列进行比较.preM区基因测序结果显示,与JaGAr-01野生株比较,JaGAr-01持续感染变异株(JaG-per)有1个核苷酸上碱基发生变异(第26位U→G)并导致相应氨基酸发生置换(第9位亮氨酸→精氨酸);Nakayama持续感染变异株(Nak-per)与其野生株相比则有11个核苷酸上碱基存在差异(第26位U→G,第37位G→A,第39位C→U,第45位U→C,第51位U→C,第99位U→C,第126位U→C,第165位C→U,第189位C→U,第195位C→U,第198位U→C),但仅有其中第26位、第37位、第39位的碱基变异引起相应编码的氨基酸发生置换(第9位亮氨酸→精氨酸及第13位缬氨酸→异亮氨酸).对比还发现变异后的JaGAr-01持续感染株与Nakayama持续感染株的基因序列相同.认为乙脑病毒持续感染变异株preM区存在基因变异,这种变异可能与该区参与病毒持续感染及维持病毒生物学特性有关.     

乙脑病毒的空间播散及迁徙事件研究

为明确乙脑病毒在空间播散的分布及分化机制,利用PhyML v3.0软件对359株具有详细信息的乙脑病毒(基因1型)E基因序列进行系统进化分析,使用PAUP v4.0软件和MigraPhyla软件包进行迁徙事件推演分析。结果显示乙脑病毒在亚洲的播散存在频繁的迁徙事件,共计发生迁徙事件95次,其中在我国境内发生54次。分析结果还显示泰国以及中国上海、山东、四川和云南等地是乙脑病毒重要的迁徙源泉地区,泰国作为源泉地区主要播散至太平洋地区的澳大利亚、柬埔寨、印度以及中国西藏;上海作为源泉地区乙脑病毒主要播散至亚洲东部沿海地区以及中国云南;山东主要播散至韩国以及中国的浙江、湖北、山西和辽宁等省份;四川主要迁徙至中国内陆省份以及越南和日本;云南作为源泉地区主要迁徙至浙江。本研究首次证实乙脑病毒在亚洲的播散存在频繁的迁徙事件,泰国以及中国上海、山东、四川和云南等省份是乙脑病毒在亚洲播散的重要源泉地区。     

三种方法检测乙脑病毒抗体的比较

目前,检测流行性乙型脑炎(简称乙脑)抗体方法较多,由于各实验室设备条件不一,不能广泛应用,为适应基层临床诊断需要,需寻求一种快速、敏感、简便方法。本实验室试用酶染色、免疫荧光和“血抑”试验对本年度收集的47份疑似乙脑病人血清(双份15人份,单份17份)及正常人血清20份,进行对比试验,测定乙脑病毒抗体。现将三种方法的结果报告如下。     

乙脑/登革2型嵌合病毒的构建

在乙脑病毒SA14-14-2株复制子载体pPartial△prM/E中克隆入DV2(Dengue virus serotype 2)的prM/E基因,构建乙脑/登革2型嵌合体克隆。将嵌合体克隆线性化后体外转录,获得的RNA转染BHK-21细胞,5～7d可观察到CPE。收获病毒上清液分别感染BHK-21细胞及C6/36细胞。接种于C6/36细胞中的嵌合病毒可使细胞出现CPE,RT-PCR、间接免疫荧光和Western blot检测显示:获得的嵌合病毒具有预期嵌合性核酸并能表达DV2的包膜蛋白,但不能在BHK-21细胞中传代培养。成功构建的乙脑/登革2型感染性克隆为进一步研究登革病毒疫苗奠定了基础。     

乙型脑炎灭活疫苗细菌内毒素检查方法的研究

将细菌内毒素检查法(凝胶法)扩大应用于乙脑灭活疫苗的质量控制及其内毒素的检测.按<中国药典>及<中国生物制品规程方法>方法,复核鲎试剂灵敏度、确定疫苗的L值、计算MVD、进行干扰试验及内毒素的检测.疫苗L值确定为300 EU/mL,MVD为1 200倍.用灵敏度0.25 EU/mL的鲎试剂,疫苗的最大非干扰浓度为将其稀释30倍,将此疫苗稀释120倍进行干扰试验,对内毒素的检测无干扰作用.以此法对15批疫苗进行内毒素检查均呈阴性反应.结果显示,此法用于乙脑灭活疫苗质量控制及其内毒素检查是可行的.     

乙型脑炎14-2株冻干活疫苗的生产研究

乙型脑炎病毒14-2株经地鼠肾细胞连续传23代,各代次的病毒滴度和回传乳鼠后的毒力都较稳定,与5-3株无差异。各代次的神经毒力和中枢神经外毒力也与5-3株相同。脑内感染12～14克小白鼠均不致死,皮下感染也不致病。用地鼠肾细胞经36℃培养4天,病毒增殖达到高峰,滴度为8.0～8.5logTCID50/0.2ml。病毒培养液的pH值为7.4～7.6时,病毒增殖高峰可持续3天。以1％明胶、5％蔗糖为保护剂,在冻干后无真空、不充氮的条件下。14—2株活疫苗在37℃可保存10天,室温(16～31℃)可保存4个月,5～8℃可保存一年,病毒滴度均无明显下降.冻干后充氮或不充氮病毒的滴度及稳定性看不出差异。冻干14—2株活疫苗融化后,用Eagle’s液稀释,置22～23℃8小时,滴度不变,若以生理盐水稀释,则可保持2～4小时;以蒸馏水稀释只能稳定2小时。     

流行性乙型脑炎病毒SA14-14-2弱毒株某些体外特征的研究

本文研究了流行性乙型脑炎病毒弱毒14-2株及5-3株的某些体外特征,发现:1.在地鼠肾细胞内弱毒株的病变较强毒株晚;在C6/36细胞内,弱毒株仅出现细胞圆缩、松散、脱落,而强毒株产生类似细胞融合型病变;在LLC-MK2和原代鸡胚细胞内,弱毒株出现模糊不清的针点状小蚀斑,而强毒株则出现清晰的3～5mm大蚀斑。2.在50℃加温条件下,14-2与SA14的热稳定性相同,但5-3的热稳定性明显地较差;两株弱毒株均能在40℃培养条件下繁殖良好,与37℃培养无明显差别,并均能在小鼠巨噬细胞内良好繁殖,但生长速度较强毒株慢,病变也较差。 本文并对弱毒株的免疫原性和ret及T50特征的关系进行了讨论。