一个小麦ω-醇溶蛋白基因同源序列的分离与序列分析

通过基因组PCR克隆了小麦济南177的一个ω-醇溶蛋白基因同源序列（ω1236）,该序列包括部分5′、3′ 侧翼序列和全部可能的编码序列,没有内含子,但在第87、117、125、160、198、313、357和365氨基酸残基处有终止密码子,所有8个终止密码的形成都是碱基转换的结果。比较分析发现,该序列与一个ω-醇溶蛋白基因序列（AB059812）有98%的同源性。推导的氨基酸序列表明该基因符合禾谷类醇溶蛋白的特点。系统进化分析表明,该序列与小麦ω醇溶蛋白在进化上亲缘关系较近,与α-,β-,γ-醇溶蛋白基因关系较远。ω1236推导的氨基酸序列编码了一个可能的47.2 kDa的蛋白质。转化大肠杆菌发现,在IPTG诱导后最初2 h,有小肽段产生,这说明在该基因序列中可能存在终止密码,这与测序结果是一致的。该研究为用PCR技术克隆ω醇溶蛋白基因和进一步研究ω醇溶蛋白基因的结构和功能积累了资料。     

节节麦-黑麦双二倍体α醇溶蛋白基因的克隆与序列分析

以人工合成节节麦-黑麦双二倍体基因组DNA为模板,用小麦种子醇溶蛋白保守引物进行PCR扩增,经克隆测序获得了843~897 bp共15个新的DNA序列(GenBank登录号为: JQ029719,JQ046392~JQ046405),分别编码280~298个氨基酸。序列比对结果表明,它们具有α-醇溶蛋白基因的典型结构特点,是α-醇溶蛋白基因家系成员,其中有两个序列为同义突变。利用14个新氨基酸序列与乳糜泻(celiac disease)病人毒性抗原相关序列的比对,发现有8个序列的Glia-α-2和Glia-α-9型抗原序列产生缺失和替换。与来自粗山羊草属和黑麦属的α-醇溶蛋白基因的编码氨基酸建立系统树,结果表明,14个DNA序列编码的氨基酸序列与粗山羊草属的相关序列聚在一起。     

节节麦-黑麦双二倍体α醇溶蛋白基因的克隆与序列分析

以人工合成节节麦-黑麦双二倍体基因组DNA为模板,用小麦种子醇溶蛋白保守引物进行PCR扩增,经克隆测序获得了843 ～ 897 bp共15个新的DNA序列(GenBank登录号为:JQ029719,JQ046392～JQ046405),分别编码280 ～298个氨基酸.序列比对结果表明,它们具有α-醇溶蛋白基因的典型结构特点,是α-醇溶蛋白基因家系成员,其中有两个序列为同义突变.利用14个新氨基酸序列与乳糜泻( celiac disease)病人毒性抗原相关序列的比对,发现有8个序列的Glia-α-2和Glia-α-9型抗原序列产生缺失和替换.与来自粗山羊草属和黑麦属的α-醇溶蛋白基因的编码氨基酸建立系统树,结果表明,14个DNA序列编码的氨基酸序列与粗山羊草属的相关序列聚在一起.     

西藏青稞4个B组醇溶蛋白基因的克隆和特征

从两份西藏青稞材料中分离克隆出4个B组醇溶蛋白基因（BH1—BH4）,DNA测序结果表明：它们均包含完整的开放阅读框。推断的氨基酸序列与先前报道的大麦B组醇溶蛋白具有相同的蛋白质基本结构。系统分析表明：它们推断的氨基酸序列与栽培大麦中的B组醇溶蛋白具有较高的相关性,与野生大麦和山羊草属的醇溶谷蛋白相似性较低。并且,在4个基因BH1—BH4中,BH1与先前报道的B组醇溶蛋白基因有较低的序列相似性,因此我们对BH1基因进行了原核表达,含该基因的表达载体在大肠杆菌中表达出相对分子质量为28．15kDa并以包涵体形式存在的蛋白,进一步对其在青稞谷粒品质改良中的潜在价值进行了探讨。     

急性呼吸道感染儿童中WU多瘤病毒基因组序列特征分析

为了解从北京地区急性呼吸道感染儿童中发现的WU多瘤病毒的基因组编码特征,并对其进行基因序列多样性分析,应用针对基因组5'端非编码区、衣壳蛋白VP1、VP2编码基因以及LTAg编码基因的引物对,从已确证为WU病毒阳性的来自北京地区急性呼吸道感染儿童的编号为BJF5276的临床标本中经聚合酶链反应扩增得到预期的基因片段,直接测序后将序列拼接得到全基因组序列,进而推导其基因组编码特征;随后从其它21例已确证为WU多瘤病毒阳性的急性呼吸道感染儿童标本中扩增得到衣壳蛋白VP2编码区基因,进行基因序列测定以及基因序列多样性分析。得到了WU病毒BJF5276全基因组序列。序列分析结果显示WU病毒BJF5276基因组序列全长为5229bp,共有5个主要的CDS(Coding domain sequences),分别编码衣壳蛋白VP2、VP3、VP1,并以其互补序列为模板,编码STAg和LTAg;所得到的22例VP2蛋白编码区基因序列同源性比较结果显示病毒VP2基因编码区序列与GenBank中已有的64个序列之间同源性很高;Mega4.0NJ进化树(Neighbor-joiningtree)分析显示这22个VP2基因序列分属于不同的基因进化簇,其中20个序列属于进化簇I中的Ia,另外2个序列属于进化簇III,其中的一个序列在IIIb基因进化簇中,另外一个序列独立成簇,不属于现有的IIIa或IIIb,暂时将其命名为IIIc。本研究结果提示北京地区的WU病毒具有多瘤病毒科的基因组编码特性;序列非常保守,有分属于不同基因进化簇的WU病毒在北京地区流行,与文献报道的以Ib流行为主所不同的是北京地区的WU病毒以Ia为主,且有新的基因进化簇出现。     

癌基因PPO及其同源性基因的结构分析

目的 采用PPO（proliferation and phosphorylation oncogene）基因与其同源性基因的结构分析,推测PPO并验证其功能。方法 利用PPO的蛋白序列寻找同源基因,比较其结构并利用蛋白免疫杂交方法证实其功能。结果 克隆了PPO基因,找到了PPO基因与小鼠、果蝇、蚊子、线虫以及酵母等的同源基因,比较发现PPO在进化上非常保守。人和小鼠的氨基酸序列有许多与磷酸化有关的功能域,并发现其中某些氨基酸在进化上非常保守。进一步研究表明PPO能使ERK2和MEK磷酸化。结论 PPO基因在进化上非常保守,与磷酸化功能有关。     

黑麦碱基因（Sec–1）表达缺失的1RS／1BL易位系的鉴定

用改良的Giemsa C－带技术、DNA原位杂交和酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳（A-PAGE）对来源于小麦品种绵阳11与不同黑麦自交系远缘杂交获得的高代株系（BC1F7）的染色体结构和醇溶蛋白进行了研究。结果发现,在鉴定的200个株系中,有45个株系经C-带和A-PAGE检测均一致地发现它们含有一对1RS /1BL易位染色体,而一个株系843-1-1,C-带鉴定、原位杂交结果均证明它含有一对1RS/1BL易位染色体,但A-PAGE醇溶蛋白图谱却不具有黑麦1RS染色体臂的黑麦碱特征带,而表达出既不同于黑麦碱又不同于亲本绵阳11的醇溶蛋白带型。这一结果表明,利用不同的黑麦亲本资源,可以获得黑麦碱基因Sec-1表达缺失的新的1RS/1BL易位系。这种新的1RS/1BL易位系缺失了影响小麦品质的黑麦碱蛋白,因此是进一步研究1RS/1BL 易位对小麦品质影响的珍贵材料。研究指出,在利用外源基因的植物育种中,外源种供体材料的遗传多样性是值得重视的基因资源。     

意大利蜜蜂甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因amGAPDH2的cDNA克隆与序列分析

应用RT-PCR技术克隆了意大利蜜蜂(Apis mellifera)甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因amGAPDH2,利用MEGA5.1、DNAMAN、PredictProtein和I-TASSER等软件对该基因进化关系以及其所对应的蛋白的同源性、理化性质和结构进行了预测和分析。从意大利蜜蜂cDNA文库中克隆得到了长1188 bp的amGAPDH2序列,GenBank登录号为MH152402。该序列具有完整的开放阅读框(ORF,114~1115 bp),其编码333个氨基酸。该基因编码的氨基酸序列与其它昆虫的GAPDH有较高的序列相似性(80%以上),系统进化分析表明amGAPDH2与中华蜜蜂、小蜜蜂的序列相似性最高。利用ProtParam等软件对amGAPDH2编码的蛋白质分析结果显示,amGAPDH2属于不稳定、亲水性蛋白;二级结构属于混合型,Helix占25.53%、Strand占24.62%、Loop占49.85%;am GAPDH2具有两个保守结构域:一个是N端的NAD(P)结合结构域,另一个是C端的催化结构域Gp_dh_C。该研究为后期amGAPDH2基因的生理功能研究提供了理论依据。     

HMMER及同源比对预测大豆病程相关蛋白

病程相关蛋白(pathogenesis related proteins,PRs)是病理或病理相关环境下诱导产生的一类蛋白,它的产生与积累是植物体应答生物或非生物胁迫的主要特征之一.近年来大量PR蛋白被鉴定,根据它们的结构特征,生物功能以及进化关系等将PR蛋白分为14个家族.然而,在重要的粮食和油料作物的大豆中发现的PR蛋白却很少,本文通过搜索拟南芥、水稻、玉米以及豆科植物所有的已有的PR蛋白,根据其保守结构域利用BLAST程序和HMMER程序同时预测大豆中可能存在的PR蛋白,通过两种方法的预测和比较整合,共得到大豆9个家族的36个PR蛋白序列.并对它们的连锁群分布、基因结构、基因长度及进化关系进行了详细的分析.发现PR家族成簇分布于Gm05、Gm10、Gm13、Gm15、Gm17、Gm19和Gm20等几个连锁群,基因普遍存在序列较短,大部分都小于1 000 bp,且内含子数目较少,结构相对简单的特点.在PR4家族中,其家族成员亲缘关系都非常相近,而PR1-4和PR1-3等与该家族其它成员亲缘关系较远的情况.本研究结果预测的PR蛋白为大豆抗病育种以及抗病基因工程研究提供了良好的基础,同时为大豆中其它家族基因预测研究以及其它物种基因家族研究提供参考方法.     

普通烟草CESA基因家族成员的鉴定、亚细胞定位及表达分析

纤维素合成酶蛋白(cellulose-synthase proteins, CESA)是一类质膜定位蛋白,以蛋白复合体的形式存在于质膜上合成纤维素,在细胞壁建成和植物生长发育过程中起着非常重要的作用。本研究利用CESA蛋白保守域序列PF03552检索普通烟草(Nicotiana tabacum L.)蛋白序列,并通过拟南芥(Arabidopsis thaliana)10个CESA蛋白序列在普通烟草基因组数据库中利用TBLASTN程序进行比对,共获得21条NtCESA基因候选序列,对这些序列进行蛋白序列理化性质分析、系统进化树构建、基因结构分析、保守结构域及跨膜区分析和组织表达模式分析,并对NtCESA9和NtCESA14两个蛋白进行了亚细胞定位实验。结果表明：获得的21条NtCESA蛋白序列的理化性质相似;系统进化分析将21个NtCESA基因和10个AtCESA基因分成5个分支,每一个分支各成员之间的进化相对保守,基因结构类似,不同分支之间的基因结构差异也较小;NtCESA蛋白结构域相对保守,都含有CESA蛋白典型的N端锌指结构、C端跨膜区和DDD-QXXRW保守功能域;组织表达分析结果表明,大部分NtCESA基因在幼苗和成熟期烟草的根、叶、胚芽和愈伤组织中都有表达,同一个分支中的基因表达模式基本一致,并且NtCESA基因参与初/次生细胞壁纤维素的合成与该基因编码蛋白的跨膜区数目存在关联,表明NtCESA基因家族成员功能上的复杂性;亚细胞定位结果证实NtCESA9和NtCESA14为质膜定位蛋白。本研究为烟草CESA基因家族功能的深入研究奠定了基础。     

小麦内源特异参照基因的查找与定性PCR和实时荧光PCR验证

目的:先从理论上查找和比对了小麦属(Triticum)γ-醇溶蛋白基因(GAG56D)为小麦特异的内源基因,并用定性PCR和实时荧光PCR方法从实验特异性上进行了验证。方法:选择小麦基因组中部分基因序列在NCBI中进行同源性分析,查找在小麦中存在的内源特异参照基因,找到小麦属(Triticum)特异的γ-醇溶蛋白基因(GAG56D),设计并合成该基因的引物和探针序列,同时用定性PCR和实时荧光PCR方法进行检测,并优化了实验条件。结果:不仅在理论上查找和比对了γ-醇溶蛋白基因为小麦特异的内源基因,并用定性PCR和实时荧光PCR方法进行了实验特异性的验证。定性PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳分析后,只在小麦属中可以检测到328bp的目的片段,而在其它作物中未扩增出目的片断。同样实时荧光PCR验证的结果小麦属内各个种均有扩增曲线出现,而在其它作物没有扩增曲线出现中。结论:该基因与方法可用作检测小麦属(唯一小麦种是栽培作物)内源特异参照基因。     

葡萄SAUR基因家族鉴定与生物信息学分析

为了研究葡萄早期应答生长素基因SAUR(Small auxin-up RNA)家族,本研究利用全基因组信息鉴定了葡萄64个SAUR家族成员,并对SAUR家族成员的基因结构、氨基酸特性、染色体定位、基因进化、基因功能以及组织表达进行分析。结果表明,葡萄全基因组上64个SAUR家族成员在19条染色体中的8条染色体上呈现簇状分布,主要分布在3、4号染色体上,其中3号染色体上数量最多为37个;葡萄SAUR家族基因长度较短,有59个基因是无内含子基因;蛋白理化特征分析显示,多数SAUR蛋白呈碱性,结构稳定性较差,蛋白脂溶指数高,呈亲水性;基因功能预测结果表明,葡萄SAUR基因主要担当生长因子、结构蛋白、转录、转录调控以及响应胁迫应答和免疫应答6种功能,其中更多参与生长调节功能;根据系统进化分析将其分为10个分支,另外不同组织表达谱的分析结果表明SAUR基因家族成员具有不同的组织表达模式,对于非生物胁迫具有一定的调节作用。这些信息为葡萄SAUR基因家族功能分析奠定了一定的工作基础。     

烟草BRANCHED1-Like基因的克隆及表达分析

TCP基因家族CYC/TB1簇中成员BRC1在调控植物侧枝发育的过程中发挥重要作用。本研究利用电子克隆的策略结合RT-PCR方法从普通烟草（Nicotiana tabacum）中克隆到4个NtBRC1-Like基因,分别命名为NtBRC1-Like1、2、3和4。4条基因的CDS序列长度分别为1140、1062、987和1041bp,分别编码由379、353、328和346个氨基酸组成的蛋白,这4个蛋白与CYC/TB1簇中其它成员具有较高同源性。蛋白质保守结构域分析表明,4个NtBRC1-Like基因编码蛋白除具有TCP核心结构域外,还具有CYC/TB1簇蛋白特有的R结构域。系统进化树分析表明,NtBRC1-Like蛋白都是TCP家族CYC/TB1簇中的成员,且4个NtBRC1-Like蛋白可以被分成两组,NtBRC1-Like1和4为一组,NtBRC1-Like2和3为另一组。荧光定量PCR分析发现,4条烟草NtBRC1-Like基因的表达呈现明显的组织特异性,且其表达模式可分为两种：NtBRC1-Like1和4的表达模式相似,在腋芽中有极高的表达;NtBRC1-Like2和3的表达模式十分相像,在叶和腋芽中的表达量都显著高于其它组织。推测烟草BRC1基因可能存在类似番茄BRC1基因在功能上保守与进化的情况。     

10kD玉米醇溶蛋白基因的克隆与植物表达载体构建

由于紫花苜蓿中的含硫氨基酸水平很低,采用基因工程手段将富硫蛋白基因-10kD玉米醇溶蛋白(zein)基因转入苜蓿中以提高其水平。根据该基因的保守序列设计引物,并在下游引物终止密码子前引入内质网驻留蛋白信号序列(KDEL),通过PCR技术从玉米(Zea mays L.)黄化幼苗基因组中扩增目的基因的开放阅读框(ORF)。序列测序得到全长为465bp的目的片断,该片段编码154个氨基酸,其中甲硫氨酸(M)31个占20.13%,半胱氨酸(C)6个占3.90%,含硫氨基酸共占24.03%。该基因与报道的10kD玉米醇溶蛋基因具有很高的同源性。将该基因构建到植物表达载体pCAMBIA13011上,以转化紫花苜蓿提高其含硫氨基酸的水平。     

番茄RGA4蛋白与马铃薯Rpi-blb1蛋白的同源比较分析

为获得番茄抗晚疫病广谱性基因信息,采用同源电子克隆法,基于番茄蛋白序列数据库,以马铃薯晚疫病广谱抗性蛋白Rpi-blb1为种子序列,获得番茄疾病抗性蛋白RGA4,并进行基因电子定位和基因结构、模体、二级结构、基因进化及基因电子表达等分析,以证明两者的进化关系。结果表明:番茄RGA4蛋白(XP_004245923.1)序列具有NB-ARC和LRR8两个保守结构域,定位于第8条染色体SL2.40区间,相应基因位于8号染色体序列的57228847-57232935 bp区间,长度为4 089 bp,由2个外显子和1个内含子组成,编码988个氨基酸序列,该蛋白为不稳定分泌球形蛋白;番茄RGA4蛋白和马铃薯Rpi-blb1蛋白在二级结构分布、基因序列组成、基因定位等方面相似性较高,可确定两者为垂直同源关系,但在基因进化和模体组成方面存在差异,可能导致两者功能上的不同。研究结果可为番茄晚疫病广谱抗性基因克隆及其利用提供理论依据。     

人天然免疫基因TRIM5α的序列及进化分析

目的：克隆人TRIM5α基因,对其编码序列进行分析,并进行分子进化研究。方法：以HeLa细胞cDNA为模板,用RT-PCR方法克隆人TRIM5α基因,与人基因组序列对比分析其结构;用BioEdit、Genedoc和MEGA4.1软件进行蛋白序列联配和进化分析。结果：扩增了长1482bp的人TRIM5α基因片段,序列分析表明其覆盖了完整编码框,编码由493个氨基酸残基组成的人TRIM5α蛋白;人TRIM5α蛋白与黑猩猩、大猩猩、猩猩、猕猴TRIM5α蛋白的相似度分别为98.2%、96.8%、93.7%和87.6%。结论：克隆了人TRIM5α基因,为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

转录因子基因TuGTγ-3参与乌拉尔图小麦对条锈病的抗性

小麦条锈病是由条形柄锈菌小麦专化型(Puccinia striiformis West. f. sp. tritici Eriks.＆Henn., Pst)引起的一种严重的真菌病害,发掘新的抗条锈病相关基因对于小麦抗病育种和抗病机理研究都具有重要意义。Trihelix是植物特有的转录因子家族,参与调控生长发育、形态建成、胁迫应答等过程。迄今,小麦属Trihelix家族与抗条锈病相关的研究尚未见报道。本研究从乌拉尔图小麦(Triticum urartu Tum., 2n=2x=14, AA)中克隆了Trihelix家族GTγ亚家族中的一个基因,命名为TuGTγ-3。序列分析表明,TuGTγ-3基因具有完整的开放阅读框(ORF),编码序列(CDS)全长1329 bp,编码442个氨基酸,推测其编码蛋白的分子量为50.31 kDa,理论等电点为6.12。生物信息学预测TuGTγ-3蛋白有一个单分型核定位信号(GLPMQKKMRYT),没有信号肽和跨膜结构域。TuGTγ-3蛋白的保守trihelix结构域的氨基酸序列位置为Q115~R187,第四α-螺旋位置为F234~Y241,CC结构域的位置为K362~K436。二级结构分析显示,TuGTγ-3蛋白由43.89%的α-螺旋、9.51%的伸展链、9.95%的β-转角和36.65%的不规则卷曲构成。利用普通小麦的基因组数据库BLAST分析表明,TuGTγ-3被定位于5A染色体长臂上。瞬时表达实验显示,TuGTγ-3蛋白主要定位在细胞核中,但细胞质中也有少量分布。表达谱分析表明,TuGTγ-3基因在叶片中的表达量显著高于根和叶鞘,且受小麦条锈菌小种CYR32的诱导而强烈上调表达。进一步通过大麦条纹花叶病毒诱导的基因沉默(BSMV-VIGS)实验证明,转录因子TuGTγ-3正向调控了乌拉尔图小麦对条锈病的抗性。     

忽地笑酌-生育酚甲基转移酶基因LaTMT的克隆与表达分析

采用RACE技术从忽地笑也Lycoris aurea ( L'Hér.) Herb.页叶片中克隆获得γ-生育酚甲基转移酶(γ-TMT)基因,命名为LaTMT。序列分析结果显示：该基因cDNA全长1458 bp,其中开放阅读框( ORF)长1017 bp,编码338个氨基酸残基。 LaTMT基因编码蛋白质的理论相对分子质量37560,理论等电点pI 8.70,为亲水性蛋白,无跨膜结构但具有信号肽结构;并具有S-腺苷甲硫氨酸( SAM)甲基转移酶保守结构域,包含3个SAM结合位点;该蛋白的二级结构中包含44.08%的α-螺旋、32.84%的无规则卷曲、12.72%的延伸链和10.36%的β-转角。序列比对和系统进化树分析结果显示：LaTMT蛋白属于S-腺苷甲硫氨酸-依赖性γ-生育酚甲基转移酶家族,与其他植物γ-TMT蛋白的一致性为64%~75%;在 NJ系统树上, LaTMT蛋白与单子叶植物γ-TMT蛋白聚为同一大类,并与油棕( Elaeis guineensis Jacq.) EgTMT和美洲油棕也Elaeis oleifera ( Kunth) Cortés页EoTMT聚为同一类,亲缘关系最近。基因表达分析结果显示：LaTMT基因可在大肠杆菌中成功表达,且表达量随异丙基硫代半乳糖苷( IPTG)诱导时间的延长而增加;在忽地笑的根、叶片、花苞、子房、雄蕊、花瓣和鳞茎中LaTMT基因均可表达,其中在叶片中的相对表达量最高,在子房、雄蕊和鳞茎中的相对表达量相对较低,具有明显的组织特异性。研究结果表明：忽地笑LaTMT基因在进化过程中具有很高的保守性;该基因主要定位于叶绿体中,并与忽地笑对非生物逆境胁迫的抗性相关。     

猪T细胞受体γ链基因的克隆及生物信息学分析

目的:克隆猪T细胞受体γ链(pTCR-γ)基因,用以研究猪T细胞受体分子结构与功能。方法与结果:以GenBank上登载的pTCR-γ基因为参考序列,用RT-PCR法从猪外周血淋巴细胞中克隆pTCR-γ基因。序列分析表明,pTCR-γ基因开放读框为1026bp,编码341个氨基酸残基,含有由23个氨基酸残基构成的信号肽序列;与参考序列相比,在核苷酸和推导氨基酸序列上的同源性分别为95.6%和88.8%;系统进化分析发现,该基因与绵羊、恒河猴、人、马、牛的同源性相对较高,与褐鼠、家犬、家鼠、家猫的同源性次之,而与禽类、鱼类的同源性最低;生物信息学结构预测表明猪T细胞受体γ链含2个结构域,其中1个为IG_LIKE1结构域(IGv结构域),由第14～114位共101个氨基酸残基组成;另一个为IG_LIKE2结构域(IGc结构域),由第143～238位共96个氨基酸残基组成。结论:克隆并应用生物信息学技术分析了猪T细胞受体γ链基因序列及编码蛋白的结构特征,为进一步研究γ链的结构与功能奠定了基础。     

大麦醇溶蛋白研究概况

本文综合概述了近年来大麦醇溶蛋白（Hordein）的研究情况,涉及醇溶蛋白各组（A,B,C,D）多肤的含量、分子量、等电点,氨基酸组成和序列等生化特性;多肤多态性及形成机制;基因结构、定位及与其他基因（如抗白粉病基因）的连锁关系;进行多肤鉴别的一系列实验方法;蛋白质体和发育中各组醇蛋白多肤的积累和差异;高赖氨酸突变体（如RiSΦ1508, RiSΦ56)基因结构及与醇溶蛋白合成的关系等方面。