三疣梭子蟹腺苷酸转移酶(ANT)基因的克隆与分析

腺苷酸转移酶(Adenine nucleotide translocase,ANT)是线粒体内膜上负责能量分子传导的转运蛋白,在能量代谢中起着关键作用。为了研究ANT基因在甲壳动物蜕皮中的作用,采用RT-PCR和c DNA末端快速扩增技术(RACE技术)克隆得到三疣梭子蟹ANT基因的序列全长(Gen Bank登录号:KM921660),该序列全长1 414 bp,包括132 bp的5'端非编码区,352 bp的3'段非编码区,具有930 bp的完整开放阅读框(ORF),编码309个氨基酸。将该ANT基因序列推导的氨基酸序列与已公布的其他物种ANT序列进行系统进化树分析发现,三疣梭子蟹ANT基因与其他甲壳动物ANT基因聚为一支,其中与拟穴青蟹ANT一致性高达96%。通过氨基酸序列比对发现,三疣梭子蟹ANT序列具有3个保守的线粒体穿膜功能结构域,是形成能量分子传导的转运通道,催化细胞质中ADP和线粒体内ATP间进行跨膜交换。采用实时荧光定量PCR技术,分析三疣梭子蟹ANT基因的组织差异表达,结果表明ANT基因在三疣梭子蟹肌肉(Ms)中的表达量最高,在其他组织中表达量均较低,具显著差异(P0.05);在三疣梭子蟹蜕皮周期中,肌肉中ANT基因的表达量A期最高(P0.05),然后下降,至C期最低,随后又逐渐上升至D1期,在D1期出现第2个峰值后再逐渐下降。研究结果说明ANT基因与三疣梭子蟹肌肉活动密切相关,可能在蜕皮调控中发挥重要作用。     

三疣梭子蟹UHRF1基因在胚胎、幼体和性腺发育过程中的表达分析

为探讨泛素样含PHD和环指域蛋白1(UHRF1)基因在三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)发育过程中的作用, 实验采用SMART RACE方法, 克隆了三疣梭子蟹UHRF1(PtUHRF1)基因。该基因cDNA全长为2849 bp, 开放阅读框(ORF)为2298 bp, 预测其编码1个含有765个氨基酸的蛋白质。结构域分析显示, 该蛋白质包含UBL、PHD、TTD、SRA、RING finger 5个功能结构域。同源分析表明, 三疣梭子蟹PtUHRF1的氨基酸序列与其他物种有较高的同源性。qRT-PCR结果显示, PtUHRF1基因在三疣梭子蟹所有组织中均有表达, 但在精巢中表达量显著高于其他组织。该基因在胚胎和幼体发育不同时期表达差异显著, 在受精卵中的表达量最高, 并显著高于胚胎发育其他时期, 是多细胞时期表达量的2.5倍。PtUHRF1基因在性腺发育不同时期表达存在显著差异, 在卵巢II期表达量达到峰值, 之后逐渐下降; 在精巢Ⅰ期的表达量最高, 随着精巢发育逐渐下降。实验结果表明, PtUHRF1参与了三疣梭子蟹胚胎、幼体和性腺发育调控, 为进一步深入研究该基因在三疣梭子蟹及甲壳动物生长发育中的作用提供参考。     

三疣梭子蟹Spook基因克隆及其表达分析

甲壳动物蜕皮激素(Ecdysteroids)主要在Y器官(YO)中合成与分泌,参与调控蜕皮、繁殖等多项生理活动。Spook基因编码的细胞色素P450(CYP)307a1是蜕皮激素合成通路早期的关键酶。为了研究其在三疣梭子蟹蜕皮过程中的调控作用,采用反转录PCR(RT-PCR)和c DNA末端快速扩增(RACE)技术,克隆得到了三疣梭子蟹Spook基因的全长c DNA序列(GenBank登录号:KM030021)。该序列全长为2 200 bp,包含一个长度为1 563 bp的开放阅读框,编码520个氨基酸;比对分析显示该氨基酸序列含helix-C、helix-K、helix-I、PERF、heme-binding 5个P450特征保守区域;系统进化树分析发现推导的三疣梭子蟹Spook蛋白与其他物种Spook聚为一支,而其他Halloween基因则分别聚为一支,表明推导的氨基酸确实是三疣梭子蟹Spook的蛋白序列。采用实时荧光定量PCR(qPCR)技术分析了其在不同组织中的表达情况,结果显示Spook基因主要在三疣梭子蟹的YO中表达。在三疣梭子蟹的蜕皮周期中,Spook基因的表达水平自蜕皮后期(A、B期)逐渐上升,并在蜕皮间期(C期)上升至最大,随后在蜕皮前期逐渐下降至D_3、D_4亚期最低。研究结果表明Spook基因可能参与调控三疣梭子蟹的蜕皮过程。     

三疣梭子蟹HMGBa基因克隆及其应答不同病原入侵的表达特征

为研究三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)高迁移率族蛋白B (High-mobility group box protein, HMGB)在其先天免疫中发挥的功能, 利用RACE技术首次克隆得到了三疣梭子蟹HMGBa基因, 命名为PtHMGBa。其cDNA序列全长1030 bp, 其中5′端非编码区(UTR)为94 bp, 3′端非编码区(UTR)为255 bp, 开放阅读框(ORF)为681 bp, 编码一个含有227个氨基酸, 分子量25.82 kD, 理论等电点为5.94的蛋白质。PtHMGBa蛋白包含2个HMG盒结构域和一个酸性尾部结构域。分析表明, 三疣梭子蟹HMGBa氨基酸序列与凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei) HMGBa相似度最高。实时荧光定量PCR结果显示, PtHMGBa基因在血细胞和肝胰腺的表达量最高, 在眼柄中表达量最低。在副溶血弧菌和WSSV感染过程中, PtHMGBa基因在肝胰腺和血细胞中均出现了表达上调。其中, 经副溶血弧菌感染后, 该基因在上述2种组织中分别于48h和6h达到表达量的峰值; 经WSSV感染后, 该基因在2种组织中均在12h达到表达量的峰值。结果表明PtHMGBa基因参与了三疣梭子蟹抵御外来病原的免疫响应, 研究为深入开展三疣梭子蟹和其他甲壳动物的免疫调控机理提供了科学依据。     

三疣梭子蟹Δ6脂肪酸去饱和酶基因全长cDNA克隆与组织表达

旨在探讨三疣梭子蟹高度不饱和脂肪酸自身合成能力,探究三疣梭子蟹HUFA生物合成途径。采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆得到三疣梭子蟹△6去饱和酶cDNA全长序列,并利用荧光定量PCR技术进行肝胰腺、肠道、鳃等8种组织的表达分析。通过分析序列表明,基因序列全长2875bp,其中5'非编码区长465bp,3'非编码区长1078bp,开放阅读框(ORF)长1332bp,编码443个氨基酸;并且编码的蛋白序列具有典型的去饱和酶特性:3个组氨酸保守区,一个N端细胞色素b5结构域以及一个血红素结合的HPGG结构域。荧光定量PCR结果显示,Δ6脂肪酸去饱和酶基因在三疣梭子蟹多个组织中均有表达,在肝胰腺中表达量最高,其次是肠道和肌肉,心脏中表达最少。结果表明三疣梭子蟹具有△6去饱和酶。     

三疣梭子蟹Na+/H+-exchanger基因克隆鉴定及在盐度胁迫下的表达分析

为研究Na+/H+-exchanger基因在三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）盐度胁迫过程中的功能作用,克隆了三疣梭子蟹Na+/H+-exchanger基因并进行表达分析。结果显示,Na+/H+-exchanger基因（GenBank:KU519329）全长4233 bp,5和3非编码区（UTR）长分别为519和753 bp,开放阅读框（ORF）长2961 bp。编码986个氨基酸,预测蛋白质分子量和等电点分别为110.8 kD和7.42,具有信号肽和典型的Na+/H+-exchanger蛋白结构域,含12个跨膜螺旋;三疣梭子蟹Na+/H+-exchanger基因与普通滨蟹（Carcinus maenas）同源性最高,达到87.2%,系统进化分析也显示该序列与普通滨蟹聚为一支;表达分析显示,三疣梭子蟹Na+/H+-exchanger基因在鳃中表达量最高;在低盐（盐度5、10和20）胁迫过程中,Na+/H+-exchanger基因在0-12h上调表达明显,在24-168h间表达量呈下降趋势;在高盐（盐度50）胁迫初期（0-12h）,该基因表达量相对稳定,之后（24-168h）显著下调表达。研究表明低盐显著诱导Na+/H+-exchanger基因的高表达,推测三疣梭子蟹Na+/H+-exchanger基因在低盐环境下发挥重要的渗透调节功能。     

三疣梭子蟹NF-κB家族基因Relish和Dorsal的克隆及表达特征

为研究Relish和Dorsal在三疣梭子蟹免疫过程中所起到的作用, 研究利用RACE技术克隆获得三疣梭子蟹Relish(Pt-Rel)、Dorsal基因(Pt-Dor) cDNA全长, 并通过实时荧光定量PCR技术分析了Pt-Rel和Pt-Dor基因在健康蟹不同组织及其原代培养的血淋巴细胞在感染不同微生物后的表达情况。结果显示, Pt-Rel cDNA长3254 bp, ORF长2949 bp, 编码983个氨基酸, Pt-Dor cDNA长2348 bp, ORF长1911 bp, 编码637个氨基酸; 蛋白结构预测分析发现Pt-Rel和Pt-Dor均包含RHD (Rel homology domain)及IPT (Immunoglobulin-like fold, Plexins, TranscriPtion factors)Rel/NF-κB家族蛋白经典结构域。Pt-Rel和Pt-Dor与其他节肢动物Relish、Dorsal氨基酸序列具有很高的相似性; 在系统进化分析中Pt-Rel和Pt-Dor分别与中华绒螯蟹等甲壳动物的Relish、Dorsal聚在一支, 而昆虫类聚在另一支。Pt-Rel和Pt-Dor在检测的6种组织中均有表达, 且2个基因均在血淋巴细胞中表达量最高。蟹血淋巴细胞体外感染实验结果表明, 不同病原微生物对2个基因表达的影响非常相似, 假丝酵母在2h明显诱导了Pt-Rel和Pt-Dor基因的表达, 而金黄色葡萄球菌及溶藻弧菌在感染4h后使Pt-Rel和Pt-Dor基因的表达显著上调。上述研究结果表明Pt-Rel和Pt-Dor基因很有可能参与了三疣梭子蟹的抗感染免疫过程。     

大螟水通道蛋白SiAQP基因的克隆与表达分析

【目的】水通道蛋白(AQP)是一种重要的膜结合蛋白,它可以在植物、细菌和动物的细胞膜上形成通道以促进水分和甘油等小分子的运输。本文研究了大螟水通道蛋白基因(SiAQP)的序列特征以及该基因的表达模式和功能。【方法】运用RT-PCR和RACE技术克隆获取大螟水通道蛋白基因(SiAQP);运用生物信息学软件分析该基因特征;用实时荧光定量PCR技术(qRTPCR)分析该基因在大螟的不同器官组织、不同发育阶段以及在不同温度和湿度条件下的表达模式。【结果】SiAQP的开放阅读框(ORF)为831 bp,编码276个氨基酸,分子量为29.27 ku,等电点8.16。保守结构域分析发现其含有两个高度保守的水通道蛋白特征序列NPA(Asn-Pro-Ala)基序和6个跨膜结构域。qPCR结果显示,不同器官组织中,后肠的SiAQP表达量显著高于其它组织;不同发育阶段中成虫期的SiAQP表达量最高,卵和蛹期表达量相对较低;不同温度处理下SiAQP的表达量相对稳定,与27℃对比高温与低温处理都没有显著变化;随着湿度的上升大螟幼虫和雌雄蛹的SiAQP表达量都呈现出显著的先上升后下降趋势,表明高湿度和低湿度环境都会抑制SiAQP的表达。【结论】SiAQP在大螟不同的器官组织表达具有明显的差异,温度对SiAQP的表达影响较小,而湿度的影响较大,成虫能较好的适应不同湿度环境。     

三疣梭子蟹PtToll-1受体的原核表达及组织、细胞分布研究

为深入研究三疣梭子蟹Toll受体的功能, 在前期工作的基础上构建了PtToll-1胞外结构域原核表达载体, 并成功获得其重组蛋白。将获得的重组蛋白免疫小鼠获得抗此重组蛋白免疫抗血清用于后续研究。SDS-PAGE结果表明, 体外诱导表达重组蛋白rPtToll-1以包涵体的形式出现在大肠杆菌裂解液的沉淀中, 分子量大小约为87.18 kD; Western-Blot分析表明, 小鼠抗血清能与rPtToll-1特异性结合。利用免疫荧光及细胞免疫化学方法对三疣梭子蟹PtToll-1在消化道、肝胰腺、鳃、心脏和肌肉等组织及血淋巴细胞中的分布进行研究。此外成功构建PtToll-1完整蛋白的真核表达载体pEGFP-N2-PtToll-1, 并转染HEK293T细胞研究其在哺乳动物细胞HEK293中的表达。组织免疫荧光结果显示, PtToll-1在三疣梭子蟹消化道、肝胰腺、鳃、心脏及肌肉等组织中均有分布, 但在鳃及消化道的组织结构中表达较强; 细胞免疫荧光及免疫化学结果均表明PtToll-1主要分布在血淋巴的细胞膜上; 激光共聚焦显微技术观察发现, pEGFP-PtToll-1融合蛋白也主要在HEK-293T细胞膜上表达。研究结果将为三疣梭子蟹Toll受体蛋白的免疫学功能的研究奠定基础。     

miR-139555及其靶基因PtNBC在三疣梭子蟹适应盐度胁迫中的表达调控

为研究miR-139555及其潜在靶基因PtNBC(碳酸氢钠协同转运基因)在三疣梭子蟹(Portunus tritu-berculatus)适应盐度胁迫中的表达调控分析,利用RACE技术克隆了PtNBC基因,该基因全长5308 bp,开放阅读框(ORF)3570 bp,共编码1189个氨基酸.利用RT-PCR技术分析m...     

饲料中添加雨生红球藻粉对三疣梭子蟹雌体卵巢发育、色泽、抗氧化能力和生化组成的影响

研究采用雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)藻粉作为天然虾青素源, 配制4种不同虾青素含量(含量分别为0、26.60、41.62和81.37 mg/kg)的饲料(记为饲料1#—4#), 对三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)雌体进行为期45d的育肥实验, 研究其对雌蟹卵巢发育、色泽、抗氧化能力、免疫性能和生化组成的影响。结果表明: (1)育肥饲料中虾青素含量对雌蟹性腺指数(GSI)和肝胰腺指数(HSI)均无显著影响。(2)肝胰腺、卵巢和头胸甲中的总类胡萝卜素含量、红度(a*)值和黄度(b*)值均随饲料虾青素含量的升高而升高, 而3种组织的亮度(L*)值呈显著下降趋势(P<0.05)。(3)对抗氧化指标而言, 虾青素添加组(饲料2#—4#)血淋巴超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活力均显著低于无虾青素组(饲料1#); 血淋巴中的总抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)及肝胰腺中的SOD和T-AOC活力均随饲料中虾青素水平升高而上升, 而血淋巴和肝胰腺中的丙二醛(MDA)含量呈下降趋势。(4)对免疫指标而言, 血淋巴和肝胰腺中的酸性磷酸酶(ACP)活力均在饲料4#组最高, 而饲料1#组血淋巴中的血蓝蛋白(Hc)含量显著高于其他组(P<0.05)。(5)对生化组成而言, 肌肉和肝胰腺中的总脂、总碳水化合物及卵巢中总脂含量均随饲料中虾青素含量的升高呈上升趋势, 饲料2#组卵巢中的总碳水化合物含量最高(P<0.05)。综上所述, 三疣梭子蟹雌体育肥饲料中添加虾青素对其卵巢发育无显著影响, 但可改善色泽和提高其抗氧化能力及可食组织中的总脂和碳水化合物含量, 三疣梭子蟹雌体育肥饲料中虾青素适宜含量为50 mg/kg饲料左右。     

三疣梭子蟹卵巢发育过程中主要类胡萝卜素组成变化及其与抗氧化性能的关系

实验研究了三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)卵巢发育过程中(Ⅰ—V期)组织色泽、类胡萝卜素组成与含量、抗氧化和非特异性免疫指标的变化规律,进一步探讨了肝胰腺中类胡萝卜素含量变化与抗氧化指标的关系。结果表明:(1)卵巢发育期间,卵巢指数(GSI)显著增加(P<0.05),肝胰腺指数(HSI)整体呈先升后降的趋势;卵巢的红度(a*)值和黄度(b*)值、肝胰腺的亮度(L*)值和b*值均呈显著上升趋势,但卵巢中L*值呈下降趋势。(2)在卵巢发育过程中,卵巢中的总类胡萝卜素、虾青素、叶黄素和β-胡萝卜素含量均为先升后降的趋势,虾青素含量在Ⅳ期最高;肝胰腺中的虾青素含量呈上升趋势,而β-胡萝卜素含量为显著下降趋势;内表皮中的总类胡萝卜素、虾青素、叶黄素、海胆烯酮和β-胡萝卜素含量均呈现下降趋势;就不同组织中类胡萝卜素含量而言,内表皮中虾青素含量最高。卵巢和肝胰腺的L*值与总类胡萝卜素含量呈显著负相关,卵巢的a*值和b*值均与总类胡萝卜素、虾青素、叶黄素、海胆烯酮和β-胡萝卜素含量呈显著正相关。肝胰腺的a*值与各类胡萝卜素含量无显著相关性, b*值仅与虾青素含量呈显...     

中华鳖STING基因的克隆及功能分析

为了研究干扰素基因刺激因子STING在中华鳖(Pelodiscus sinensis)先天免疫中的作用, 克隆了中华鳖STING基因(PsSTING)的cDNA序列, 其全长为2145 bp, 包含1152 bp的开放阅读框, 编码383个氨基酸。氨基酸序列比对发现, PsSTING蛋白N端含有4个跨膜区和2个RXR内质网滞留基序, C端有1个解旋酶结构域。qRT-PCR结果显示, PsSTING在中华鳖心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、小肠、胃、皮肤、肌肉和血细胞等组织中均能表达, 其中在脾脏中的表达量最高, 其次是肝脏、小肠和肺, 而在血细胞中的表达量最低; 用嗜水气单胞菌、LPS和poly(I:C)刺激后, PsSTING基因呈现出先上调后下调的趋势, 在刺激12h 时显著高于对照组(P＜0.05), 24h达到最高值, 在48h后逐渐恢复到初始水平, 其蛋白表达量在脾脏和小肠中明显增加。体内RNA干扰后, 小肠中PsSTING的表达量显著下调(P＜0.05), IFN信号通路中TBK1、IRF3、IRF7、STAT6和IFN-β等基因表达水平显著下调(P＜0.05)。在HEK293T细胞中过表达PsSTING基因, 能够显著激活pIFN-β-luc的启动子。研究结果表明PsSTING基因参与调控了中华鳖的先天免疫反应。     

团头鲂foxO基因家族的序列特征及表达分析

为了研究鱼类foxO(Forkhead box O)基因的功能, 基于组学测序及PCR扩增获得了团头鲂(Megalobrama amblycephala)foxO家族7个基因, foxO1a/b、foxO3a/b、foxO4和foxO6a/b的编码序列, 分别为1965、1892、1929、1959、1878、1803和2157 bp。SMART结构域分析显示该家族基因属于典型的FoxO家族蛋白, 具有保守的Forkhead、FOXO_KIX_bdg和 FOXO-TAD结构域。系统进化分析显示, 团头鲂FoxO与其他鲤科鱼类的同源基因具有较高的相似性。基于qPCR分析显示7个基因在所检测的9个组织中均有表达, 但在各组织间存在表达差异, 其中foxO4在血液中表达量最高, foxO6a在肝脏中表达量最高, 而foxO6b在脑中表达量最高。在胚胎早期发育过程中, foxO1a和foxO1b、foxO3a和foxO3b、foxO6a和foxO6b的表达模式类似; 而foxO4在发育早期, 除了体节出现期、眼色素沉淀晚期、体节生成期和受精后10d表达量高外, 其他时期表达量都比较低。经急性低氧处理后, 团头鲂foxO家族基因的表达水平在所检测的大部分组织中呈现显著上调趋势, 尤其是在肌肉组织中。基于JASPAR分析显示foxO家族基因都包含有Hif-1α结合位点, 利用双荧光素酶报告系统对foxO1b启动子进行了验证, 发现该基因受到Hif-1α调控。这些结果说明foxO基因可能通过Hif-1α介导的途径在团头鲂低氧应激中发挥重要作用。