沉默Dnmt1基因表达诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化

骨髓间充质干细胞(MSCs)具有向心肌样细胞分化的潜能.本室前期研究发现,MSCs在体外经DNA甲基转移酶(Dnmt)抑制剂5-氮胞苷诱导可分化为心肌样细胞.本研究证明,沉默DNA甲基化转移酶1(Dnmt1)基因表达,可诱导大鼠MSCs向心肌样细胞分化.本文采用表达Dnmt1 siRNA慢病毒感染MSCs,沉默Dnmt1表达.DNA甲基化分析显示,随着沉默Dnmt1时间延长(7-28 d),Gata-4基因上游DNA调控序列的Cp G甲基化水平明显降低,而Gata-4 mRNA的转录水平明显上调,说明敲减Dnmt1表达导致Gata-4基因激活.蛋白质印迹和/或免疫细胞化学揭示,与对照组比较,心肌相关基因MHC和c Tn T表达上调,而骨髓干细胞标志物CD90和CD29随转染时间延长表达下调.同时,实时定量PCR显示,心肌早期发育调控基因Nkx2.5 mRNA水平与Gata-4 mRNA相同,随表达Dnmt1 siRNA的慢病毒感染而上调.上述结果提示,敲减Dnmt1可降低心肌发育调控基因Gata-4启动子Cp G岛的甲基化水平,上调Gata-4基因的表达,诱导骨髓间充质干细胞向心肌样分化.     

茶树种子发育过程的转录组分析

该研究以‘铁观音’茶树品种的种子为试验材料,采用转录组测序技术分析种子发育的3个时期(幼果期、膨大期、成熟期)的表达差异,探究茶树种子油脂代谢的分子机制。结果表明:(1)经转录组测序、组装后共获得30 940 581个clean reads,经数据合并拼接最终得到36 951条非冗余Unigene序列,其中28 476个Unigene可得到功能注释;在转录本中能够被注释到GO分类的Unigene有11 201条(30.3%),KEGG分析发现共有17 172个基因参与了127个代谢通路。(2)经KEGG通路筛选出14条与脂肪酸代谢相关的通路,且随着茶籽的发育,大部分脂肪酸调控途径相关基因呈下调趋势,其中上调基因数最多的有α-亚麻酸代谢途径和脂肪酸降解途径(有17个基因表达量上调),下调基因数最多的是甘油磷脂代谢途径(有58个基因表达量下调);在茶籽发育幼果期α-亚麻酸代谢途径中表达量上调的基因数超过表达量下调的基因数。(3)研究发现茶籽脂肪酸合成相关的基因涉及14个脂类调控途径,共409条差异基因;随着茶树种子发育到成熟期,上调的差异表达基因数量在减少,下调的差异表达基因数量增加,其中α-亚麻酸途径中的基因PLA2G16、DAD1、pldA、FabF、FabI表达量上调显著,随后表达量下调。(4)qRT-PCR检测结果表明,7个茶树FAD和1个ACP差异表达基因的水平与转录组测序结果基本一致;随着茶籽的发育,基因CsFAD7和Δ6-CsFAD从幼果期、果实膨大期至果实成熟期都为差异下调表达,CsFAD2、CsFAD6和Δ7-CsFAD为差异上调表达,CsFAD8、Δ8-CsFAD和CsACP在幼果期至果实膨大期差异上调表达,在果实膨大期至果实成熟期差异下调表达。     

沉默Dnmt1基因表达诱导大白鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化

骨髓间充质干细胞(MSCs)具有向心肌样细胞分化的潜能.本室前期研究发现,MSCs在体外经DNA甲基转移酶(Dnmt)抑制剂5-氮胞苷诱导可分化为心肌样细胞.本研究证明,沉默DNA甲基化转移酶1（Dnmt1）基因表达,可诱导大鼠MSCs向心肌样细胞分化.本文采用表达Dnmt1 siRNA 慢病毒感染MSCs,沉默Dnmt1表达.DNA甲基化分析显示,随着沉默Dnmt1时间延长（7-28 d）,Gata-4基因上游DNA调控序列的CpG甲基化水平明显降低,而Gata-4 mRNA的转录水平明显上调,说明敲减Dnmt1表达导致Gata-4基因激活.蛋白质印迹和/或免疫细胞化学揭示,与对照组比较,心肌相关基因MHC 和cTnT表达上调, 而骨髓干细胞标志物CD90和CD29随转染时间延长表达下调.同时,实时定量PCR显示,心肌早期发育调控基因Nkx2.5 mRNA水平与Gata-4 mRNA相同,随表达Dnmt1 siRNA的慢病毒感染而上调.上述结果提示,敲减Dnmt1可降低心肌发育调控基因Gata-4启动子CpG岛的甲基化水平,上调Gata-4基因的表达,诱导骨髓间充质干细胞向心肌样分化.     

C/EBP β对APP基因的表达调控作用的研究

该研究成功地构建了C/EBP β过表达慢病毒载体,在体外人胚肾细胞(HEK293FT)进行病毒包装并感染小鼠海马神经元细胞(HT22)。通过荧光素酶报告基因实验(luciferase assay)检测C/EBPβ对淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)启动子活性的影响;通过实时荧光定量PCR(Q-PCR)来检测C/EBPβ对APP和Sp1在转录水平上的表达;通过蛋白免疫印迹分析(Western blot assay)检测C/EBPβ对APP和Sp1蛋白表达的作用。萤火虫荧光素酶分析结果显示,C/EBPβ对APP启动子的表达有正调控作用;Western blot和Q-PCR分析的结果表明,C/EBPβ对APP和Sp1基因的表达有正调控作用。C/EBPβ对APP基因表达的调控作用的机制可能在于C/EBPβ上调了内源性转录因子Sp1的基因表达,而Sp1基因表达的增强直接导致了APP基因表达的上调。     

实时荧光定量PCR检测RSV胁迫下抗病、感病水稻中与脱落酸相关基因的差异表达

采用实时荧光定量PCR方法测定了水稻条纹病毒(Rice stripe virus,RSV)胁迫下抗性不同品种水稻中与脱落酸相关基因的mRNA转录水平变化.结果表明:感病品种武育梗3号中WGPI、OsGASA2、Polcalcin、OsCBIA、Myb和OsCIPK15基因表达水平均上调,上调比率分别为4.96、5.17、2.01、5.17、12.04和7.84.而抗病品系KT 95-418中,OsGASA2和OsCIPK15基因表达水平下调,下调比率分别为1/5.40和1/2.08;Polcalcin和Myb基因表达水平上调,上调比率分别为4.20和3.86;WGPI和OsCBIA表达量变化不明显.这些结果表明,RSV胁迫能诱导脱落酸相关基因表达量的变化,并且在抗病、感病水稻品种中的表达特征不同,从而提示植物激素脱落酸可能调控了RSV胁迫条件下相关基因的表达.     

基于转录组的肝豆状核变性调控网络的构建和分析

本研究旨在利用生物信息学方法构建经铜诱导的ATP7B基因敲除HepG2细胞系的转录调控网络。探讨关键转录因子在肝豆状核变性发生、发展中的潜在作用机制。收集公共基因表达数据库(gene expression omnibus, GEO)中包含野生型、ATP7B基因敲除型、铜诱导的野生型和铜诱导的ATP7B基因敲除型HepG2细胞系数据。筛选由铜诱导产生的差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs)后进行基因本体论(gene ontology,GO)、京都基因和基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)富集分析。基于蛋白相互作用网络,识别疾病关键基因和功能模块,并对关键功能模块中的基因进行富集分析。最后,构建转录调控网络,筛选核心转录因子。共筛选出1 034个差异表达基因,其中上调525个,下调509个。上、下调关键功能模块分别包括了3785个和3931个基因。关键功能模块中的基因主要定位于细胞-基质连接、染色体、剪接复合体、核糖体等区域,共同参与了mRNA加工、组蛋白修饰、RNA剪切...     

柯萨奇病毒A组10型感染RD细胞的转录组学分析

探讨柯萨奇病毒A组10型（coxsackievirus A10, CV-A10）感染人横纹肌肉瘤（rhabdomyosarcoma,RD）细胞的基因表达谱变化,为深入理解CV-A10致病机制提供重要基础数据。本研究将CV-A10以感染复数（MOI）为0.1的剂量感染RD细胞12 h后提取总RNA,通过RNA-Seq技术获取RD细胞中的全部转录本信息,基于生物信息学的方法对差异表达基因进行GO(gene ontology, GO)和KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)分析。结果显示,共筛选到2 610个差异表达基因,其中表达上调的基因有1 582个,表达下调的基因有1 028个。随机选取8个差异表达基因,经RT-qPCR验证后发现,其变化趋势与转录组数据一致。GO和KEGG富集分析结果显示,差异表达基因主要聚焦于细胞内信号转导、mRNA加工、抗病毒免疫反应等过程。结果表明,CV-A10感染可能会引起RD细胞发生自噬。     

小鼠脑微血管内皮细胞与新生隐球菌GXM作用后基因表达谱分析

目的探索新生隐球菌GXM能否影响脑微血管内皮细胞基因的表达,为进一步研究隐球菌嗜中枢性的分子机制提供线索。方法使用Roche Nimble Gen 12×135K小鼠基因表达谱芯片,筛选小鼠脑微血管内皮细胞系b End.3与不同浓度新生隐球菌GXM作用后差异表达的基因;结合基因本体论(Gene Ontology),使用top GO进行差异基因GO分析,结合GO语义挖掘与隐球菌侵袭中枢神经系统能力相关的差异表达基因的信息;采用荧光实时定量PCR对重要基因PIK3C2G和ADAMDEC1的表达水平变化加以验证。结果 b End.3细胞与新生隐球菌GXM作用前后基因表达对比发现,实验组GXM(90μg/m)组总共有402个基因表达上调,296个基因表达下调,GXM(180μg/m)组总共有421个基因表达上调,564个基因表达下调,细胞膜、细胞骨架、磷酸肌醇-3-激酶活化、1-磷酸肌醇-3-激酶活化、细胞紧密连接等生物过程差异表达基因较为富集;对PIK3C2G基因和ADAMDEC1基因表达水平变化进行荧光定量PCR验证,结果与芯片结果一致,基因表达水平不同程度上升,且与GXM浓度正相关。结论新生隐球菌GXM能够影响脑微血管内皮细胞基因表达,PIK3C2G基因、ADAMDEC1基因表达上调可能和隐球菌穿越血脑屏障有关。     

半滑舌鳎外周血T淋巴细胞的分离、鉴定及TCRβ基因免疫应答分析

为开展半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)免疫学研究提供细胞平台, 利用密度梯度离心法分离半滑舌鳎外周血淋巴细胞, 采用短期细胞培养法分离悬浮淋巴细胞, 悬浮淋巴细胞在含有0.3 μg/mL的PHA的DMEM完全培养基, 于24℃条件下可连续培养3—4d左右, 采用自制的尼龙毛柱可将悬浮淋巴细胞中的非黏附淋巴细胞和黏附淋巴细胞成功分离; 利用流式细胞仪结合特异抗体检测对非黏附淋巴细胞和黏附淋巴细胞进行鉴定, 结果表明, 非黏附细胞与鼠抗人FTIC-CD3单克隆抗体特异结合, 为T样淋巴细胞; 黏附细胞和鼠抗人FTIC-CD19单抗特异结合, 为B样淋巴细胞。T细胞表面抗原受体TCRβ基因可特异性的在非黏膜细胞中表达, 而在黏附细胞中不表达, 证明分离获得的非黏膜细胞为T淋巴细胞, 采用qRT-PCR (Quantitative Real-Time PCR)方法检测TCRβ基因表达, 结果表明, TCRβ基因在半滑舌鳎肝、脾、头肾、后肾、小肠、胃、血液、鳃、皮肤、肌肉、心脏、脑、卵巢组织中均有表达, 其中在肠、胃、脾、头肾中表达量较高; 鳗弧菌感染后TCRβ基因在肝、脾、鳃中呈现明显的上调表达, 且表达峰值出现在感染后72—96h, 表明TCRβ基因在获得性免疫应答中起重要作用。     

轮状病毒感染患者外周血单个核细胞的转录组学分析

轮状病毒(Rotavirus,RV)是引起急性肠胃炎的主要病原体,分析RV感染患者的人外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中差异表达基因(Differentially expressed genes,DEGs)有利于探讨人PBMC在清除RV中的作用。为此,本研究采集2019年2月-2019年6月长春儿童医院中RV感染患者和健康儿童血液,分离PBMC,通过转录组测序(RNA sequencing,RNA-seq)技术比较RV感染患者与健康儿童之间的RNA表达图谱,借助基因本体论(Gene Ontology,GO)数据库功能富集分析、京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)、Reactome通路富集分析DEGs,使用实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,qPCR)技术进行验证。结果显示,与健康对照组相比,RV感染轻症患者PBMC中有1619个DEGs;重症患者PBMC中有2816个DEGs,主要与干扰素(Interferon,IFN)反应、中性粒细胞、溶酶体、核小体、染色质等相关。qPCR验证轻症患者干扰素刺激基因(IFN-stimulated genes,ISGs)15表达上调,白介素(Interleukin,IL)1β表达下调;重症患者IL15、ISG15表达上调,IL1β表达下调,与转录组结果相一致。本研究提示,RV感染可能激活人I型和II型IFNs反应抵御病毒感染,但也会抑制溶酶体相关基因,对细胞自噬过程产生影响。     

大黄鱼ATG10基因的分子特征及其在抗病毒免疫中的功能

为了研究自噬相关基因ATG10(Autophagy related gene 10)在鱼类免疫应答中的功能, 研究克隆了大黄鱼(Larimichthys crocea)ATG10基因(LcATG10)的cDNA序列, 其开放阅读框全长747个核苷酸, 编码248个氨基酸的蛋白, 包含1个Autophagy_act_C结构域。系统进化分析显示, LcATG10和其他硬骨鱼类ATG10聚成一支, 与金头鲷和石斑鱼ATG10亲缘关系最近。LcATG10在所检测的正常大黄鱼各组织中都有表达。在病毒类似物poly (I:C)刺激后, 大黄鱼脾脏和头肾组织中LcATG10的表达水平显著上调, 分别在12h和6h达到峰值(9.4和5.9倍)。LcATG10在大黄鱼头肾细胞系(LYCK)、原代巨噬细胞、淋巴细胞和粒细胞中也均有表达, 在原代粒细胞中的表达量相对较高; 在poly (I:C)刺激后, 大黄鱼原代头肾粒细胞和LYCK细胞中LcATG10的表达水平显著上调。过表达LcATG10的鲤上皮瘤(Epithelioma papulosum cyprinid, EPC)细胞受鲤春病毒血症病毒(Spring viremia of carp virus, SVCV)感染48h后, 细胞病变效应(Cytopathic effects, CPEs)明显低于对照组; 细胞培养上清中SVCV病毒滴度为103.55 TCID₅₀/mL, 显著少于对照组; SVCV标志基因SVCV- G、SVCV-M和SVCV- P的表达水平也显著低于对照组, 分别是对照组的0.022、0.015和0.022倍。这些研究结果表明LcATG10在大黄鱼抗病毒免疫应答中发挥作用, 为深入研究自噬在大黄鱼抗病毒免疫中的分子机制奠定了基础。     

敲除trim47基因斑马鱼脑和脾的比较转录组学分析

用CRISPR/Cas9技术敲除斑马鱼(Danio Rerio)的trim47, 收集TRIM47–/–(trim47基因敲除)和WT(野生型)斑马鱼的大脑和脾脏进行RNA-seq分析, 以鉴定差异表达基因(DEGs)。总共确定了271个DEGs, 经过简要分析, 将这些DEGs注释为KEGG途径和GO富集分析, 与WT组相比, TRIM47-/-组的脑中DEGs集中在细胞黏附和谷氨酸能突触信号传导途径中。在脾脏中, 与野生型组相比, TRIM47-/-组的DEGs在补体和凝血级联信号通路中发生了变化。使用qRT-PCR验证了脑和脾中与补体途径相关的基因, 与转录组数据一致。这些结果表明, Trim47在脾脏和大脑中起着重要的生物学作用, 尤其是通过补体途径参与先天免疫功能。体内感染实验表明, trim47基因敲除可提高斑马鱼中鲤春病毒血症病毒(SVCV)的感染率。总之, 这些发现为TRIM成员在先天免疫中的功能提供了新线索。     

大黄鱼TRIM25基因克隆和表达分析

三重基序蛋白25 (Tripartite motif-containing protein 25, TRIM25)属于E3泛素连接酶家族, 在先天免疫反应中发挥重要作用。为研究TRIM25基因在大黄鱼(Larimichthys crocea)先天抗病毒免疫反应中的作用, 研究鉴定并克隆大黄鱼TRIM25基因(命名为LcTRIM25)。LcTRIM25基因编码序列2097 bp (GenBank登录号: MK327541), 编码698个氨基酸。蛋白结构域预测发现LcTRIM25包括保守的RING结构域、B-box2结构域、Coiled-coil结构域和可变的C末端PRY/SPRY结构域。多序列比对以及系统进化树分析表明LcTRIM25基因与斜带石斑鱼同源性高, 与哺乳动物、爬行动物、两栖动物和鸟类同源性相对低, 这说明不同物种受到来自环境不同的选择压力, 导致进化程度不同。应用实时荧光定量PCR方法分析大黄鱼TRIM25基因的表达水平。结果分析发现LcTRIM25基因在健康大黄鱼的9个组织中均有广泛表达, 且在肝脏中表达量最高, 在心脏中表达量最低。在poly(I:C)刺激后, 在外周血、头肾、脾脏和肝脏中LcTRIM25基因表达量迅速且明显上调, 均出现上升达到峰值后下降的趋势。LcTRIM25基因表达量在头肾和脾脏中6h达到最高表达量, 在肝脏中12h达到峰值, 外周血中在24h达到最高表达量。上述结果表明, 不同组织中LcTRIM25基因表达模式具有差异性。研究结果推测大黄鱼TRIM25基因参与抗病毒免疫反应且发挥十分关键的作用, 为进一步了解大黄鱼抗病毒免疫机制提供理论基础。     

冰菜盐胁迫下的转录组分析

为了解冰菜(Mesembryanthemum crystallinum)叶片抗盐相关基因组学,利用Illumina Hi-seq TM2500高通量测序技术研究冰菜叶片在400 mmol L~(–1) NaCl胁迫下转录组基因的差异表达。结果表明,从400 mmol L~(–1) NaCl胁迫和对照的冰菜叶片中共获得13.01 Gb Clean data,Q30碱基均大于90.08%。共获得123个差异表达基因(DEGs),包括73个上调基因,50个下调基因,其中功能注释的基因有96个。根据Unigene库序列进行GO、COG和KEGG注释,筛选出8个与抗盐性相关差异表达基因,植物激素代谢相关基因,脱落酸8'-羟基化酶、吲哚-3-乙酰酸酰胺合成酶和茉莉酮酸酯ZIM结构域蛋白基因均下调表达,生长素响应蛋白、细胞分裂素合酶基因则上调表达,糖代谢相关基因棉子糖合成酶基因上调表达,质膜H+-ATPase基因上调表达,脱水蛋白基因下调表达。这为冰菜耐盐基因组学和分子生物学的研究奠定基础。     

Cutting edge: adaptive versus innate receptor signals selectively control the pool sizes of murine IFN-γ- or IL-17-producing γδ T cells upon infection

γδ T lymphocytes are commonly viewed as embracing properties of both adaptive and innate immunity. Contributing to this is their responsiveness to pathogen products, either with or without the involvement of the TCR and its coreceptors. This study clarifies this paradoxical behavior by showing that these two modes of responsiveness are the properties of two discrete sets of murine lymphoid γδ T cells. Thus, MyD88 deficiency severely impaired the response to malaria infection of CD27((-)), IL-17A-producing γδ T cells, but not of IFN-γ-producing γδ cells. Instead, the latter compartment was severely contracted by ablating CD27, which synergizes with TCRγδ in the induction of antiapoptotic mediators and cell cycle-promoting genes in CD27((+)), IFN-γ-secreting γδ T cells. Hence, innate versus adaptive receptors differentially control the peripheral pool sizes of discrete proinflammatory γδ T cell subsets during immune responses to infection.     

基于高通量转录组测序技术的无精子症患者睾丸组织比较转录组分析

本研究探讨不同程度无精子症患者睾丸组织的转录组差异,了解差异表达基因(DEG)在功能、分类和代谢通路的不同,揭示无精子症患者精子发生分子机制,为促进男性不育研究的发展提供理论基础.选取1份非梗阻性无精子症和4份梗阻性无精子症患者睾丸组织样品(从无精子到有精子),进行RNA提取和文库构建,利用Illumina HiSeqTM2500高通量测序,构建无精子症患者睾丸组织转录组文库,并用生物信息学方法进行分析.结果发现,样品比对基因组数据库的平均比对率为94.38%,共检测2 242个属于预测新的蛋白质编码基因的转录本.得到差异表达基因统计结果为:NOA vs. OA1基因上调8 045,下调1 150;OA1 vs. OA2基因上调1 538,下调420;OA2 vs. OA3基因上调1 275,下调1 690;OA3 vs. OA4基因上调1 834,下调1 853.比较5例无精子症睾丸组织的差异基因KEGG,主要富集在RNA降解通路、基底细胞瘤通路、癌通路、黑色素生成通路和调节干细胞多能性等信号通路. PRM1、PRM2、TNP1、UBXN6、CXCL16、NUPR2、CCDC136和CRISP2等基因的表达呈递增趋势,并具有时序特异性.此外,5例无精子症睾丸组织的表达基因有不同程度的基因融合.综上,基因融合可能和无精子症相关,并且不同程度无精子症患者睾丸组织的差异表达基因数量、功能、分类和代谢通路不同.本研究筛选出精子发生、精子运动等差异表达基因,丰富了无精子症患者睾丸组织转录组信息,为开展无精子症患者睾丸组织相关基因及分子调控机制的研究奠定基础.     

基于转录组的八角挥发油合成相关基因挖掘与分析

为更好地挖掘八角(Illicium verum)挥发油合成相关基因，该文对挥发油性状差异显著的优良无性系桂角69号及普通品种砧01号叶片进行了转录组测序及组装注释，并对差异表达基因进行了GO分类和KEGG通路分析。结果表明：(1)转录本经组装后获得84 182条序列，使用NR、NT、Swiss-Prot、KEGG、KOG、GO和Pfam数据库进行序列比对，共注释了59 161条序列，筛选出30 572个差异表达基因。与砧01号相比，桂角69号叶片中上调基因有15 025个，下调基因有15 547个。(2)GO分类结果显示共有20 287个差异基因被注释。KEGG分析结果表明，有21 600个差异基因被注释到133条KEGG通路上，其中挥发油合成相关的单萜生物合成通路、萜类骨架生物合成通路、苯丙素合成通路中的芳樟醇合酶、月桂烯合酶、香叶基香叶基焦磷酸合酶、肉桂酰辅酶A还原酶、咖啡酸3-O-甲基转移酶、肉桂醇脱氢酶等关键酶基因呈差异表达。(3)转录因子分析发现差异表达基因分布于31个转录因子家族，其中MYB家族序列数量最多。该文利用转录组测序技术分析八角优良无性系与普通品种叶片的差异基因及...