内切酶SCaI对不同纯度质粒的酶解效率探讨

限制性内切酶ＳＣａＩ适用于多种质粒载体,尤其是融合蛋白表达载体,ｐＧＥＸ系统,因它具有二个ＳＣａＩ酶切位点,因此用ＳＣａＩ酶解图谱鉴定以ｐＧＥＸ系统为载体的重组子甚为便捷。简便碱裂解法提取重组ＤＮＡ省时,省耗。本文探讨了ＳＣａＩ对用常规和简便两种碱裂解法提取的重组ＤＮＡ的酶解效率。结果表明：（１）简便碱裂解法抽提的重组ＤＮＡ,用ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、ＰｓｔＩ、ＢａｍＨＩ等限制性内切酶酶解,可以获     

人淀粉样前体蛋白基因C端在SH-SY5Y细胞系中的稳定表达及其对细胞生长发育的影响

淀粉样前体蛋白（ＡＰＰ）是阿尔茨海默氏病（ＡＤ）病因学中重要的分子,但其正常的生理功能尚不清楚．为了研究细胞内过量产生其各种片段对细胞生理机能的影响．将人ＡＰＰ６９５ｃＤＮＡ中编码Ｃ端１０５个氨基酸残基的ＤＮＡ片段重组到真核表达载体ｐＤＯＲｎｅｏ中形成重组质粒ｐＤＯＲ－ｎｅｏ－ＣＴ．然后用脂质体将其转染到人神经母细胞瘤细胞ＳＨ－ＳＹ５Ｙ中．用８００μｇ／ｍｌＧ４１８筛选获得了在ｍＲＮＡ和蛋白质水平均表达相应片段的稳定细胞系．ＭＴＴ和ＬＤＨ分析表明,ＡＰＰＣ端的表达未能对ＳＨ－ＳＹ５Ｙ细胞产生明显的毒性作用．     

HCV核心蛋白在昆虫细胞中的表达及其免疫学特性的初步评价

通过逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）从丙肝患者的血清中分离出编码完整ＨＣＶ核心蛋白（Ｃ区）的ｃＤＮＡ片段,并将其克隆到杆状病毒转移质粒中。重组转移质粒ＤＮＡ与线性的杆状病毒ＤＮＡ共转染Ｓｆ９昆虫细胞,经蚀斑筛选获得了带编码全部核心蛋白基因的重组杆状病毒。重组病毒感染细胞后表达ＨＣＶ核心蛋白,其分子量的为２０ｋＤ。免疫印染和酶联免疫实验表明,此重组蛋白能被人ＨＣＶ阳性血清所识别。动物实验表明此重组蛋白能诱导小鼠产生特异性抗体。     

以家蚕核型多角体病毒为载体高效表达天花粉蛋白基因

本文报道以家蚕核型多角体病毒为载体,在家蚕体内高效表达天花粉蛋白基因的结果。天花粉蛋白基因是用ＰＣＲ技术从栝楼基因组中分离的,该基因被插入到家蚕核型多角体病毒转移载体质粒ｐＢｍ-１的多角体蛋白基因启动子下游,构建成重组质粒ｐＢｍＴＣＳ。将重组质粒ＤＮＡ和野生型ＢｍＮＰＶＤＮＡ共转染家蚕培养细胞,通过在家蚕培养细胞中进行同源重组和筛选,获得了无多角体的重组病毒ＢｍＴＣＳ。采用ＰＣＲ技术对重组病毒进行了鉴定,证实重组病毒合天花粉蛋白基因。重组病毒对家蚕的感染性不及野生病毒,提示表达产物对病毒的增殖有抑制作用。对重组病毒感染的家蚕血淋巴进行了ＳＤＳ-ＰＡＧＥ和免疫印迹分析,结果显示在蚕体血淋巴中的表达产物天花粉蛋白占总蛋白的５％。本实验为利用基因工程方法大量生产天花粉蛋白提供了又一条新的途径。     

柯萨奇B3病毒结构和非结构蛋白基因重组质粒的构建及其在体外真核细胞中的

制备ＣＶＢ３结构蛋白和非结构蛋白重组质粒ＤＮＡ疫苗时,采用ＲＴ－ＰＣＲ从ＣＶＢ感染的ＨｅＬａ细胞中扩增ＶＰ１、ＶＰ２、２Ａ和３Ｄ基因,重组入真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３中,构建ｐｃＤＮＡ３／ＶＰ２、ｐｃＤＮＡ３／ＶＰ１、ｐｃＤＮＡ３／２Ａ和ｐｃＤＮＡ３／３Ｄ重组质粒,经酶切和测下实扩增的序列并将各重组质粒体外转染真核细胞ＣＯＳ－７,用ＲＴ－ＰＣＲ检测ｍＲＮＡ的转录,用Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ检测表达产物。结果４种重组质粒酶切出相应大小的目的片段,经测序证实为ＣＶＢ３相应序列,Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ证实能够在体外真核细胞中表达。本文成功构建ＣＶＢ３结构与非结构蛋白的重组质粒ＤＮＡ疫苗,为进一步研究其免疫效果奠定了基础。     

重组人干细胞因子在大肠杆菌中的表达及活性鉴定

采用ＰＣＲ方法从重组载体ｐＫＫＳＣＦ扩增出人干细胞因子（ＳＣＦ）基因ｃＤＮＡ片段,经亚克隆构建成表达载体ｐＥＴ１１ｄＳＣＦ,经限制性酶谱分析鉴定证实．继用ＩＰＴＧ诱导重组ｐＥＴ１１ｄＳＣＦ在大肠杆菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）中表达,经初步纯化获得重组人ＳＣＦ蛋白质,经检测具有生理活性,对脐带血ＣＦＵ－ＣＭ和ＨＰＰ－ＣＦＣ增殖有明显刺激作用,为进一步的生物工程研究奠定了基础．     

人粒细胞集落刺激因子hG—CSF cDNA在大肠杆菌中表…

在不改变编码蛋白质氨基酸序列的前提下,利用合成ＤＮＡ接头的方法,在原始ｃＤＮＡ克隆基础上,构建了５＇端密码子富含ＡＴ的ｈＧ－ＣＳＦ ｃＤＮＡ突变体,使ｈＧ－ＣＳＦ ｃＤＮＡ得以在大肠杆菌中表达,但表达水平很低,借助相同的手段,在ｈＧ－ＣＳＦ ｃＤＮＡ ５＇端增加２４核苷酸对的ＦＬＡＧ肽编码序列,构建了ｈＧ－ＣＳＦ杂合蛋白（在ｈＧ－ＣＳＦ成熟蛋白Ｎ末端增加８氨基酸残基ＦＬＡＧ肽,二者结合点为肠激肽酶     

19S调节复合体中亚基之间的相互关系

26Ｓ蛋白酶体是真核细胞内最主要的非溶酶体蛋白水解酶 ,它降解泛素化的底物蛋白质 ,在调节必需的胞内生命活动 (如细胞周期、抗原提呈、转录、信号转导 )中发挥着重要作用。 2 6Ｓ蛋白酶体是多亚基复合体 ,由两个亚复合体 2 0Ｓ降解核心和 19Ｓ调节复合体 (亦称ＰＡ70 0 )组成 (图 1) ,它们与在古细菌发现的蛋白酶体有高度的同源性[1] 。底物蛋白质与泛素单体结合后 ,被 2 6Ｓ蛋白酶体识别并进入到其内部的水解空间被降解。 2 0Ｓ颗粒是底物蛋白质的水解中心。 19Ｓ调节复合体 (19Ｓｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｃｏｍ ｐｌｅｘ ,以下简称 19ＳＲ…     

端粒酶与血液系统肿瘤

端粒 (ｔｅｌｏｍｅｒｅ)是真核细胞染色体末端的ＤＮＡ 蛋白质复合物。端粒酶 (ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ)是由ＲＮＡ和蛋白质组成的特殊核糖核蛋白复合体 ,具有逆转录酶活性 ,能以自身ＲＮＡ为模板 ( 5′ ＣＵＡＡＣＣＣＵＡＡＣ 3′)合成端粒。在正常人体细胞中端粒酶活性表达受抑 ,而在肿瘤形成时可被激活。因此在某些永生细胞和肿瘤细胞中随着ＤＮＡ的复制 ,其端粒不会缩短。1 .端粒酶在血液系统肿瘤表达端粒酶在人体细胞大多为阴性 ,但在胚系细胞、精子细胞、小肠陷窝细胞、毛囊细胞、上皮细胞、活化淋巴细胞、子宫内膜细胞和大多数肿瘤细…     

人腺苷酸环化酶激活多肽cDNA克隆和序列分析

以人睾丸组织总ＲＮＡ为材料,用ＲＴ－ＰＣＲ方法合成了人腺苷酸环化酶激活多肽（ＡＣＡＰ）编码区（５３０ｂｐ）和全长ｃＤＮＡ（１９３０ｂｐ）片段．并分别将这些ｃＤＮＡ片段克隆入ｐＵＣ１８载体的ＳｍａⅠ限制性内切酶位点．对重组质粒分别采用直接ＤＮＡ双链末端终止法和在核酸外切酶Ⅲ和核酸酶Ｓ１作用下连续缺失ＤＮＡ后,相继克隆,构成一系列连续缺失的缺失体的方法,测定了全部核苷酸顺序．结果表明：ＡＣＡＰ编码区的ｃＤＮＡ顺序与已报道的有１２处碱基的改变,其中１１处碱基顺序的改变不引起编码的氨基酸变化,只有第３８５位的Ｔ→Ａ后,才引起其编码的氨基酸由Ｓｅｒ→Ｔｈｒ,但由于Ｓｅｒ和Ｔｈｒ的理化性质极其相似,这一变化可能并不导致蛋白质的生物活性的变化．这些改变可能是由于种族、群体或个体的差异．     

丙型肝炎病毒基因组C区和NS3区基因cDNA的融合及其在大肠杆菌中的表达与初步应用

通过逆转录（ＲＴ）－聚合酶链式反应（ＰＣＲ）,从中国人丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）携带者的血清中扩增并克隆到２段ｃＤＮＡ片段,即ＨＣＶ基因组Ｃ区抗原基因Ｃ８３１ｃＤＮＡ片断（约５３０ｂｐ）和ＮＳ３区抗原基因Ｃ３３ｃｃＤＮＡ片段（约８６０ｂｐ）。Ｃ３３ｃｃＤＮＡ片段同Ｃ８３１ｃＤＮＡ片段经连接　　　肽Ｓｅｒ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ连接成为基因嵌合体Ｃ３３ｃ－Ｃ８３１（约１４００ｂｐ）。Ｃ３３ｃ－Ｃ８３１基因嵌合体同温控型原核表达载体ｐＢＶ２２０重组,构建成表达质粒ｐＢＶ／Ｃ３３ｃ－Ｃ８３１,并在大肠杆菌细胞中获得了重组嵌合抗原Ｃ３３ｃ－ＣＬ的表达。通过酶切分析和Ｗｅｓｔｅｒｎ免疫印迹法,对约占菌体可溶性蛋白９％的表达产物做了鉴定。采用ＴｒｉｔｏｎＸ－１００和盐析处理,获得粗提表达产物。粗提的表达产物经尿素裂解和离子交换层析纯化,得到可用于检测抗ＨＣＶ核壳蛋白和抗ＮＳ３区抗体的重组嵌合抗原Ｃ３３ｃ－ＣＬ。对Ｃ３３ｃ－ＣＬ做抗原性分析发现,它同时具有完整的Ｃ３３ｃ抗原和Ｃ２２抗原的免疫反应活性,完全能替代单纯的Ｃ３３ｃ和Ｃ２２抗原。该嵌合抗原在血清学诊断中有重要的应用价值,可望成为新一代ＨＣＶＥＩＡ诊断试剂的优选抗原。     

逆转录病毒载体介导诱导型NO合酶在神经细胞中表达

为了深入研究诱导型一氧化氮合酶基因表达产物在阿片耐受和依赖中作用,采用脂质体介导基因转染技术,将ｉＮＯＳ ｃＤＮＡ重组逆转录病毒载体导入ＮＧ１０８－１５神经细胞,获得Ｇ４１８抗性克隆,命名为ＮＧ－ＬＮＣＸｉＮＯＳ细胞。ＤＮＡ印迹杂交,ＰＣＲ扩增及ＲＴ－ＰＣＲ和蛋白质免疫印迹杂交分析,证实ＮＧ－ＬＮＣＸｉＮＯＳ细胞有外源ｉＮＯＳ基因整合,转录和表达;ＮＡＤＰＨ黄递酶（ＮＡＤＰＨ ｄｉａｐｈｏｒａｓｅ     

缺氧促进热休克蛋白70在肺动脉平滑肌细胞中的表达

缺氧性肺动脉高压中肺动脉结构重组,中膜平滑肌细胞增殖并迁移,但机制不明。本研究观察缺氧对肺动脉平滑肌细胞（ＰＡＳＭＣ）细胞周期、ＤＮＡ合成及细胞增殖的影响,并通过观察缺氧对ＰＡＳＭＣ热休克蛋白７０（ＨＳＰ７０）表达的影响,初步探讨缺氧的作用是如何介导的。结果表明缺氧可直接或协同内皮质－１促进ＰＡＳＭＣ ＤＮＡ合成及细胞增殖,并可增加ＨＳＰ７０在ＰＡＳＭＣ中的表达。     

肌肉注射质粒DNA对蟾蜍骨骼肌单收缩力及强直收缩力的影响

ＤＮＡ结合蛋白不仅存在于细胞核内 ,ｈａｇｓｔｒｏｍ及本实验室分别在家兔及大鼠发现骨骼肌肌质网 (ＳＲ)膜上也存在ＤＮＡ结合蛋白质 ,质粒ＤＮＡ与ＳＲ上ＤＮＡ结合蛋白结合之后 ,明显影响ＳＲ功能 ,促进ＳＲＣａ2 转运 ,即Ｃａ2 摄入及释放均增加。骨骼肌ＳＲ主要参与肌肉兴奋收缩耦联及维持肌细胞胞浆钙离子稳态 ,外源质粒ＤＮＡ进入骨骼肌细胞后是否可以通过ＳＲ上ＤＮＡ结合蛋白改变ＳＲ功能 ,并进一步影响肌肉收缩活动尚不清楚。本实验应用蟾蜍坐骨神经腓肠肌标本 ,观察肌肉注射质粒ＤＮＡ对肌肉收缩功能的影响。1　材料与方法…     

毕赤酵母表达的重组乙肝表面抗原SS1的纯化及性质鉴定

对毕赤酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）表达的重组乙肝表面抗原ＳＳ１的纯化以及蛋白质的理化性质及免疫原性进行了进一步的研究。采用单抗亲和层析的方法,一步纯化即可得到纯度为９５％的纯化蛋白质。ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹鉴定表明,纯化的ＳＳ１融合蛋白同时具有良好的Ｓ和ＰｒｃＳ１抗原性。ＣｓＣ１密度梯度离心和电镜检测的结果则表明,这一重组抗原可以形成与ＨＢＶ亚病毒颗粒类似的颗粒结构。在ＢＡＬＢ／     

河套蜜瓜ACC合成cDNA酶片段的克隆和序列分析

１－氨基环丙烷－１－羧酸（ＡＣＣ）合成酶是高等植物中乙烯生物合成的关键酶。以成熟河套蜜瓜果实的ＲＮＡ为模板,经反转录和ＰＣＲ扩增得到预期大小的ＤＮＡ片段,插入到ＰＵＣ１９的ＳｍａＩ位眯后转化Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９,筛选出重组子ＰＨＭＡＳ１。离列分析表明获得了６２７ｂｐ的ＡＣＣ合成酶ｃＤＮＡ片段。与已报道的ＡＣＣ合成酶基因相应离理比较有很高的同源性。     

荧光素酶基因的克隆表达及其产物纯化和鉴定

利用能形成多角体的杆状病毒载体系统ｐＳＸＩＶＶＩ＋Ｘ３,把萤火虫荧光素酶（Ｆｉｒｅｆｌｙｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ,Ｌｕｃ）ｃＤＮＡ克隆到转移功体质粒ｐＳＸＩＶＶＩ＾＋３／３通过共转染草地夜蛾（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ,Ｓｆ）细胞得到重组毒株ＴｎＮＰＶ－Ｌｕｃ－ＯＣＣ,在该重组杆状病毒株中Ｌｕｃ基因受到合成启动子和ＸＩＶ启动子的双重调控。该重组杆状病毒株在Ｓｆ９细胞中能形成多角体,有Ｘ－     

日本血吸虫26kD抗原基因在BCG中的表达

研究了外源基因日本血吸虫２６ｋＤ抗原（Ｓｊ２６ＧＳＴ）在卡介苗（ｂａｃｉｌｕｓＣａｌｍｅｔｅ－Ｇｕｅｒｉｎ,ＢＣＧ）、耻垢分枝杆菌（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）和大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中的表达．运用重组ＤＮＡ和聚合酶链反应（ＰＣＲ）等分子生物学技术,以表达Ｓｊ２６ＧＳＴ的Ｅ．ｃｏｌｉｐＧＥＸ衍生质粒为模板,经ＰＣＲ得到编码Ｓｊ２６ＧＳＴ的全长ｃＤＮＡ片段．将其按正确的阅读框顺序,克隆到人结核杆菌热休克蛋白（ｈｅａｔｓｈｏｃｋｐｒｏｔｅｉｎ,ＨＳＰ）７０的启动子下游,再将ＨＳＰ７０启动子和Ｓｊ２６ＧＳＴ基因一起亚克隆到Ｅ．ｃｏｌｉ－分枝杆菌穿梭质粒ｐＢＣＧ－２０００中,得到Ｅ．ｃｏｌｉ－分枝杆菌穿梭表达质粒ｐＢＣＧ－Ｓｊ２６．ｐＢＣＧ－Ｓｊ２６电转化入ＢＣＧ和Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓｍｃ２１５５中表达Ｓｊ２６ＧＳＴ抗原,所表达的天然重组Ｓｊ２６ＧＳＴ（ｒＳｊ２６ＧＳＴ）为可溶性蛋白,在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上分子量为２６ｋＤ处可见明显的表达蛋白带．其表达量分别占ＢＣＧ和Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ菌体总蛋白的１５％和１０％．可见,Ｓｊ２６ＧＳＴ基因能在ＢＣＧ中高效表达．     

人GM—CSF cDNA的克隆和在大肠杆菌中的表达

从诱导的人胚肺细胞ＨＦＬ株中提取总ＲＮＡ．经ＲＴ－ＰＣＲ反应获取了人ＧＭ－ＣＳＦｃＤＮＡ,ＤＮＡ序列测定表明其顺序与文献报道完全一致。为了获得高效表达,应用ＰＣＲ改造了人ＧＭ－ＣＳＦ的ｃＤＮＡ５’端核苷酸序列,并将改造的人ＧＭ－ＣＳＦ基因插入含Ｔ７启动子的质粒ｐＥＴ－１１ｄ构建成表达质粒ｐＥＴＣ－５,将此质粒转化大肠杆菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）得到表达菌株ＢＬＥＣ４。表达菌株用０．５ｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ诱导２小时后,产生大量重组蛋白并形成包涵体。ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳图谱扫描结果表明,ｒｈＧＭ－ＣＳＦ产量占菌体总蛋白量的１６％。ＥＬＩＳＡ和ＴＦ－１细胞培养测定表明,初步纯化和复性的ｒｈＧＭ－ＣＳＦ具有天然的ｈＧＭ－ＣＳＦ生物活性。     

丙型肝炎病毒非结构区NS4b基因片段的克隆和表达

采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术和ＤＮＡ体外重组方法,克隆出５７９ｂｐ的丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）ＮＳ４ｂ基因片段,插入到原核高效表达载体ｐＥＴ－２８ａ中,构建重组质粒ｐＥＴ／ＮＳ４ｂ,转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株,经ＩＰＴＧ诱导培养后,获得了目的蛋白的高效表达。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析显示在３０ｋＤ处有一条表达的目的蛋白区带。通过固定化金属配体亲和层析（ＩＭＡＣ）纯化目的的蛋白,ＥＬＥＳＡ检测结果表