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[目的]探究模板引物结合区发卡对定量PCR的影响及优化方法。[方法]用分布连接法构建一系列在模板引物结合区含环大小为5~60 nt,茎长9 bp的DNA模板,考察发卡环部大小、茎干区GC含量对q PCR扩增效率的影响,再针对引物浓度、引物长度及退火温度来优化含发卡结构DNA模板的扩增。[结果]环区为5~40 nt时,其Ct值比对照组高1.3~4.2,对q PCR的抑制作用与环大小成负相关;茎长9 bp发卡结构当GC含量达3 bp以上时会对定量扩增产生明显抑制作用;增加引物长度、提高引物浓度和退火温度可提高发卡模板的扩增效率。[结论]模板引物结合区环大小在40 nt以内,茎长达9 bp的发卡结构对q PCR扩增会产生抑制作用,通过增加引物长度、提高引物浓度和退火温度可缓解此类抑制。 相似文献
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为了提高DNA大片段的拼接效率,通过引入逐次退火的PCR的方法,改良了传统的重叠延伸PCR方法。逐次退火PCR法,一方面延长了重叠区的PCR引物长度;另一方面把原来在1个循环中1个退火温度改成若干个,逐次降低退火温度,适用于Tm值相差比较大的引物;相邻的退火温度之间相差3-6℃。结果显示,通过此种方法成功拼接了ω3(2)和HCT两个大片段;PCR产物电泳条带单一,克隆测序证实序列完全正确,可以直接应用于后续试验。这种改进后的方法可以有效减少非特异性扩增,提高灵敏度,把这种方法称之为逐次退火重叠延伸PCR。 相似文献
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双退火温度PCR扩增DNA 总被引:1,自引:0,他引:1
【目的】与设置单一退火温度的常规PCR(S-T_m PCR)不同,本研究探讨双退火温度PCR(D-T_m PCR)由高到低设置2条引物各自退火温度。【方法】以PxF61和VPel为正/反向引物,用Q5 DNA聚合酶扩增4.3 kb的模式DNA pET20b-Xyn(黑曲霉木聚糖酶基因)。PCR程序为:98°C预变性3 min,30次循环{98°C变性30 s,设置双退火[T_(m1) 70°C(Px F61)退火15 s、T_(m2) 62°C(VPel)退火15 s],72°C延伸130 s}。【结果】与S-T_m PCR(61°C)相比,D-T_m PCR扩增4.3 kb的目的条带亮度更高,减少2条杂带;经25次循环目的 DNA产物量最高。D-T_m PCR用于长片段引物扩增5.3 kb重组质粒DNA条带更明显。【结论】D-T_m PCR直接扩增目的条带,避免了探讨T_m的麻烦,不要求2条引物T_m相近,从理论上更加清晰地认识引物与各自模板分步退火过程。 相似文献
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目的:优化PCR条件,建立能特异扩增出α-芋螺毒素基因片段的最理想PCR条件.方法:根据α-芋螺毒素基因保守的信号肽或内含子序列和非翻译区保守核苷酸序列设计了多组特异引物,并对引物浓度和退火温度等影响因素进行优化.结果:根据α-芋螺毒素基因保守的内含子序列为引物、引物浓度为0.1 μmol/L、退火温度为50℃时,能特异的扩增出α-芋螺毒素基因片段,分子量大约分别为180bp和300bp.结论:采用优化的PCR条件,能筛选出克隆新型的α--芋螺毒素基因片段的最理想引物,为α-芋螺毒素的化学合成、活性研究和应用提供基础. 相似文献
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聚合酶链反应(PCR)对未知序列DNA的扩增技术 总被引:2,自引:0,他引:2
聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)是由引物介导,在体外将特异性DNA序列利用酶促作用进行扩增的方法。双链DNA热变性,然后在低温下与引物退火,再在中等温度下进行延伸,三步为一循环。一般经30~35次循环,很容易将目的基因或DNA片段特异地扩增至少10~6~10~7倍。它已是分子生物学研究中常用的、不可缺少的一项基本技术。但常规PCR需在待扩增的已知序列两端分别设计两个寡核苷酸引物,也就 相似文献
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利用重叠PCR技术扩增单链抗体基因或位点突变是抗体文库构建或稳定表达的关键和难点,国内外文献未见其方法学的系统报道.以不同VH、VL和Linker基因为拼接模板进行重叠PCR,针对影响重叠PCR扩增的拼接类型,引物设计,反应条件等进行优化.结果表明两段重叠连接比三段更容易实现,且扩增效果好;引物的互补序列长度一般应大于15 bp,且在18~24 bp 时扩增效果最好;退火温度在52~60℃,Mg2+浓度在1.5~2.5 mM时对拼接的效果影响较小;直接或间接使用拼接模板均可以实现重叠PCR的扩增.利用优化策略,首次构建了抗除虫菊酯的scFv基因文库并引入抗XAC糖蛋白scFv基因的点突变,为除虫菊酯抗体文库构建和抗XAC重组抗体的稳定表达奠定了基础. 相似文献
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大鼠及小鼠微卫星引物在社鼠中的跨种扩增 总被引:1,自引:1,他引:0
利用微卫星引物在同一属、科、目不同种之间具有通用性的特点,通过PCR扩增、聚丙烯凝胶电泳和银染技术对社鼠(Niviventer confucianus)近缘物种大鼠(Rattus norvegicus)、小鼠(Mus musculus)中已知的70个微卫星位点引物进行跨种扩增,筛选适合社鼠相关研究的多态微卫星引物.结果发现,40个位点引物出现扩增条带,21个位点引物能够稳定扩增,其中15个位点杂合,13个位点具有多态性;PCR扩增的Mg2+浓度主要集中在1.5及2.0 mmol/L,退火温度在50~60℃之间不等.虽然部分扩增产物有影子带的存在,但并不影响等位基因的判读.总体来看,利用大、小鼠的微卫星引物扩增社鼠的微卫星位点是可行的. 相似文献
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以厚朴DNA为模板,利用正交试验分别对影响厚朴ISSR-PCR反应的Taq酶浓度、dNTP浓度、引物浓度、Mg~(2+)浓度、模板DNA浓度进行了优化,并通过梯度PCR确定不同引物的最佳退火温度和循环次数,最终确定厚朴最佳反应体系及扩增条件为:25μl 体系,其中包括1.5 mmol·L~(-1) MgCl_2,0.3 μmol·L~(-1)引物,0.04 U·μl~(-1)Taq 酶,0.2 mmol·L~(-1) dNTP,4 ng·μl~(-1)模板DNA,1 × Buffer;扩增程序:94℃预变性5 min,94℃变性30 s,50℃~60℃(退火温度随引物不同而定)退火45 s,72℃延伸90 s,共40个循环,然后72℃延伸8 min,4℃终止反应.此外,还利用优化的反应体系成功筛选出21条ISSR引物,并利用部分引物对厚朴个体进行了遗传多样性分析. 相似文献
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《生物技术通报》1993,(3)
930806 利用引物接头介导对结合在磁性同相上的DNA徽 PCR扩增进行檀物启动手的克隆和直接定序[荚]/Espelund,M.…,BioTechniques.一1992,13(1).一74~81[译自DBA,1992,儿(17),92—09541] 目标DNA是一已知序列的旁侧片段。通过引物一接头(adaptor)与一个经限制性酶切的基因f~[DNA相连,而免去逆向PCR所需的环化步骤。扩增的第一步即有专一性。用一种生物素标记的DNA引物(与已知的侧翼序列互补)进行线性PCR,可产生单链产物,用抗生蛋白链菌素包埋的磁珠可将之纯化。在第一步去除染色体组DNA后,进行两轮指数PCR,先用adaptor一引物… 相似文献
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介绍了基于薄膜加热器的新型连续流动式PCR微流控装置的设计与制作;讨论了退火温度、PCR反应试剂(引物、Mg2 、dNTPs以及Taq DNA聚合酶)浓度以及PCR溶液的流动速度等对连续流动式PCR反应的影响;结果发现反应试剂影响连续流动式微流控PCR扩增的行为不同于它们影响传统PCR的行为,在较宽的浓度范围内都不会引起非特异性扩增。除此之外,在15 min内能成功对249 bp的人类β-肌动蛋白基因进行扩增,扩增速度比传统PCR快;通过低热容量的薄膜加热器来维持三个温度区带的恒温,完成33个循环的连续流动式PCR扩增能量消耗小于0.0088 kW.h,比传统PCR仪低得多,新研制的PCR微流控装置有可能成为便携式装置。 相似文献
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《基因组学与应用生物学》2016,(1)
为了对狗牙根进行SSR-PCR分子标记分析,本研究对狗牙根的SSR-PCR反应体系进行了优化,利用L16(45)正交设计对狗牙根SSR-PCR反应体系中的Taq酶、Mg~(2+)、dNTPs和引物4个因素的多个水平进行了筛选,PCR结果用SAS进行方差分析,并利用筛选出的最优体系对退火温度进行了筛选。结果表明:(1)Taq酶、Mg~(2+)和引物3个因素对狗牙根SSR-PCR扩增结果有极显著影响,影响程度为Taq酶Mg~(2+)引物,而d NTPs对扩增结果影响不显著;(2)筛选出了20μL的狗牙根SSR-PCR最优反应体系为0.5 U Taq酶、2 mmol/L Mg~(2+)、0.4μmol/L引物、0.2 mmol/L dNTPs、30~60 ng模板DNA;(3)退火温度50~62℃对本试验所选引物的SSR-PCR扩增结果影响不大,本研究选用55℃作为退火温度。 相似文献
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叉孢苏铁ISSR反应条件的优化及初步应用 总被引:9,自引:0,他引:9
利用ISSR 技术对叉孢苏铁(Cycas segmentifida)遗传多样性进行研究,对影响PCR 反应的DNA 模板浓度、dNTP 浓度、Taq 酶含量、引物浓度、Mg2 浓度和退火温度等进行了条件优化。叉孢苏铁的ISSR 最佳反应扩增体系为20μl 反应体积2μl 10 ×PCR buffer,模板DNA20ng,1UTaq 酶,1.5~2.75mmol/L MgCl2,0.1mmol/L 4 ×dNTP,0.22μmol/L 引物,2%甲酰胺。适宜的退火温度为50~52℃。从103 条引物中筛选出12 条用于所有样品的扩增,共扩增出122 条带,其中多态性条带为86 条,占总条带数的70.49%。POPGENE分析结果表明,种级水平上,叉孢苏铁具有中等稍高的遗传多样性水平,且各居群间有着很高的遗传分化度。 相似文献
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报道了一种新的组合多位点突变策略,通过单管中三阶段聚合酶链式反应(PCR)得以实现。在第一阶段,PCR扩增出多位点突变大引物,然后在第二阶段延伸大引物,在第三阶段获得全长突变基因序列。基于退火温度与热循环参数的组合大引物反应的优化,三个阶段中退火温度差异小(低于10°C),成功扩增出多位点突变基因序列和比邻突变序列。是一种简单、高效的多位点突变方法。 相似文献
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《生物技术》2019,(5)
[目的]为了快速、准确地对热带小奥德蘑JZB2115055进行鉴定和保护,该研究开发了该菌的序列特异性扩增(SCAR)标记。[方法]采用26个ISSR引物对19个小奥德蘑属菌株进行PCR扩增,以引物P826扩增时,JZB2115055在700 bp~1 000 bp之间出现了一条特异条带,获得此条带的DNA序列并设计特异性引物对P826-1-2XF/R。[结果]以19个小奥德蘑DNA为模板,P826-1-2XF/R为引物在JZB2115055中能够特异性地扩增出2条条带,长度分别为431 bp、537 bp;该引物在2~19号菌株中扩增不出目的条带或者扩增条带在2 000~5 000 bp之间。[结论]开发了热带小奥德蘑JZB2115055的SCAR标记,能够在该菌中特异性地扩增出431 bp和537 bp大小的条带,而其他18株菌株不能扩增出特异条带,此标记能够快速、准确地进行该菌的鉴定和保护。 相似文献
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对多个长片段的基因融合目前仍缺少有效的方法. 本文提出一种新的融合PCR策略,即在常规的重叠PCR的第1步和第2步均增加1个降落PCR程序,减少不适当的退火温度和PCR产物3′端额外碱基A对片段融合、扩增的影响,提高正确融合与扩增的效率. 结果表明,为构建平菇葡聚糖合成酶启动子的同源重组序列,在4个长度分别是1 015 bp、2 822 bp、2 206 bp和1 008 bp的片段进行融合时,在重叠PCR的第1步加上退火温度61.5 ℃~57.5 ℃、每降落0.5 ℃进行1个循环的降落PCR程序,在重叠PCR的第2步加上退火温度60 ℃~56 ℃、每降落0.5 ℃进行1个循环的降落PCR程序,经过1次PCR即获得顺序正确的全长融合片段. 测序结果与4个片段序列的一致性达到98.5%,降落-重叠PCR法对多个长片段的基因 融合具有较高的应用价值. 相似文献
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