噬菌体T4诱导的脱氧核糖核酸(DNA)连接酶的分离和纯化

本文介绍一个从噬菌体T4诱导的大肠杆菌中纯化DNA连接酶的简法。这是从同一起始原料(噬菌体T4感染的大肠杆菌菌体)同时提纯三种酶(多核苷酸激酶,DNA连接酶及RNA连接酶)的步骤的一部分。这个方法包括以下几步：超声破碎菌体,抽提粗酶,用硫酸链霉素沉淀去除多核苷酸激酶和DNA．甩I)EAE纤素素(DE-52)柱层折将DNA建接酶与RNA连接酶分离开来,用磷酸纤维素(P-II)分步冼脱DNA连接酶,对在Tris-HCI,pH7.6中含50％甘油的缓冲液透析加以浓缩。最终得到高浓度(5500单位／毫升)和高纯度酶制品。     

新生隐球菌基因组DNA不同抽提方法的比较

目的 DNA是进行分子生物学研究的重要基础。在本研究中,我们建立了2种简单快速抽提基因组DNA的方法并可用作PCR扩增的模板。通过比较4种不同的DNA抽提方法以确定哪种更适合进行下一步的基因分析。方法这4种方法是:玻璃珠法,酶法,3%SDS法和氯化苄法。玻璃珠法是用玻璃珠在混漩器上剧烈振荡破碎细胞壁;3%SDS法是将细胞在含10mmol/LDTT的3%SDS溶液中加热,然后用5mmol/LKAc和异丙醇抽提,DNA的产量通过A260测定。结果 3%SDS溶解法、经典酶法、玻璃珠法和氯化苄法的DNA产量分别为0.4154±0.0367、0.8484±0.0756、1.2636±0.2040、0.4070±0.0339(g/L×108CFU/mL)。结论玻璃珠法是最敏感、重复性好、简单、费用合理的抽提方法 。     

大熊猫和小熊猫粪便DNA提取的简易方法

采集了大熊猫和小熊猫的新鲜粪便样品 ,使用 1 0 0 %乙醇保存。通过重复离心富集研究动物的肠道脱落细胞 ,并使用乙醇和双蒸水洗涤以除去抑制物。用 1 %的SDS快速裂解细胞 ,离心除去残渣后 ,向裂解液中加入蛋白酶进行消化。消化结束后使用等体积的酚 /氯仿抽提 ,乙醇沉淀DNA。用双蒸水溶解粪便DNA后 ,使用PCR产物纯化试剂盒对粪便DNA进行纯化。电泳检测结果显示 ,从乙醇保存的大、小熊猫粪便样品中抽提到高质量的粪便DNA。对线粒体控制区、细胞色素b基因、 1 2SrRNA基因的PCR扩增反应以及测序结果也证实了样品保存方法和DNA抽提方法可靠而高效。此方法使用实验室内常用的分子生物学试剂 ,不仅克服了分子粪便学研究中常见的抑制物粪便DNA微量降解严重等障碍 ,与商业化的粪便抽提试剂盒 (QIAampDNAStoolMiniKit,Qiagen)相比还是一种经济的试验方法 (抽提反应成本为试剂盒的 1 / 5 )。文中还对粪便DNA内细菌基因组等背景DNA可能对分子粪便学试验结果的影响进行了探讨。在基于PCR技术的遗传学研究中 ,对于植食性动物而言 ,粪便内的背景DNA对目标动物DNA片断的扩增和序列测定未见影响 ;但对于肉食性动物 ,则必须考虑被捕食者基因组对试验可能产生的影响 ,应谨慎对待     

新疆哈密瓜花叶病病原体的研究——Ⅰ.病毒质粒的分离提纯方法

研究了分离提纯哈密瓜花叶病病毒(HMMV)质粒的简易方法。取新鲜的病株叶片加等量0.5M K_2HPO_4磨碎后,汁用氯仿澄清之,所产生的沉淀物用0.25M K_2HPO_4抽提三次以收回病毒质粒。40000转/分离心100分钟以沉降病毒。用此法可获得大量部分净化的HMMV 质粒。在病叶的超薄切片中见到了大量玩具风车状及束状包含体,显示HMMV 是马铃薯Y 病毒组成员。     

新疆哈密瓜花叶病病原体的研究——Ⅰ.病毒质粒的分离提纯方法

研究了分离提纯哈密瓜花叶病病毒(HMMV)质粒的简易方法。取新鲜的病株叶片加等量0.5M K_2HPO_4磨碎后,汁用氯仿澄清之,所产生的沉淀物用0.25MK_2HPO_4抽提三次以收回病毒质粒。40000转/分离心100分钟以沉降病毒。用此法可获得大量部分净化的HMMV质粒。在病叶的超薄切片中见到了大量玩具风车状及束状包含体,显示HMMV是马铃薯Y病毒组成员。     

棉阿舒囊霉细胞色素C的纯化、结晶和专一性的比较

棉阿舒囊霉(Ashbya gossypii)细胞色素C可用氯化钠抽提法或乙酸乙酯自溶法从菌体中抽出,经阳离子交换树脂Zeroli*226柱层析、硫酸铵分部沉淀及反透析后,可被纯化和结晶。乙酸乙酯自溶法的抽提得率高于氯化钠抽提法。两种方法抽提及纯化的细胞色素C在电泳中都表I见为均一,但氯化钠抽提之细胞色素C的生物活力略高于用乙酸乙酯抽提的细胞色素C。     

鳞翅目成虫乙醇保存标本基因组DNA的提取及在微卫星研究中的应用

高质量的基因组DNA样品是分子生态学研究的先决条件。本研究目的在于探索从东方粘虫Pseudaletia separata (Walker)成虫自然种群的乙醇保存标本中分离高质量基因组DNA的有效方案。在2 mL微型离心管中进行4种提取方案的实验比较,结果发现采用传统的苯酚抽提方法的2种方案提取腹部中段组织的基因组DNA,样品合格率只有7.69%~40%。但是,如果在苯酚抽提以前加入高浓度盐和十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）,就会使DNA样品合格率达到68.42%~95.28%,而且DNA平均产量达到5.59~10.04 mg/g,明显高于前者的2.83~5.78 mg/g （统计检验表明,在不同种群中差异显著或不显著）。研究结果还证明腹部组织比胸部组织更适宜提取DNA。对来自一个自然种群的99头东方粘虫DNA合格样品的统计分析表明,DNA提取总量（μg）与组织样品用量（mg）之间存在弱的正相关关系,平均DNA提取量（mg/g）与组织样品用量（mg）之间存在中度负相关关系。总之,在2 mL微型离心管中,用10~20 mg腹部组织,利用CTAB+苯酚抽提方法可以获得高纯度和高含量的基因组DNA样品。用该方案提取的基因组DNA能够顺利地进行微卫星位点的分离和基因分型。     

一种从大熊猫粪便中提取DNA的改进方法

本研究描述一个改进的方法，使从大熊猫粪便中提取DNA用于PCR扩增变得更加容易。在粪便DNA的提取过程中采用一个新的预处理方法，将粪便用预冷的丙酮洗2～3次，除去粪便中含有的大量PCR抑制物，然后用蛋白酶K裂解、酚氯仿抽提，能提取到纯度很高的DNA供PCR扩增。本实验PCR扩增了大熊猫脑源性神经营养因子(BDNF)基因和线粒体细胞色素6基因片段，并进行测序分析，证实了提取的可靠性。对比本方法和未经丙酮预处理的方法提取的DNA进行PCR扩增，前者的扩增结果明显优于后者。     

仿刺参体壁总RNA提取方法的建立

目的:通过对TRIzol一步法进行改进,建立一种从富含胶原蛋白、多糖及色素的仿刺参体壁提取总RNA的有效方法。方法:样品在液氮中研磨并用TRIzol匀浆后再进行抽提;对TRIzol一步法提取的总RNA进行DNaseⅠ消化和酚氯仿抽提,用2.5mol/L的醋酸钾沉淀,并加入适量糖原(10mg/mL)与RNA共沉淀。结果:琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度法以及RT-PCR检测结果表明,改进的方法能够有效去除基因组DNA、蛋白、多糖及色素的污染,RNA的产率提高。结论:制备的总RNA纯度高,完整性好,能够满足mRNA差异显示RT-PCR等分子生物学研究的要求,是一种提取仿刺参体壁及其他富含黏多糖、胶原蛋白和色素的动物组织总RNA的有效方法。     

提高叶绿体色素抽提效率的方法探讨

菠菜是“叶绿体色素提取和分离”实验中的常用材料。但受菠菜生长的季节性限制 ,有的季节采集不到 ,用其它植物绿叶 (树叶、蔬菜叶、野生植物叶 ) ,尤其是四季均可采到的常绿植物叶片替代 ,按教材的提取方法操作 ,所得到的色素提取液呈黄绿色 ,色素含量低 ,展层后 ,色素带颜色浅 ,有的色素带不能显现 ,实验效果差。分析其原因主要是 :1)对于角质层厚、机械组织多的绿叶 ,按常规方法研磨 ,组织、细胞破碎率低 ,提取出的色素绝对量少 ;2 )对含水量较高的蔬菜叶等 ,因过多水分的存在 ,降低了丙酮对色素分子的抽提效率。因此 ,实验中如何增加叶…     

四种土壤微生物总DNA的纯化方法的比较

比较了4种从土壤中直接抽提的微生物总DNA的纯化方法,实验结果表明1 %的琼脂糖凝胶电泳纯化方法及葡聚糖凝胶G 2 0 0离心层析纯化方法均不能完全纯化从土壤中抽提的微生物总DNA。若将直接抽提的总DNA先经葡聚糖凝胶G 2 0 0离心层析纯化,再用1 %的琼脂糖凝胶电泳纯化,则能取得较好的纯化效果。含2 %PVP的1 %琼脂糖凝胶电泳纯化,用DNA凝胶回收试剂盒回收后没有得到纯化后的土壤微生物总DNA。     

海洋尾丝虫(Uronema marinum)的DNA微量提取研究

以分离自青岛的海洋盾纤类纤毛虫 ,海洋尾丝虫 (Uronemamarinum)为材料 ,就微量条件下提取DNA的方法进行了探讨。成功地获得了活体直接提取、活体苯酚 /氯仿抽提、固定标本直接提取以及固定标本苯酚 /氯仿抽提等四种简便有效的微量DNA提取法。     

乳酸乳球菌苹果酸-乳酸酶基因的克隆

用酚抽提的方法提取乳酸乳球菌的基因组DNA,利用PCR方法从乳酸菌的基因组DNA中扩增出含有苹果酸-乳酸酶基因(malolactic enzyme gene,mle)的约1.6kb的DNA片断,用1%的琼脂糖凝胶分离扩增的片断,用试剂盒回收目的基因。将回收的目的基因与pGEM-T载体连接构建mle-T载体并转化大肠杆菌DH5a,挑取阳性克隆(白色菌落),酶切鉴定并测序。SalI酶切mle-T,回收mle DNA片断,与表达载体pET-28a载体连接,构建细菌Escherichia coli表达载体。     

一个实用的制备EMBL4 DNA 的方法

以往人们通常用氯化铯梯度超速离心法、甘油梯度超速度离心法等方法纯化噬菌体。采用这些方法,虽然可以获得纯净的λ噬菌体颗粒。但需要昂贵的试剂和仪器。操作也冗长繁琐。我们采用并改进了Reddy的方法,首先用DE_(52)纤维素柱层析纯化λ噬菌体颗粒,然后用酚抽提,从提纯的噬菌体中分离DNA,这个方法简单快速,不需要氯化铯梯度超速离心,也不使用SDS、蛋白酶和核酸酶。     

多核苷酸的合成与研究——Ⅴ.一种由3′端向5′端延伸的脱氧寡核苷酸的化学合成与抽提分离的新方法

化学合成特定顺序的DNA片段,目前除广泛采用三酯方法外,对二酯方法的合成与分离也作了不少的研究。为了用抽提法制备5′端带磷的片段,有些实验室曾采用三苯甲基苯硫乙醇、三苯甲基对胺基苯酚及三苯基苯胺等来保护5′端磷酸基,但这些磷酸上的保护基脱落条件比较复杂,产物回收也不够理想,抽提分离的片段长度一般在二核苷二磷酸。本文则用DMT选择性地保护5′核苷酸的3′羟基,抽提制备了脱氧二核苷二磷酸dpG~(BZ)pA~(BZ)-ODMT和脱氧四核苷四磷酸dpC~(An)pG~(Bz)pG~(BZ)pA~(Bz)-ODMT片段。     

家蚕核多角体病毒DNA

用酚或pH10缓冲液抽提家蚕核多角体病毒DNA 时,得到两种不同的结果。酚抽提的DNA 超离心沉降系数(S_20,w)是28.5S,电镜观察到的是线型DNA 分子,长约8微米,最长的可达10微米以上。聚丙烯酰胺凝胶电泳、Sepharose 柱分析和蔗糖密度梯度超离心等分析中,都是一个组分。pH10缓冲液抽提的DNA,超离心沉降系数(S_(20),w)只有4.7S,聚丙烯酰胺凝胶电泳中迁移速度远比酚抽提的快,并且是一条扩散的宽带,Sepharose 柱分析亦表明分子量远比酚抽提的小。文章对这种不同的结果进行了讨论。     

草鱼和鲤鱼线粒体 DNA 的分离纯化及其 COI 基因的分子克隆

本文报道配合使用差速离心和DNaseI核酸酶处理等步骤,从草鱼和鲤鱼新鲜肝组织分离线粒体DNA(mtDNA)的实验方法。这种方法经济简便,纯化的mtDNA产率多,纯度高,经限制性内切酶消化后进行琼脂糖凝胶电泳分离,可以得到清晰的DNA片段谱带,并可直接用于构建酶切图谱和线粒体基因的分子克隆。用这样的mtDNA,我们已克隆了草鱼和鲤鱼的细胞色素氧化酶亚基I基因(COI基因)。     

两种抽提乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA方法的效果比较

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)作为一种嗜肝DNA病毒,在感染肝细胞后会在细胞核中形成病毒转录复制的模板和基因储存库--共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA, cccDNA),其持续存在是乙型肝炎慢性化和难以治愈的核心,也是此研究领域内的重点。从细胞样品中稳定抽提获取cccDNA对于保证cccDNA检测的准确性至关重要。Hirt法是一种抽提真核细胞染色体外DNA的方法,被用于HBV cccDNA的抽提,但存在操作复杂和耗时长等问题。为简化操作,有研究对Hirt法进行改良,结合硅胶膜离心柱来抽提染色体外DNA,但尚不清楚该法用于HBV cccDNA抽提与传统Hirt法的效果差异。本研究基于HBV cccDNA细胞转染系统、HBV复制细胞系及感染系统,以DNA印迹(Southern blot)和定量聚合酶链式反应(quantitative polymerase chain reaction, qPCR)作为检测评价手段,平行比较了传统Hirt-酚/氯仿法与改良Hirt-过柱法抽提HBV cccDNA的效果。结果表明,两种方法具有相当的抽提效率和抽提特异性,而改良Hirt-过柱法耗时更短,提示在进行细胞HBV cccDNA抽提时可选择改良Hirt-过柱法以提高实验效率。     

一种高效可直接用于PCR分析的土壤总微生物DNA抽提方法

以CTAB-溶菌酶-蛋白酶K-冻融裂解法直接抽提土壤总微生物的基因组DNA,利用G8000沉淀和纯化DNA.结果表明,该方法是一种简便、有效可直接应用于PCR分析的土壤总微生物基因组DNA的抽提方法.采用含聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的缓冲液预洗,添加CaCl₂和BSA,可以去除腐殖酸;用PEG8000沉淀DNA,可以提高DNA质量;采用冻融法破碎细胞,CTAB、溶菌酶和蛋白质酶K共同作用以裂解细胞,可以保证获得大片段的DNA,提高DNA产率.用该方法抽提的七子花林下土壤总微生物DNA产率为9.22 μg·g^-1,A260/A280为1.65,可适用于 PCR扩增及扩增rDNA限制酶切分析(ARDRA)技术,适宜的模板DNA浓度为0.67 ng·μl^-1.快速、有效、可直接用于PCR分析的土壤总微生物DNA提取方法的建立,为大规模的土壤微生物分子生态学研究提供了可能.     

核酸及蛋白质合成、提取、纯化

920805通过酚抽提法从服硫氛酸中纯化质粒〔英〕/Fishe-r,J .A.…了Anal.Bioehem一1991,194(2)一309~315【译自DBA,1991,10(15),91-08441〕 该方法利用自动核营酸提取设备。基本操作是于pH4.5时用酚从IM的脏氰酸中进行抽提,这样能从水相中有效地去除染色体DNA,而超螺旋的质粒DNA仍留在水相中。51核酸酶消化表明,去除的染色体DNA已经变性,因而可溶于有机相。整套方法包括:用溶菌酶、RNA酶A和蛋白酶K连续预处理细菌细胞;消化后的溶液用酚/氯仿十水混合物抽提二次,再用氯仿抽提一次。通过异丙醇沉淀收集纯化的质粒。这样提纯的质粒中…