铜绿假单胞菌生物膜研究进展

生物膜（biofilm,BF）是细菌为了适应生存环境的需要而形成的与浮游细胞相对应的生存形式,是细菌生来具有的本领。不同的细菌形成生物膜的能力是不同的,铜绿假单胞菌极易形成生物膜,临床许多生物医学材料相关感染和某些慢性顽固性感染性疾病都与之密切相关,在生物膜中的细菌不仅耐抗生素还可耐抗体的杀菌作用,危害性严重。     

铜绿假单胞菌生物膜分散的研究近况

细菌分泌胞外多糖附着在物体表面组成一个结构性群体即生物膜,导致对抗生素的强抵抗性和感染的迁延不愈。反过来,已形成的生物膜也可以分散为游离菌,许多环境物质能够促进该分散过程,并且这些物质与抗生素合用对生物膜有强大的对抗作用。从生物膜到浮游菌是个复杂的过程,目前关于铜绿假单胞菌生物膜分散的特征、机制、诱导分子等已经引起了学者的强烈兴趣,随着问题的深入研究必然会给人类治疗生物膜所致的难治性感染带来更大的意义。     

氨溴索对铜绿假单胞菌生物膜早期黏附及胞外多糖的影响

目的研究氨溴索对铜绿假单胞菌PA01菌株BF早期黏附及胞外多糖复合物（Extracellular Pdymeric Substances,EPS）的影响。方法利用荧光多功能酶标仪检测各组不同时间点96孔板中pGFPuv转化PA01菌株的荧光强度,计算黏附率以表示干预对不同时间点细菌黏附的影响;利用罗丹明标记的麦胚凝集素（WGA）特异性结合细菌EPS,荧光显微镜下定性观察各组EPS的变化;利用硫酸-苯酚法定量各组细菌EPS的产量。结果8h组,氨溴索高浓度干预后细菌的黏附率由0．72±0．17下降至0．49±0．08,t=4．03,P〈0．05,与克拉霉素阳性对照组黏附率（0．50±0．06）相比,t=-1．19,P〉0．05;氨溴索低浓度干预后黏附率也有下降,但不及高浓度组明显;其余时间组趋势与8h组大致相似。罗丹明标记WGA可使胞外多糖显色,在荧光显微镜下观察可见氨溴索干预后EPS减少,稀薄;EPS定量实验,EPS总量（μg）／细菌干重（g）氨溴索干预组（477．82±7．90）较生理盐水对照组（523．76±10．12）有明显降低,t=8．76,P〈0．05。结论氨溴索可显著减少PA01菌株黏附及产EPS的能力。     

谷胱甘肽与铜绿假单胞菌致病性的关系

铜绿假单胞菌由于对抗生素的固有耐药和多重抗药性, 已成为医院内感染的重要病原菌之一。谷胱甘肽是细胞内最重要的抗氧化剂, 保护细胞免受氧化压力的损害。但是在铜绿假单胞菌感染的组织中, 由于绿脓菌素等致病因子的存在, 可以导致谷胱甘肽的水平降低。同时, 谷胱甘肽又可以增强绿脓菌素的致病性。本文就谷胱甘肽与铜绿假单胞菌关系的最新研究进展并结合作者的工作, 对上述问题进行了综述和探讨。     

依地酸钠对黏液型铜绿假单胞菌生物膜的作用

目的探讨金属螯合剂依地酸钠（EDTA）对黏液型铜绿假单胞菌（PA）成熟生物膜的杀菌作用和对其结构的影响。方法平板法培养成熟铜绿假单胞菌生物膜,微量肉汤稀释法测量EDTA、环丙沙星的最低抑菌浓度,平板计数法计算EDTA、环丙沙星单独及联合对生物膜菌落数的影响,荧光探针FITC-ConA染细菌胞外多糖、荧光显微镜下观察EDTA作用前后多糖差别,荧光探针SYT09／H标记生物膜内细菌、激光共聚焦显微镜观察结合BF图像结构分析软件（ISA）对EDTA作用前后的生物膜结构参数进行定量分析。结果当EDTA浓度为5MIC时达到对PA生物膜的最大杀菌效应,可使菌落数由10^7CFU／ml降至10^4CFU／ml,0．1MIC、5 MIC的EDTA均可增强环丙沙星对生物膜的杀菌作用,高浓度组效果更明显、使菌落数降至10^2CFU／ml。EDTA作用后荧光显微镜下可见多糖被破坏,明显减少。激光共聚焦显微镜下可见EDTA作用后生物膜死茵比例增加,菌落变稀疏。ISA软件分析结果显示：5MIC的EDTA作用后生物膜厚度（d）由（22．59±4．13）μm降至（8．97±2．45）μm,t=8．515,P〈0．05;AP（区域孔率）由0．89±0．07增加至0．97±0．02,t=-2．653,P〈0．05;ADD（平均扩散距离）由3．08±0．96降至1．59±0．24,t=4．510,P〈0．05;TE（结构熵）由6．25±0．79降至3．02±0．67,t=9．375,P〈0．05;0．1MIC的EDTA效果没有5MIC明显。结论EDTA可以破坏铜绿假单胞菌生物膜的结构,增强抗生素对生物膜杀菌活性。     

镁离子对黏液型铜绿假单胞菌生物膜形成过程的影响

目的探讨镁离子对黏液型铜绿假单胞菌早期黏附和生物膜形成过程的影响。方法荧光多功能酶标仪检测各组不同时间点96孔板底部黏附细菌的荧光强度,荧光探针FTTC-ConA染细菌胞外多糖（Extracellular Polymeric Substances,EPS）、荧光显微镜下观察各组多糖差别;SYTO9／PI染生物膜内细菌、激光共聚焦显微镜观察结合BF图像结构分析软件（Image Structor Analyzer,ISA）对各组生物膜结构参数进行定量分析。结果2d时,空白组和1mmol／L镁组的黏附细菌的荧光强度分别为1845．67±45．3和2254．78±42．45,t=-9．96,P〈0．05;0．1mmol／L的镁浓度下荧光强度也有增加,其余各时间组趋势与2d组相似;在荧光显微镜下观察可见随着镁浓度增加,EPS增多;激光共聚焦显微镜下可见随着镁浓度增加,生物膜活菌增加、菌落变密集;ISA软件分析结果示：空白组和1mmol／L镁组的6d生物膜厚度分别为（25．80±1．16）μm和（34．87±1．59）μm,t=-13．85,P〈0．05;区域孔率分别为0．96±0．05和0．90±0．04,t=2．48,P〈0．05;平均扩散距离分别为1．54±0．15和1．92±0．16,t=5．23,P〈0．05;结构熵分别为3．64±0．57和4．70±1．09,t=-2．6,P〈0．05,3d组生物膜也有相同的趋势。结论镁离子可以增强黏液型铜绿假单胞菌的早期黏附,影响随后生物膜的形成及结构。     

铜绿假单胞菌生物膜藻酸盐成分的致病作用

生物膜（biofilm,BF）是细菌在生长过程中,为适应生存环境而吸附于惰性或活性材料表面形成的一种与浮游细胞相对应的生长方式。由细菌和自身分泌的胞外基质组成。近年来,随着内置式医疗器材（如导尿管,气管插管,人工心脏瓣膜等）的广泛应用,临床上BF相关感染日益增多。研究发现,BF细菌群体耐药性极强（甚至可以达到其浮游状态的1000倍）,     

野生型铜绿假单胞菌和新型mucA突变铜绿假单胞菌生物膜形成的动态观察

目的观察新型mucA突变的粘液型菌株PA17和野生型菌株PAO1生物膜(biofilm,BF)形成的动态过程,并比较2株菌生物膜形成过程的差异。方法 SYTO9/PI荧光探针标记PAO1和PA17,体外建立1d,3d,5d,9d时间点PAO1及PA17的BF模型,激光共聚焦显微镜(CLSM)观察两株菌BF动态形成的过程。结果通过SYTO9/PI双染可以动态观察PAO1菌株和PA17菌株的BF形成过程;PAO1菌株和PA17菌株的BF形成过程有差异:PAO1菌株1d时已形成微菌落,3d时形成覆盖整个玻片的生物膜结构,而PA17菌株1d时仅有散在的不可逆粘附细菌,3d时才形成微菌落,5d时形成生物膜结构;随着时间的推移,2株菌生物膜形成的厚度均逐渐增加,且死菌的比例也逐渐增加。结论 PAO1和PA17BF的动态形成过程存在差异,而PA17与PAO1生物膜形成存在的差异可能与其mucA基因突变造成大量藻酸盐的产生有关。     

大蒜素对铜绿假单胞菌生物膜早期黏附及胞外多糖的影响

目的研究大蒜素对铜绿假单胞菌PA01菌株生物膜（biofilm,BF）早期黏附及胞外多糖复合物（Extracellular Polymeric Substances,EPS）的影响。方法利用荧光多功能酶标仪检测各组不同时间点96孔板中pGF-Puv转化PA01菌株的荧光强度,计算黏附率以表示干预对不同时间点细菌黏附的影响,利用荧光显微镜下定性观察细菌的黏附量;应用异硫氰酸标记的刀豆蛋白A（FITC conjugated concanavalin A,FITC-conA）特异性结合细菌EPS,荧光显微镜下定性观察各组EPS的变化;利用硫酸-苯酚法定量各组细菌EPS的产量。结果6h组,大蒜素高浓度干预后细菌的黏附率由0．70±0．03下降至0．50±0．01,t=15．014,P〈0．05,大蒜素低浓度干预后黏附率也有下降,但不及高浓度组明显;除了9h组其他时间组趋势与6h组大致相似,可能与大蒜素含量下降有关。荧光显微镜观察可见生理盐水对照组细菌菌落分布,干预组黏附的细菌稀疏散在分布,以高浓度为甚。FITC-conA可使胞外多糖显色,在荧光显微镜下观察可见大蒜素干预后EPS减少,稀薄;EPS定量实验,EPS总量大蒜素高浓度干预组（181．19±1．59）μg较生理盐水对照组（602．66±21．94）μg有明显降低,t=60．589,P〈0．05。结论大蒜素可显著减少PA01菌株黏附及产EPS的能力。     

铜绿假单胞菌生物膜和浮游菌的毒力表达差异

目的探究铜绿假单胞菌生物膜和浮游菌状态下毒力因子的表达差异。方法使用铜绿假单胞菌标准菌株PAO1,分别在生物膜(静置)和浮游菌(摇床)状态下培养,收集上清液,检测总蛋白酶、LasA和LasB弹性蛋白酶、鼠李糖脂、绿脓素、溶血活性;通过荧光定量PCR检测群体感应(quorum sensing, QS)系统相关基因的表达;同时,通过活菌计数检测PAO1在生物膜和浮游菌状态下的生长曲线。结果生物膜状态下,铜绿假单胞菌PAO1的总蛋白酶、LasA、LasB弹性蛋白酶、鼠李糖脂、绿脓素表达均增高(均P0.05),溶血活性增高(P0.05),生物膜和浮游菌状态下细菌生长曲线差异无统计学意义,QS相关基因rhlI、rhlR、rhlA、lasI、lasR、pqsA、pqsR表达增高(均P0.05)。结论铜绿假单胞菌PAO1在生物膜状态下毒力因子表达较浮游菌状态下增高。     

大蒜素对铜绿假单胞菌生物膜群体密度感应系统调控毒力因子表达的影响

目的通过体外测定铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）群体密度感应（Quorum Sensing,QS）系统调控的毒力因子表达,比较大蒜素干预前后毒性因子表达的差异以及对铜绿假单胞菌PAO1成熟生物膜（biofilm,BF）的影响。方法应用ELISA法比较处理前后外毒素A的含量差异;利用弹性蛋白一刚果红染色的方法,测定处理前后弹性蛋白酶活性;用蒽酮一硫酸法测定鼠李糖脂;利用荧光酶标仪检测青脓素含量变化;利用激光共聚焦显微镜观察干预前后大蒜素对铜绿假单胞菌成熟BF的影响。结果大蒜素干预后与生理盐水对照组比较,外毒素A、弹性蛋白酶、鼠李糖脂和青脓素表达分别由（19．630±0．573）pg/μl、（0．467±0．003）、（2．009±0．063）g／L、（9325．833±367．675）下降到（6．529±0．289）pg／μl、（0．032±0．001）、（0．269±0．009）g／L、（7819．167±111．800）。激光共聚焦显微镜观察可见生理盐水对照组细菌菌落云集呈蘑菇状分布,干预组黏附的细菌稀疏散在平坦分布。结论大蒜素可抑制铜绿假单胞菌群体密度感应系统调控的毒力因子表达,减弱其毒力,干扰BF分化成熟。     

铜绿假单胞菌生物被膜与宿主免疫的关系

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,P.aeruginosa)是一种常见的革兰阴性条件致病菌,能引起严重的院内感染,可从支气管扩张、肺囊性纤维化(CF)等患者体内分离。机体免疫系统可以通过识别不同的病原体相关分子模式(PAMPs)来抵御P.aeruginosa的感染,但P.aeruginosa生物被膜(BF)的形成可以导致这些成分被遮蔽从而引起免疫逃逸,导致疾病的迁延难愈。BF是一种与游离细菌相对立的生活方式,能帮助细菌有效适应外部环境,其可以通过藻酸盐的屏障作用,抵抗吞噬细胞的吞噬,干扰多核白细胞(PMNs)的激活,从而逃避宿主免疫。研究P.aeruginosa-BF的免疫逃逸机制,发现有效清除P.aeruginosa-BF的方法,从而为临床治疗P.aeruginosa引起的感染性疾病提供科学依据。现以P.aeruginosa为例对近年来国内外BF的免疫逃逸机制的研究进展进行综述。     

氨溴索对粘液型铜绿假单胞菌生物膜藻酸盐作用的体外研究

目的探讨氨溴索对铜绿假单胞菌临床分离株形成的生物膜（biofilm,BF）主要成分藻酸盐的干预作用,研究其对藻酸盐合成过程中起重要作用的基因表达和合成过程中限速酶活性的影响,以及其对藻酸盐降解的影响。方法建立铜绿似单胞菌临床分离株BF体外模型,培养7d后得到成熟BF。将BF内的细菌振荡下来后,用疏酸-苯酚法检测氨溴索对藻酸盐含量的影响;RT-PCR检测藻酸盐合成过程中重要基因algD、algU、algR和mucA的mRNA表达;分光光度计检测合成过程中限速酶——GDP-甘露糖脱氢酶（guanosine diphospho-D-mannose dehydrogenase,GMD）的活性,并检测藻酸盐的降解情况。结果在氨溴索3．75mg／ml作用下,藻酸盐含量（mg／g）由86．4024±0．8588下降到59．9199±0．5803（F=66．2,P〈0．01）;其合成重要基因algD、algU、algR和mucA的mRNA的表达分别由1．2994±0．0173、1．0488±0．0457、0．9888±0．0267和0．8731±0．0336变化为1．0253±0．0265、0．9594±0．0106、0．8536±0．0179和1．0770±0．0503（F=91．9,41．1,88．4和56,9,P均〈0．05）;其合成限速酶GMD活性由0．0989±0．0055下降到0．0558±0．0016（F=121．2,P〈0．01）;藻酸盐的降解量（△mg／g）由1．4122±0．0073变化为1．4175±0．0019（F=21．81,P〉0．05）。1．875mg／ml氨溴索作用下,有同样的趋势但效应不如高浓度明显。结论氨溴索可以降低铜绿假单胞菌BF藻酸盐的含量,影响藻酸盐合成过程中重要基因algD、algU、algR和mucA的mRNA的表达,降低藻酸盐合成限速酶GMD活性,但对藻酸盐的降解无影响。     

穿心莲内酯抗铜绿假单胞菌生物被膜及与阿奇霉素协同抗菌作用

目的研究穿心莲内酯抗铜绿假单胞菌生物被膜及与阿奇霉素协同抗菌作用。方法微量倍比稀释法测定穿心莲内酯对铜绿假单胞菌的最小抑菌浓度（MIC）,棋盘稀释法测定穿心莲内酯和阿奇霉素协同抗菌作用,MTT法测定穿心莲内酯对铜绿假单胞菌生物被膜的最小抑膜浓度（SMIC）,显微镜下观察药物对生物膜形态的影响。结果穿心莲内酯对铜绿假单胞菌的MIC 50μg/mL,和阿奇霉素有协同抗菌作用。穿心莲内酯对铜绿假单胞菌生物被膜的SMIC501天25μg/mL、3天25μg/mL、7天50μg/mL;SMIC801天50μg/mL、3天50μg/mL、7天100μg/mL,形态观察提示穿心莲内酯SMIC80浓度对铜绿假单胞菌生物被膜的抑制作用明显。结论穿心莲内酯具有抗铜绿假单胞菌生物被膜作用,对阿奇霉素也有协同抗菌作用。     

QS系统中LasR和RhlR蛋白对铜绿假单胞菌生物被膜形成的影响以及免疫原性研究

为探讨铜绿假单胞菌 PAO1 中 lasR 和 rhlR 基因表达产物的分子生物学特性,研究它们对铜绿假单胞菌生物被膜形成的影响以及对小鼠的免疫保护效果,采用聚合酶链式反应 (PCR) 方法扩增铜绿假单胞菌标准株 PAO1 中的 lasR 和 rhlR 基因,全自动荧光测序仪测序,并用 Blast 方法检测克隆片段. 利用 pGEX4T-1 载体分别构建 lasR/rhlR-pGEX4T-1 重组质粒,在大肠杆菌 BL21(DE3)中诱导表达,并经过免疫印迹实验验证其生物学活性. 用硅胶膜培养法建立生物被膜模型,诱导转入了pGFPuv 质粒的铜绿假单胞菌 PAG0305 形成生物被膜,并测定 LasR 蛋白和 RhlR 蛋白对生物被膜形成的影响. 同时用纯化的重组蛋白免疫小鼠,菌落计数法检测免疫组和对照组鼠肺对铜绿假单胞菌的清除率. 以 PAO1 染色体 DNA 为模板的 PCR 结果显示,lasR 的全基因序列为 720 bp,rhlR 基因序列为 726 bp,经序列分析和同源性比较分别与 GenBank 中 lasR/rhlR 基因(登录号:M59425; AE004768) 的同源性为 100%. 大肠杆菌 BL21 (DE3) 分别转化重组质粒 lasR/rhlR-pGEX4T-1 后,经 IPTG诱导和 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,表达的融合蛋白分子质量均为 54 ku 左右,与预期蛋白质分子质量相同. 荧光显微镜观察和测定结果表明,在硅胶膜上 PAG0305 能够形成典型的发荧光的生物被膜,LasR 或 RhlR 蛋白 (10 mg/L) 存在的情况下,PAG0305 生物被膜的形成速度在前三天比对照组平均提高 40.77%,而且两蛋白单独存在与同时存在时的作用相同. 体内实验中,免疫小鼠肺部对铜绿假单胞菌的清除率显著高于未经免疫的正常组 (P < 0.05). 上述结果表明:构建的lasR/rhlR-pGEX4T-1 重组质粒能够在大肠杆菌 BL21(DE3)中成功地表达并具有生物学活性. LasR/RhlR 蛋白在体外模型中能够加快铜绿假单胞菌生物被膜的形成速度,是调节铜绿假单胞菌生物被膜形成的重要因素之一. 免疫结果表明,重组蛋白对小鼠表现出一定的保护作用,这为进一步开展疫苗研究奠定了基础.     

Synergistic effects of heat and antibiotics on Pseudomonas aeruginosa biofilms

Upon formation of a biofilm, bacteria undergo several changes that prevent eradication with antimicrobials alone. Due to this resistance, the standard of care for infected medical implants is explantation of the infected implant and surrounding tissue, followed by eventual reimplantation of a replacement device. Recent studies have demonstrated the efficacy of heat shock for biofilm eradication. To minimize the heat required for in situ biofilm eradication, this study investigated the hypothesis that antibiotics, while ineffective by themselves, may substantially increase heat shock efficacy. The combined effect of heat and antibiotics on Pseudomonas aeruginosa biofilms was quantified via heat shock in combination with ciprofloxacin, tobramycin, or erythromycin at multiple concentrations. Combined treatments had synergistic effects for all antibiotics for heat shock conditions of 60°C for 5 min to 70°C for 1 min, indicating an alternative to surgical explantation.