在植物遗传工程中电的可能用途

<正> 有一种可望代替根癌土壤杆菌来转移外源 DNA 到植物细胞中的新媒介,那就是电。Bo-yce Thompson 研究所(Ithaca,纽约)的科研人员已经成功地使用高压电的瞬时脉冲把"裸露的"或游离的 DNA 转移到植物原生质体甚至可能到植物叶绿体中。据专家说,已经     

高等植物叶绿体的遗传转化

利用不同方法在两个大不相同的实验室里首次获得了高等植物细胞器的遗传转化.MaxPlanck细胞生物学研究所和Heidelberg大学的G.Weber及同事利用一紫外线激光微束把外源DNA组合到油菜叶绿体中.他们将携带敌菌灵抗性基因并用荧光染料标记的DNA注入油菜细胞的胞质中.然后用3毫微秒氮激光微束(接入一倒置显微镜的光径里)脉冲击穿细胞内的叶绿体.通过处理叶绿体的荧光性以及敌菌灵抗性在油菜细胞中的瞬时表达证实了DNA的摄取.处理细胞存活并再生成株.但是,在再生株里并未发现引入基因的表达.他们成功     

基因工程

<正> 用给体一受体原生质体融合技术研究了叶绿体和线粒体控制的性状在种间的转移。野生烟草或普通烟草白化系(V BW)用作受体原生质体,下一射线照射的花烟草、印度烟草和波状叶烟草原生质体用作细胞器给体。融合细胞经培养后再生成胞质杂种植株。     

向植物叶绿体导人基因成功

植物遗传工程的基本方法是向植物细胞核导入基因.最近,美国新泽西州Rutgers大学的Waksman研究所的Pal Maliga及其研究小组在植物叶绿体中导入外来基因获得成功.叶绿体是绿色植物细胞中的一种小的结构物,包括光合过程中把二氧化碳和水转换成碳水化合物的叶绿素.叶绿体是与植物细胞共存的光合成细菌进化而来的,有自己特有的DNA.由于开发了向叶绿体DNA导入外来基因的技术,就有可能开发抗除草剂植物和光合能力高的重组作物品种.     

植物细胞产生免疫球蛋白

Scripps Clinic研究所的M.B.Hein及其同事们用重组DNA方法将编码全长小鼠免疫球蛋白链的DNA引入到烟草植株中。他们发现由这些烟草植株的原生质体或细胞分泌的免疫球蛋白具有小鼠抗体的抗原结合活性和催化特性。Hein等还报导:除功能相同外,“植物(烟草)对其产生的抗体进行加工和分泌方式也与哺乳动物细胞的相同”。     

用单链DNA转化植物细胞

Rodenburg等最近报道,如果用电激法将DNA直接导入烟草原生质体,那么单链DNA(ssDNA)的稳定的转化频率将比双链DNA(dsDNA)高3～10倍.他们认为,ssDNA能比dsDNA高效地进入植物原生质体的核或整合到植物的基因组中. 但是,剑桥大学的I.J.Furner等分析了导入碧冬茄叶片原生质体中的ssDNA的暂时表达,认为直接导入的ssDNA在植物染色体外变成双链DNA,然后整合到核基因组中.他们发现,在有37%聚乙二醇6000存在时,通过孵育细胞而导人ssDNA和dsDNA,在暂时的和稳定的测定中它们的转化率相当.     

短讯三则

1.细胞质杂种植物法国农学研究所的 J.P.Bourgin 等人利用原生质体融合技术使取自一种烟草的一个核编码的性状与取自另一种烟草的一个细胞质性状结合,获得了细胞质杂种烟草。他们所用的材料是烟草的抗链霉素的突变株 SR_1以及抗缬氨酸的突变株 Val~r-2。链霉素抗性是一种细胞质性状,而缬氨酸抗性则是核编码的。Bourgin 小组使这两种突变株的原生质体融合,然后直接筛选出能够抗缬氨酸和链霉素的细胞群落,由这些细胞再生出了可育的双抗植株,并且链霉素和缬氨酸抗性通过种子传递到下一个有性世代。     

羟自由基诱导的烟草原生质体的凋亡:流式细胞法的新证据

用1.0 mmol/L FeSO4/0.5 mmol/L H202处理烟草(Nicotiana tabacum L.cultivar BY 2)原生质体,发现羟自由基能够诱导烟草原生质体的凋亡.具体表现为细胞核皱缩、DNA Ladder、TUNEL阳性反应等典型的凋亡特征.在动物细胞凋亡过程中,线粒体起着非常重要的作用,其中膜电位(△ψm)的变化以及由其引起的位于线粒体膜上的通透性孔(PTP)的开放与Cyt c的释放有关.另外,在动物凋亡细胞中,磷脂酰丝氨酸(phosphatidyl serine,PS)会从细胞膜内侧向外翻转.为了判断植物细胞凋亡过程中膜电位的变化情况以及PS的外翻程度,我们采用了流式细胞法.结果表明,随着处理时间的延长,烟草原生质体线粒体的膜电位逐渐降低;膜内PS大量外翻.说明由羟自由基和烟草原生质体组成的凋亡体系是一种可靠的凋亡组合,可以用来对植物细胞凋亡机理做进一步研究.     

体外培养和遗传育种

852368矮牵牛种间体细胞杂种叶绿体分离的分析〔会,英洲Kool,A.J.…了Plant Tis-sue Culture一1982,5 Meet一653~654[译自DBA,1984,3(16),54一07685) 将矮牵牛(Peru。‘a parodli)的叶肉原生质体与野生型矮牵牛(尸etunl’ah少brida)、矮牵牛(Perun‘a parviflora)的一种核白花突变体或矮牵牛(Petunia inflata)的一种细胞质白化苗突变体的悬浮培养细胞分离爵原生质体融合,产生体细胞杂种,从矮牵牛尸.parodl‘和尸.par。‘fl。。。的体细胞杂种的叶绿体DNA(CpDNA)用限制性内切酶Bgn酶切,酶切谱仅呈现出尸.Parod“叶绿体DNA的电泳图…     

紫外辐射诱导烟草原生质体中DNA损伤的彗星电泳检测

以烟草原生质体为材料,采用彗星电泳检测用0.5W·m^-2紫外线以不同时间（0、5、10、30、60和120s）诱导的烟草原生质体中DNA的损伤。结果表明,在0～10s的时间内代表DNA损伤程度的尾矩、Olive尾矩等参数与紫外线照射时间具有良好的时间依赖关系。本文建立的烟草原生质体体系采用彗星电泳技术,可以快速而灵敏地检测紫外线对植物细胞的损伤程度。     

两种瞬时表达体系研究拟南芥Profilin-1的亚细胞定位

使用两种瞬时表达方法研究Profilin-1(PRF1)的亚细胞定位,并比较了2种瞬时表达体系在亚细胞定位研究中的优缺点。利用拟南芥幼叶作为材料,提取叶片的RNA,采用特异性引物RT-PCR的方法克隆PRF1基因,连接到p CAMBIA1300-GFP的改造载体上,成功的构建p CAMBIA1300-GFP-PRF1的表达载体。然后分别利用PEG转化拟南芥原生质体、农杆菌浸染烟草叶片两种技术进行了瞬时表达,并在激光共聚焦显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)融合蛋白的表达。研究结果表明,将PRF1基因导入拟南芥的原生质体和烟草表皮细胞后,融合蛋白绿色荧光均能被观察到,PRF1基因与GFP融合蛋白的产物在烟草表皮细胞中主要定位在细胞质和外周细胞器中,在拟南芥的原生质体中的细胞核和细胞质中都有定位。两种不同的瞬时表达体系中PRF1蛋白的定位出现了不同,这可能与同源或异源表达的植物的特性相关。     

胡萝卜与川西獐牙菜不对称体细胞杂种的核/质基因组特征

胡萝卜(Daucus carota var.sativa)原生质体与经260μW/cm2紫外线照射的川西獐牙菜(Swertia mussotii)原生质体用PEG法诱导融合.对融合再生的克隆的5SrDNA间隔序列和RAPD分析结果得知,各再生克隆均存在双亲的核DNA及重组DNA.杂种的核基因组组成以胡萝卜(受体)为主,供体川西獐牙菜DNA谱带较少;UV照射剂量对体细胞杂种核基因组组成没有明显的影响.进一步对再生克隆叶绿体DNA的SSR分析表明,杂种细胞中双亲叶绿体基因组随机分离并发生重组.     

用Ti质粒DNA离体转化植物原生质体成功

基因工程包括把DNA引入寄主细胞,并和寄主基因组整合,以及外源基因在寄主中表达。这在植物细胞里尚未被证明。最近新西兰的几位科学家首次在植物细胞里证明了这一点。他们是用烟草原生质体为实验材料,用Ti质粒DNA进行转化取得成功的。可引起冠缨瘤病的根瘤农杆菌是一个把外源DNA引入植物中去的天然的实验体系。这种根瘤农杆菌能把     

用鱼抗冻蛋白生产抗霜冻植株

加拿大国立研究协会植物生物技术研究所的F.Georges等人开发了一种化学合成编码冬比目鱼抗冻蛋白基因的新方法.借助于电激法把合成基因引入玉米原生质体,并在此原生质体中得到表达,在无细胞提取液中明显地鉴定到该抗冻蛋白. 抗冻蛋白基因合成的第一步是:通过把抗冻蛋白基因引入冷冻敏感性植株里从而使植株产生抗霜冻性.作者认为,此合成方法可广泛地应用于化学合成基因.     

消除聚乙二醇的毒性

在制备体细胞杂种过程中,常用聚乙二醇(PEG)诱导植物原生质体融合。但是,使用这种化学试剂常常使融合细胞的活性较低。融合细胞活性的损失以及相应的体细胞杂种产生效率的降低一直被认为是由于PEG的毒性所造成的,而最近加拿大的研究人员高国楠和M.Saleem报告说,PEG本身对原生质体是无毒的。高和Saleem在对苜蓿(Medicago sativa)和光烟草(Nicotiana glauca)的叶肉原生质体以及大豆子叶原生质体所做的研究中发现,用一种混合床离子交换树脂脱去PEG中的     

黄瓜花叶病毒衣壳蛋白存在于被其侵染的烟草叶绿体中

用原生质体法制备出高纯度的完整叶绿体经SDS-PAGE电泳,银染后,发现黄瓜花叶病毒(CMV)侵染的烟草病叶叶绿体蛋白质图谱和健叶叶绿体相比,多出一条染色较弱的迁移率与CMV衣壳蛋白质相同的带,经Western转移,用CMV游离衣壳蛋白亚基抗血清进行斑点酶联(Immunoblot)检测,证明这条带就是CMV衣壳蛋白质。健康叶绿体中加入去掉叶绿体的病叶汁液而制备出的叶绿体中无CMV衣壳蛋白质,说明这不是在叶绿体提纯过程中得到的假象,即衣壳蛋白质存在于被CMV侵染的完整叶片叶绿体中。这个结果否认了以往报道的CMV衣壳蛋白质不存在于烟草叶绿体中的结论。另外还发现,叶绿体中的衣壳蛋白质浓度与叶片症状严重程度呈正相关。     

烟草质体分裂相关基因NtFtsZ1和NtFtsZ2对叶绿体分裂和形态的影响

质体作为植物细胞中一类重要的细胞器,控制其分裂的分子机制一直都不清楚.最近的研究表明,植物细胞中与原核细胞分裂基因ftsZ类似的同源基因控制着质体的分裂过程.通过正反义转化分析了两个烟草的ftsZ基因(NtFtsZ1和NtFtsZ2)在转基因烟草中的功能.二者的反义表达并未对转化烟草细胞中叶绿体的分裂和形态产生明显影响,但二者过表达转化植株中叶绿体的数目和形态都发生了明显的变化,在某些转化植株的叶肉细胞中甚至只有1～2个巨大的叶绿体存在.对不同转化植株的电镜观察和叶绿素含量分析认为,NtFtsZs基因可能对叶绿体的正常发育和功能没有影响,叶绿体形态的变化是对其数目减少的一种补偿.正反义转化植株中叶绿体的不同表型暗示高等植物中同一家族的ftsZ基因可能在控制质体分裂方面具有相同的功能.同时,过表达植株中叶绿体形态的变化被认为是高等植物FtsZ质体骨架功能的体现.     

羟自由基诱导的烟草原生质体的凋亡：流式细胞法的新证据

用1．0mmol/L FeSO4／0．5mmol／L H2O2处理烟草(Nicotiana tabacum L.,cultivar BY-2)原生质体,发现羟自由基能够诱导烟草原生质体的凋亡。具体表现为细胞核皱缩、DNA Ladder、TUNEL阳性反应等典型的凋亡特扯。在动物细胞调亡过程中,线粒体起着非常重要的作用,其中膜电位(ΔΨ10）的变化以及由其引起的位于线粒体膜上的通透性孔(PTP)的开放与Cyt c的释放有关。另外,在动物凋亡细胞中,磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine,PS)会从细胞膜内侧向外翻转。为了判断植物细胞凋亡过程中膜电位的变化情况以及PS的外翻程皮,我们采用了流式细胞法。结果表明,随着处理时间的延长,烟草原生质体线粒体的膜电位逐渐降低;膜内PS大量外翻。说明由羟自由基和烟草原生质体组成的凋亡体系是一种可靠的凋亡组合,可以用来对植物细胞凋亡机理做进一步研究。     

美科学家将外源基因导入叶绿体

美国纽约州华斯曼研究所的科学家通过基因工程,已将外源遗传物质导入植物的叶绿体,并使这种外源DNA稳定地整合于其后代的叶绿体。上述研究是基因工程上的突破。它可使科学家有可能操纵涉及光合作用的基因,阐明光合作用的某些最基本的过程,从而进一步改造植物和改良农作物品种。这些科学家以烟草N.tabacum SPC2为试材。这种烟草的质粒pZS148(9.6千碱基)含有可编码壮观霉素抗性突变的DNA片段。用这种DNA包衣的钨粒子轰击烟草植株的叶组织。然后通过叶组织培养的壮观霉素抗性     

异胡豆苷合成酶在烟草亚细胞区室的表达

异胡豆苷合成酶(strictosidine synthase,STR)是吲哚生物碱生物合成的一种关键酶,将色胺(tryptamine)和裂环马钱子(secologanin)耦合成为吲哚生物碱的前体化合物异胡豆苷.将异胡豆苷合成酶标定在烟草植物不同的亚细胞区室--叶绿体、液泡和内质网中表达,通过蛋白免疫印迹分析和STR酶活性的测定,表明STR在叶绿体、液泡和内质网中有效表达.STR体外酶活性分析采用间接荧光法检测色胺在反应体系的消耗.STR的酶活性分析表明了STR在烟草中不同的亚细胞区室得以活性表达.分离纯化转基因烟草的叶绿体,通过对其分离的不同部分的蛋白免疫印迹分析,确定了将STR正确标定在烟草的叶绿体中表达.