拟南芥和水稻非特异脂质转运蛋白的分子进化、表达模式以及在花药发育中的功能分析

植物非特异脂质转运蛋白(non-specific lipid transfer proteins,ns LTPs)是一类小分子碱性蛋白,该蛋白家族在植物的角质蜡质形成、信号转导以及生殖发育等方面发挥了重要的功能。目前植物中已经克隆出几十个ns LTPs基因并对它们开展了初步的功能研究,但对该基因家族在拟南芥和水稻中的基本信息、分子进化、表达模式和功能预测方面进行系统对比的数据仍很欠缺。本研究尝试利用生物信息学的方法,通过对比分析45个拟南芥和49个水稻ns LTPs基因的亚家族分类、基因复制、蛋白结构、表达模式和功能预测等信息,初步阐明ns LTPs基因家族在单双子叶中可能存在的进化、表达模式和功能上的差异。同时以花药发育过程为例,细致分析了ns LTPs不同亚家族基因在花药发育过程中表达水平的变化,从而推测各个亚家族蛋白在花药发育不同时期的功能。本研究以期为ns LTPs将来在植物育种和遗传学中的应用研究提供理论基础。     

异源表达CiRS基因拟南芥的黄酮代谢及抑菌能力研究

白藜芦醇合成酶(resveratrol synthase,RS)是查耳酮合酶基因家族的一个重要酶,在植物体内催化白藜芦醇的生成。白藜芦醇是植物产生的一种非黄酮多酚类代谢产物,是植物在受到生物和非生物胁迫时产生的植物抗毒素,已证实具有多种生理活性。从转录组数据库中筛选获得注释为CHS基因的CDS序列,以中间锦鸡儿cDNA为模板,克隆得到基因全长。序列分析、系统进化分析和转该基因拟南芥研究结果表明,该基因为RS基因,因此将其命名为CiRS(GenBank登录号MF678590)。qRT-PCR检测分析发现,中间锦鸡儿CiRS基因的表达受到干旱、NaCl、紫外线等胁迫诱导。异源表达CiRS基因抑制了拟南芥自身At CHS基因的表达。同时转CiRS基因拟南芥的抑菌活性强于野生型。这些结果均证实了中间锦鸡儿CiRS基因在转基因拟南芥中发挥了相应的功能。     

紫花针茅WRKY53基因的克隆、序列分析及功能鉴定

植物WRKY转录因子家族在叶片衰老中起着重要的调节作用,其成员WRKY53基因与叶片衰老密切相关。本文利用紫花针茅(Stipa purpurea Griseb.)的一条EST序列,克隆获得Sp WRKY53基因的全长CDS序列,其开放阅读框为1443 bp,编码480个氨基酸,蛋白质分子量为50.9 k D,理论等电点为7.64。序列比对结果和系统进化分析表明,Sp WRKY53基因有2个WRKY序列,与已报道的小麦(Triticum aestivem L.)的WRKY53基因结构相似。亚细胞定位结果显示该蛋白定位于细胞核上。紫花针茅WRKY53基因的过表达以及表达分析表明,该基因能够加速植物叶片衰老并在多种非生物胁迫下上调表达。本研究为WRKY53基因在牧草分子育种中的进一步研究奠定了基础。     

番茄COBRA基因克隆、表达模式及生物信息学分析

COBRA作为一种重要的胞外糖基磷脂酰肌醇(GP-I)锚定蛋白,影响植物细胞壁中纤维素含量及细胞的定向伸长。目前已有多个拟南芥、玉米及水稻的COBRA基因的突变体被研究。而有关番茄COBRA基因克隆的研究尚未见报道。本研究利用RT-PCR技术克隆了一个假定编码番茄COBRA蛋白的SlCOBRA基因,并在GenBank注册(JN398667)。序列测定和分析表明,该序列由6个外显子组成,编码444个氨基酸残基;氨基酸序列中存在COBRA蛋白的CCVS保守基序,N端的跨膜信号肽及C-末端的疏水性尾部和GPI锚定ω-位点。系统进化分析表明番茄SlCOBRA与拟南芥AtCOB具有80%氨基酸序列同源性,聚在一个分支上。Real-time PCR分析番茄各个组织中COBRA基因的表达结果表明番茄COBRA为组成型表达,在营养器官(根、茎、叶)中的表达量高于花和果实,尤其在成熟的果实中(从转色期到红熟期)表达量明显减少。     

川滇高山栎QaGDU3基因的克隆及遗传转化

以川滇高山栎(Quercus aquifolioides Rehd. et Wils.)叶片为材料,分别采用不依赖于连接反应的克隆法、农杆菌花序侵染、实时荧光定量PCR、图像分析等方法克隆了QaGDU3基因,获得QaGDU3转基因拟南芥(Arabidopsis thaliana(L.)Heynh.)并分析转基因植物的表型变化,利用生物信息学对QaGDU3蛋白与其他物种的GDU3蛋白序列间的差异和进化关系进行了分析。结果显示,GDU3是种子植物特有的基因;QaGDU3属于阴离子渗透酶ArsB/NhaD超家族成员,可能具有氨基酸转运功能。QaGDU3基因在拟南芥中过表达能够激活水杨酸(SA)途径中AtPR1、AtACD6、AtCBP60g和AtPAD4基因的表达,且转基因拟南芥莲座大小随着QaGDU3基因表达量升高而变小。研究结果说明GDU3是种子植物所特有的氨基酸转运蛋白并参与植物生长发育的调控。     

桑树磷脂酶MaPLA1-2D亚型4个基因的克隆与胁迫应答分析

磷脂酶(phospholipase)是一类在植物生长发育和胁迫应答中起重要调控作用的磷脂水解酶,也是一类重要的信号转导酶。而磷脂酶A1(PLA1)在植物应答生物胁迫和非生物胁迫中的功能研究鲜见报道。研究从桑树(Morus alba L.)中克隆了磷脂酶PLA1的1个亚型MaPLA1-2D基因,对其进行了序列分析、组织表达、胁迫诱导表达和蛋白亚细胞定位分析。结果表明,桑树PLA1-2D亚型基因包括4个成员,命名为MaPLA1-2D.1~MaPLA1-2D.4。4个基因在桑树根和叶中高水平表达,蛋白亚细胞定位在叶绿体。序列和进化分析表明MaPLA1-2D基因4个成员与拟南芥AtDAD1基因的保守结构域序列具有较高相似度且进化关系紧密。MaPLA1-2D基因4个成员的启动子含有多种胁迫应答顺式元件和激素响应元件;胁迫诱导表达模式分析表明MaPLA1-2D基因表达受干旱和脱落酸处理显著诱导。以上结果说明,MaPLA1-2D基因与拟南芥DAD同源,可能在桑树非生物胁迫应答中发挥重要功能。     

辣椒CaPI的克隆与功能分析

【目的】PISTILLATA(PI)基因属于典型的Type II型MADS-box基因家族成员,是ABC(D)E模型中的B类基因,在植物发育过程中起着重要作用,但辣椒PI同源基因功能研究未见报道。探索辣椒PI基因功能,为深入研究植物PI同源基因的功能机制奠定基础。【方法】利用RT-PCR的方法从一年生辣椒（Capsicum annuum L.）花器官的cDNA中克隆PI同源基因CaPI,并通过生物信息学方法分析其理化性质、亚细胞定位、蛋白结构和系统进化关系;利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术分析基因在辣椒不同组织中的表达特征;构建植物过表达载体35S:CaPI,通过floral-dipping法转化拟南芥。【结果】该基因开放阅读框648 bp,编码215个氨基酸,相对分子质量为25.13 kD。氨基酸多重序列比对表明,CaPI蛋白N端含有“MGRGKIEIKRIEN”保守基序。系统进化树分析证实,CaPI与马铃薯、番茄和矮牵牛的PI同源基因亲缘关系较近。RT-qPCR证实CaPI主要在花中表达,在花萼中表达量最高,其次是花瓣,在雄蕊中低表达,而在雌蕊中几乎不表达。在拟南芥中过...     

天冬氨酸蛋白酶在拟南芥和水稻中的分子进化、表达模式以及在花药发育中的功能分析

天冬氨酸蛋白酶(aspartic proteases,APs)是一类功能多样化的酶,参与了植物大部分生理和发育过程,但其基因家族在植物中的系统分类、分子进化以及功能方面研究仍很欠缺。本研究收集整理了拟南芥和水稻中APs基因序列、分类、基因结构和染色体定位等信息,对比分析该基因家族在拟南芥和水稻中分子进化方面的差异;利用转录组数据阐明该家族基因在不同组织部位和不同发育时期的表达差异和功能分化。此外,本文还围绕花药发育的过程,细致分析了各亚家族APs基因的表达变化,推测APs在花药发育过程中的可能功能。     

菲油果LEAFY基因的表达模式及启动子克隆

LEAFY(简称LFY)是植物花分生组织特征基因,在植物由营养生长向生殖生长转变过程中起着重要作用,是启动开花的枢纽。菲油果是一种新兴的果树资源,为研究菲油果LFY基因(FsLFY)的表达调控规律,本研究通过实时荧光定量PCR技术研究了FsLFY基因的时空表达模式,并通过染色体步移技术克隆了该基因的启动子序列。荧光定量PCR结果表明,FsLFY基因在菲油果花蕾不同发育阶段以及其他组织器官中均有表达。在花蕾中,小蕾期最高,中蕾期最低;组织器官中,营养枝茎段最高,花瓣最低。FsLFY基因启动子序列长度为2436 bp(GenBank登录号:KF766536),运用PLACE、PlantCARE等在线软件对其序列进行顺式作用元件分析,结果显示该序列不仅含有CAAT-box、TATA-box等核心启动子元件,而且还具有响应水分、光、赤霉素(GA)以及其他功能未知的顺式调控元件,表明FsLFY基因的表达受多种外界环境条件的调控。本研究为阐明菲油果的开花机理,以及通过分子育种手段使菲油果早花早果奠定了理论基础。     

水稻与拟南芥跨膜蛋白14家族的分子进化特征与功能分析

脂类既是植物生命活动重要的能量来源,也是细胞膜系统不可或缺的结构成分,在植物生长发育和逆境反应等生命活动过程中都起到至关重要的作用。随着脂类代谢研究的不断深入,植物脂类合成通路已渐渐明晰,其中连通不同细胞器间脂类合成中间物质运送的膜蛋白也正被不断发现,但对质体脂类转运蛋白还鲜有报道。跨膜蛋白14家族(Transmembrane 14 family, Tmemb14 family)是一个新发现的跨膜蛋白家族,目前只有拟南芥FAX1 (Fatty Acid Export 1)和斑马鱼TMEM14已被克隆鉴定,该家族其他成员的生物学功能还未见报道。AtFAX1参与植物质体长链脂肪酸的跨膜外运,其功能丧失显著降低植物生物量并影响花粉发育和育性。本研究通过生物信息手段对拟南芥和水稻中的跨膜蛋白14家族成员的进化关系、蛋白理化性质、结构域功能和编码基因的表达模式进行了分析,揭示了Tmemb14家族成员在单、双子叶植物进化中的功能分化,为进一步研究跨膜蛋白14家族成员的生理功能提供了理论依据。     

植物GH3基因家族的生物信息学分析

植物生长素在植物的生长发育过程中至关重要,GH3基因家族是植物生长素早期应答的成员。本研究采用比较基因组学的方法,利用已经分离的拟南芥GH3(Gretchen Hagen3)蛋白为检索序列,在全基因组水平上搜索拟南芥、水稻、葡萄、白杨和苜蓿的GH3基因的同源序列。最终确定了59个GH3候选基因,其中拟南芥19个,水稻14个,葡萄9个,白杨14个,苜蓿3个。对同源序列作进一步的多序列联配、MEME、ESTs和系统发生表达分析,结果表明:GH3基因家族的基本特征在单双子叶植物分离之前就已经形成;GH3结构域在蛋白质间较保守,可以分为3个亚家族,其中个别蛋白发生了基序丢失;59个同源蛋白中的40个成员找到了ESTs的证据,且表达部位多样,不同成员之间的表达部位存在差异。该研究结果将为植物的GH3基因家族的研究提供参考。     

拟南芥AtVQ29基因的克隆与植物表达载体构建

目的:VQ模序蛋白是植物中所特有的一类具有高度保守序列的蛋白质,广泛参与植物的生长发育与逆境反应,本研究拟克隆拟南芥的AtVQ29基因并进一步构建由组成型启动子CaMV 35S驱动的植物表达载体pSN1301-AtVQ29。方法:采用CTAB法提取拟南芥基因组DNA,根据已报道的AtVQ29基因序列设计并合成引物,通过PCR技术扩增获得拟南芥AtVQ29基因,经T载体克隆后测序。利用生物信息学软件对序列进行初步分析,同时基于基因重组技术构建植物表达载体。结果:序列分析表明已成功克隆AtVQ29基因,该基因编码区全长为372bp,共编码123个氨基酸残基,具有保守的VQ模序。并进一步构建了由组成型启动子CaMV 35S驱动的AtVQ29基因植物表达载体pSN1301-AtVQ29。结论:本研究所构建的AtVQ29基因植物表达载体能够在转基因植株中过量表达AtVQ29基因,为后期开展基因功能研究与植物基因改良奠定了基础。     

基于HMM的齿肋赤藓VOZ转录因子的预测与分析

VOZ(Vascular plant One Zinc finger protein)作为与植物的进化与发育密切相关的基因,在极端耐旱荒漠苔藓植物齿肋赤藓(Syntrichia caninervis)中对VOZ基因进行挖掘和分析有利于更好的揭示VOZ基因的进化关系,且可作为抗逆基因进行更为深入的分子生物学研究。在VOZ转录因子蛋白中VOZ-domain是一个保守的DNA结合结构功能域,利用VOZ-domain多序列联配构建隐马尔可夫模型序列谱能够很好的进行家族成员的识别和预测。利用拟南芥、小立碗藓和水稻等植物已知的转录因子序列信息构建HMM序列谱模型,对荒漠苔藓齿肋赤藓转录组进行比对搜索。最终得到一条新的齿肋赤藓VOZ转录因子ScVOZ1(NCBI/EBI检索号:HG764415),序列长度为1 495 bp,具有完整的VOZ-domain结构域。生物信息学分析表明其具有转录调控功能和核定位潜能。多序列比对、进化和保守基序分析表明,ScVOZ1蛋白序列与小立碗藓VOZ家族和拟南芥AtVOZ1相似度较高。本研究为进一步研究ScVOZ1基因的功能以及其进化起源奠定了基础。     

番茄WOX转录因子家族的鉴定及其进化、表达分析

WUSCHEL相关的同源异型盒(WUSCHEL-related homeobox,WOX)是一类植物特异的转录因子家族,具有调控植物干细胞分裂分化动态平衡等重要功能。本研究利用番茄(Solanum lycopersicum)基因组数据,通过建立隐马尔科夫模型并进行检索,鉴定了番茄10个WOX转录因子家族成员。多序列比对发现,番茄WOX转录因子家族成员具有高度保守的同源异型结构域;以拟南芥WOX转录因子家族成员序列为参照,通过邻接法、极大似然法、贝叶斯法重建了系统发育树,三者呈现出类似的拓扑结构,番茄和拟南芥WOX转录因子家族共25个成员被分为3个进化支(Clade)和9个亚家族(Subgroup);利用MEME和GSDS对WOX转录因子家族成员的蛋白保守结构域和基因结构进行了分析,同一亚家族内的WOX转录因子家族成员的保守结构域的种类、组织形式以及基因结构具有高度的一致性;利用Perl和Orthomcl对家族成员的染色体定位和同源性关系进行分析,结果表明串联重复的SlWOX3a和SlWOX3b可能来源于一次复制事件;利用番茄转录组数据和qRT-PCR进行表达分析,结果显示家族成员在不同组织中的表达存在差异,暗示了WOX家族的不同成员在功能上可能具有多样性。本研究对番茄WOX转录因子家族成员进行GO(Gene Ontology)注释和比较分析,结果表明该家族成员作为转录因子,可能在组织器官发育、细胞间通讯等过程中发挥作用。     

普通小麦中一氧化氮相关因子(TaNOA)编码基因的克隆和分子生物学分析

一氧化氮是动植物体内重要的信号分子。本研究利用同源克隆技术从六倍体普通小麦中获得一个一氧化氮相关因子(TaNOA)编码基因的全长基因组和cDNA克隆。该基因具有13个外显子和12个内含子,与拟南芥以及水稻中同源基因结构相似。根据cDNA推导的氨基酸序列与拟南芥AtNOA1的序列一致性达60%以上,具备P-环GTPaseG4-G5-G1-G2-G3的排列特征和保守的序列。对其中2个内含子的测序分析表明在六倍体小麦中TaNOA至少有3个成员。进一步用中国春小麦缺体-四体材料将这3个TaNOA基因成员分别定位在第六同源群的6A、6B和6D染色体上,本研究中获得的成员定位于6B染色体上,因此将其命名为TaNOA-B1。原生质体表达实验表明,TaNOA-B1可能定位在线粒体中。TaNOA基因在小麦根、叶片中表达较高,在幼穗和小花中有少量表达,茎中几乎检测不到表达。TaNOA的转录本水平还因脱落酸或盐处理而上升,表明它可能参与小麦对非生物胁迫的反应。本研究为进一步克隆六倍体小麦中TaNOA的其他成员及研究该基因在小麦中的功能奠定了基础。     

柠条锦鸡儿CkPHB基因调控木质部发育增强植物抗旱性的功能分析

为了深入揭示柠条锦鸡儿(Caragana korshinskii)亮氨酸拉链蛋白转录因子(HD-ZIP Ⅲ)家族成员CkPHB的功能及其逆境响应,该研究参照转录组序列设计引物克隆得到CkPHB基因序列,并对其进行了一系列生物信息学分析,通过免疫组织化学染色方法对CkPHB蛋白在柠条锦鸡儿叶片中的组织定位进行观察,同时将克隆得到的CkPHB基因经农杆菌介导转化并筛选出阳性过表达拟南芥植株进行功能验证。结果表明:(1)成功克隆得到了柠条锦鸡儿中HD-ZIPⅢ家族成员CkPHB基因,其全长序列1 170 bp; CkPHB蛋白由389个氨基酸组成,分子量为42.83 kD,其编码的蛋白为疏水性蛋白,二级结构主要由α-螺旋组成。(2)免疫组织化学分析显示,CkPHB蛋白定位于柠条锦鸡儿叶脉维管束中木质部区域。(3)经遗传转化筛选鉴定,最终获得了转柠条锦鸡儿CkPHB基因拟南芥过表达株系(CkPHB-OE)T_3代植株3株;解剖结构比较发现,与野生型拟南芥(WT)相比,拟南芥CkPHB-OE株系的叶脉更为发达、维管束体积增大、木质部导管数量增加;实时定量PCR分析结果显示,拟南芥CkPHB-OE株系中与木质部发育相关的5个基因(XCP2、CesA7、CesA8、PAL4、F5H)较WT均显著上调表达。(4)抗旱性实验结果显示,拟南芥CkPHB-OE株系在干旱条件下存活率显著提升,生理指标的测定进一步支持上述结果,表明CkPHB过表达显著增强了转基因拟南芥的抗旱性。研究认为,过表达柠条锦鸡儿CkPHB基因的拟南芥输导组织更加发达、抗性生理指标显著提高,从而使抗旱能力增强,证明CkPHB基因在促进叶脉发育提高植物抗旱性中发挥重要作用。该研究结果为进一步研究柠条锦鸡儿CkPHB基因的干旱应答机制奠定了基础。     

Col生态型拟南芥AP3基因启动子克隆及植物表达载体构建

隶属于MADS-Box基因家族的拟南芥花器官B类特征基因APETALA3 (AP3)在花瓣和雄蕊中特异性地表达;AP3基因编码转录因子,与A类和C类特征基因协同作用控制双子叶植物花瓣和雄蕊的发育.研究表明AP3基因启动子为花特异表达启动子.因此,AP3基因启动子的克隆及功能鉴定对于园林植物与花相关的商业性状的定向改良具有重要作用.本文根据GenBank数据库报道的Ler生态型拟南芥(Arabido-psis thaliana) AP3基因启动子序列(U30729)设计了一对特异性扩增引物,基于PCR技术,用高保真的KOD-plus DNA聚合酶扩增了长度为1 767 bp的Col生态型拟南芥AP3基因启动子,并命名为pAtAP3,其GenBank登录号为FJ619533.Bl2seq在线分析表明pAtAP3与U30729序列的相似性达98%,与Col生态型拟南芥BAC克隆T12E18 (AL132971) 9 264～11 030之间的碱基序列相似性达100%,且该段序列的下游基因编码AP3蛋白(CAB81799),说明克隆序列为Col生态型拟南芥AP3基因的启动子.PLACE在线分析表明pAtAP3具有基本的启动子元件TATA-box和CAAT-box,还包含大量与花特异表达相关的顺式元件CArG1、CArG2、CArG3和anther-box等.本试验进一步构建了植物表达载体pAtAP3::GUS,为该启动子的功能鉴定奠定了基础.     

植物HSP70蛋白家族分子进化特征及其表达模式分析

植物热激蛋白HSP70(heat shock protein 70)与植物抗逆性具有密切的关系,对其深入研究将有助于揭示植物的抗逆生理过程,从而为生产上降低逆境对植物的伤害提供重要的实践指导意义。目前,在模式植物拟南芥和水稻中,HSP70蛋白家族的遗传学和生化功能研究被广泛关注,但该基因家族植物中的系统分子进化、表达模式以及功能预测方面的研究仍不完善。本研究通过收集和整理拟南芥和水稻中所有的HSP70基因序列、基因结构和染色体定位等信息,对比分析了拟南芥和水稻中HSP70家族在分子进化方面的差异;同时,从转录水平上初步分析和阐明该家族基因在植物不同组织部位和不同发育时期的表达差异和功能分化。此外,本研究还围绕花药发育的过程,细致分析了HSP70家族基因的表达变化,推测该家族在花药不同时期可能所扮演的角色。本研究为全面理解HSP70家族在单子叶和双子叶植物中的功能异同分化、以及其参与植物生殖发育过程的功能研究提供重要的科学依据。     

新疆无苞芥锌指蛋白基因的克隆及表达分析

利用同源克隆法从新疆无苞芥中克隆获得1个锌指蛋白基因(OpZFP)。序列分析表明,OpZFP基因的开放阅读框为684bp,推测编码含227个氨基酸的蛋白质。生物信息学分析显示,OpZFP蛋白含有1个典型的C2H2型锌指结构,在C端含有一个可能具有转录抑制功能的EAR结构域。系统进化树分析表明OpZFP编码产物与拟南芥AtZFP1、琴叶拟南芥AlZFP1的进化关系较近。分离了OpZFP基因2 095bp的启动子序列,发现该启动子与拟南芥AtZFP1基因的启动子序列只有84.4%的相似性,启动子分析表明二者存在多处不同的顺式作用元件。半定量RT-PCR分析表明,OpZFP在根、茎、叶、花和果荚中均有表达,在根中的表达量最高。OpZFP基因受高盐、干旱和低温等胁迫的诱导表达,表明该蛋白涉及多种胁迫相关的信号传导途径。     

青花菜ProDH基因的克隆及功能鉴定

脯氨酸是水分胁迫植物中最常见的渗透保护物质之一,脯氨酸脱氢酶(ProDH)是存在于线粒体内的催化脯氨酸降解的关键酶,构建RNAi表达载体转化青花菜可以抑制脯氨酸分解提高其抵抗干旱胁迫和盐胁迫的能力。本研究利用同源重组和RACE技术克隆青花菜脯氨酸脱氢酶基因(ProDH),以酶切、连接的方法利用载体pFGC1008构建植物RNAi表达载体pFGC-PDHi。序列分析表明,本文首次克隆了1595bp的青花菜脯氨酸脱氢酶基因cDNA全长,该序列编码498个氨基酸;序列比对发现该核酸序列与拟南芥、甘蓝型油菜、芜菁分别有83.26%、89.07%和97.73%的同源性,其氨基酸序列和拟南芥、甘蓝型油菜、芜菁分别有89.78%、91.38%和98.80%的同源性。测序和酶切鉴定表明青花菜ProDH基因RNA干扰表达载体已经构建成功,并将其转化青花菜得到转化株,经PCR检测,转化株均为阳性株,证明干扰载体的T-DNA区已经成功地整合到了青花菜基因组中。研究还发现在外源的L-脯氨酸存在时,转化株的脯氨酸脱氢酶的活性受到了明显的抑制。本研究为青花菜的抗旱育种提供了非常有价值的新种质材料。