耻垢分枝杆菌中一个TetR家族转录因子负调控异烟肼的敏感性

[目的] 研究TetR家族转录因子Ms0606对耻垢分枝杆菌耐药性的调控作用。[方法] 首先,通过测定生长曲线检测Ms0606在分枝杆菌耐药性中的调控作用;通过凝胶迁移阻滞实验和DNase I足迹法鉴定转录因子Ms0606识别的保守序列,进而探究其潜在的靶基因;其次,利用逆转录-qPCR和β-半乳糖苷酶活性实验检测Ms0606对靶基因Ms0608的调控作用,进一步探讨Ms0606调控分枝杆菌耐药性的分子机制。[结果] 与野生型菌株相比,Ms0606超表达菌株对异烟肼表现为敏感,Ms0606敲除菌株对异烟肼表现为抗性;Ms0606可以识别其自身操纵子上游区域内保守的22 bp回文序列,利用回文序列搜索耻垢分枝杆菌的基因组,发现Ms0606可能调控5个潜在靶基因;逆转录-qPCR和β-半乳糖苷酶活性实验显示Ms0606作为抑制子负调控Ms0608的表达,这可能会影响分枝杆菌对药物的耐药性。[结论] 鉴定了一种新的由Ms0606编码的耻垢分枝杆菌的TetR家族转录调控因子,该因子可调节分枝杆菌对异烟肼的敏感性,并进一步探讨其对靶基因的调控功能及对分枝杆菌耐药性的调控机制。     

转录因子FboR调控耻垢分枝杆菌抗氧化生长的机制研究

结核病的致病菌结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)在宿主内面临着多种氧化胁迫环境因子的压力,因而进化形成了一系列自己的抗氧化生长机制。转录因子作为细菌快速响应外界环境的重要因子,通过调控其靶基因的表达来帮助细菌适应环境胁迫如抗氧化等。然而,目前分枝杆菌(Mycobacterium)中有关转录因子调控细菌抗氧化生长的分子机制还不是十分清楚。本研究以耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)作为模式菌株,发现了转录因子FboR调控分枝杆菌的抗氧化能力并检测了相关重组菌株的抗氧化生长情况,证实了FboR负调控细菌的抗氧化能力。随后通过转录组测序分析、凝胶阻滞实验(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)、实时定量PCR(real-time quantitative PCR, RT-qPCR)和β-半乳糖苷酶活性检测鉴定了影响细菌抗氧化生长的相关靶基因,成功解析了具体的调控通路与分子机制。     

选择性σ因子SigF影响耻垢分枝杆菌的抗氧化能力

[目的]σ因子是细菌RNA聚合酶全酶的重要组分,包括必须σ因子和选择性σ因子.SigF作为重要的选择性σ因子影响结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的致病性和毒力等重要的功能.与之对应的在非致病性、快速生长的分枝杆菌耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)中,sigF的调控可能与其适应一定的生理环境相关.[方法]通过基因敲除、遗传互补和抗药性分析,系统的研究了耻垢分枝杆菌SigF的应答调控.[结果]sigF敲除菌株与野生菌相比,对过氧化氢特别敏感,并且这种敏感性能够通过反式互补野生型的基因得到回复 ;由于细菌体内的抗氧化能力与耐药性有较高的相关性,进一步分析sigF敲除菌株的抗药性和抗氧化相关基因的表达情况,显示SigF影响细菌清除过氧化氢的能力,但是并不影响包括异烟肼等药物的敏感性及与异烟肼敏感性相关基因的表达.[结论]SigF调控的活性氧胁迫应答途径与异烟肼活化的氧化胁迫应答途径不同.另外,实验显示SigF参与了耻垢分枝杆菌的色素的合成,提示SigF参与的是光氧化胁迫应答途径,与药物引起的氧化胁迫应答途径是不同的通路.     

耻垢分枝杆菌MSMEG＿4259的基因组维护功能研究

MSMEG＿4259基因及其同源基因广泛存在于分枝杆菌属中。蛋白序列分析显示,MSMEG＿4259包含DEDDh核酸外切酶结构域以及一个类似UvrC的核酸内切酶结构域,提示其可能参与DNA修复。为了探究MSMEG＿4259的生理功能,本研究利用同源重组方法在耻垢分枝杆菌(Mycolicibacterium smegmatis)构建了MSMEG＿4259基因敲除(ΔMs4259)菌株,并采用波动试验测定菌株在对数生长期以及H₂O₂处理后的利福平耐药突变频率。结果显示,ΔMs4259菌株的利福平耐药自发突变频率较野生型菌株升高1.9倍(P<0.05),该表型能够通过表达MSMEG＿4259回补。测定耐药突变菌株rpoB基因的耐药决定区域序列,发现ΔMs4259菌株的A:T>C:G突变概率较野生型菌株上升约10倍,有研究证明该突变谱是DNA氧化损伤的常见突变。实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction, qRT-PCR)结果显示,野...     

苹果树腐烂病菌细胞色素P450基因Vmcyp5的功能

【目的】研究表明,细胞色素P450(CYP)在死体营养型真菌的毒素合成代谢中发挥重要作用,预测可能与病原菌致病相关。论文对苹果树腐烂病菌(Valsa mali)毒素合成基因簇中的1个上调表达的CYP基因Vmcyp5进行生物学功能研究,明确CYP基因对病原菌致病力影响,为细胞色素P450基因家族对苹果树腐烂病菌致病机理的进一步研究提供依据。【方法】通过Double-joint PCR和PEG介导的原生质体转化技术获得具有G418抗性的突变体,并对突变体进行PCR检测及Southern blotting验证得到单拷贝敲除突变体。将目的基因片段重新导入敲除突变体,筛选获得互补突变体。最终对野生型菌株及敲除突变体、互补突变体进行菌落、产孢及致病力观察,利用SPSS软件对数据进行差异显著性分析,并利用q RT-PCR技术分析突变体黑色素基因簇的表达水平。【结果】通过基因敲除技术获得1个Vmcyp5基因的敲除突变体。与野生型菌株相比,Vmcyp5基因的敲除突变体菌落呈白色,产孢量减少51.3%。q RT-PCR分析发现敲除突变体黑色素基因簇基因表达量降低。重要的是,敲除突变体致病力较野生型菌株降低24.5%。互补突变体菌落颜色、产孢及致病力近似恢复至野生型菌株水平。【结论】Vmcyp5基因与病原菌黑色素合成、子实体的产生和致病力相关。     

构建CRISPR-Cas9介导的耻垢分枝杆菌基因组高效删除系统

【背景】耻垢分枝杆菌具有生长迅速和非致病性的特点,可作为结核分枝杆菌致病机理研究替代菌株和类固醇激素生产的工程菌,但目前耻垢分枝杆菌中缺乏高效率的基因组敲除方法。【目的】基于CRISPR-Cas9介导的定点、高效的DNA切割能力,构建耻垢分枝杆菌染色体DNA片段无痕敲除系统。【方法】构建了包含四环素诱导型启动子驱动的密码子优化的cas9基础载体pCas9101,在双侧同源臂长度约为1 kb条件下选用合适的gRNA表达模块,分别测试了对耻垢分枝杆菌mc2155染色体上的3β-羟基类固醇脱氢酶基因(MSMEG_5228,1 071 bp)和胆固醇降解基因簇(MSMEG_5990-MSMEG_6043,约48kb)敲除效率,使用相同大小的同源臂以经典p2NIL-pGOAL方法进行对照,并计算效率。【结果】使用CRISPR-Cas9方法对耻垢分枝杆菌mc2155的3β-羟基类固醇脱氢酶基因敲除效率为22%,胆固醇降解基因簇敲除效率也达到18%,两者连续敲除效率为4%。但对照p2NIL-pGOAL方法未能获得目标DNA片段敲除的菌株。【结论】本文建立的基于CRISPR-Cas9的耻垢分枝杆菌基因组无痕敲除系统显示出较高的敲除效率,该方法可为耻垢分枝杆菌后续研究提供快速高效的基因组操作方法。     

结核分枝杆菌sRNA Mpr5的功能验证

【目的】探究结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, M. tb)中sRNA Mpr5对分枝杆菌的抗逆性及宿主细胞生理的影响。【方法】构建结核分枝杆菌sRNA Mpr5过表达的重组耻垢分枝杆菌(Mycolicibacterium smegmatis, M. smeg) M3-Atc,以转入空载质粒(pSI)的野生型耻垢分枝杆菌T1-Atc作为对照,观察细菌体外生长能力和菌落形态变化。通过非生物胁迫处理(低氧、饥饿、0.02%十二烷基硫酸钠)探究重组菌株的抗逆能力。用重组耻垢分枝杆菌侵染人非小细胞肺癌上皮细胞系A549,活菌涂板计算细菌的胞内增殖能力,利用免疫荧光染色观察感染后细胞的生理结构变化。【结果】sRNA Mpr5过表达菌株的体外生长与菌落形态均与野生型相似。抗逆性实验表明Mpr5过表达菌株(M3-Atc)的抗表面活性剂能力在4 h时显著提高(P<0.05);在饥饿模型中M3-Atc早期(2–12 h)就表现出生长劣势(P<0.05);低氧模型中M3-Atc菌株0–3 d均处于生长优势状态,增长均高于对照组(P<0.05),3d后增长...     

耻垢分枝杆菌MSMEG_6281 过表达对菌株生长和形态的影响

【目的】耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis mc2155,mc2155)MSMEG_6281为结核分枝杆菌自溶素Rv3717的同源蛋白,通过建立过表达MSMEG_6281的耻垢分枝杆菌菌株,推测该蛋白对耻垢分枝杆菌肽聚糖代谢的影响。【方法】利用RT-PCR方法检测乙胺丁醇(Ethambutol,EMB)作用后MSMEG_6281基因的表达变化;以耻垢分枝杆菌基因组DNA为模板,采用PCR技术克隆MSMEG_6281基因,构建分枝杆菌表达质粒p VV16-MSMEG_6281,进一步建立MSMEG_6281过表达的耻垢分枝杆菌菌株;利用生长曲线检测MSMEG_6281过表达对耻垢分枝杆菌生长的影响;利用扫描电子显微镜分析MSMEG_6281过表达引起的耻垢分枝杆菌形态变化。【结果】EMB处理引起MSMEG_6281基因表达上调;构建了过表达MSMGE_6281的耻垢分枝杆菌菌株(mc2155/p VV16-MSMEG_6281);过表达MSMGE_6281的耻垢分枝杆菌生长缓慢,菌体形态由短杆状转变为长杆状。【结论】MSMGE_6281的过表达可改变耻垢分枝杆菌形态。MSMGE_6281的功能与细胞壁肽聚糖水解相关,在mc2155细胞壁形态维持方面发挥重要作用。     

绿针假单胞菌GP72中aurI/aurR系统调控功能

【背景】绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis) GP72是一株可生产吩嗪类抗生素吩嗪-1-羧酸(PCA)和2-羟基吩嗪(2-OH-PHZ)的生防根际促生菌。基因组比对发现GP72菌中存在aurI/aurR双元调控系统。【目的】研究该系统对GP72中吩嗪类物质的调控作用。【方法】将aurI基因在大肠杆菌中异源表达,用紫色杆菌CV026和根癌农杆菌NTL4做显色实验。构建基因敲除菌株和回补菌株,发酵测量突变株的生长曲线与总吩嗪产量。构建转录融合质粒,测定吩嗪合成基因启动子的转录水平。【结果】显色实验显示,aurI能产生多种信号分子,使CV026显紫色、NTL4显蓝色。分别单独敲除aurI和aurR基因,同时敲除aurI/aurR基因,吩嗪产量均会升高,而回补菌株吩嗪产量降为野生型水平。β-半乳糖苷酶活性测定结果显示,突变株的酶活比野生型高。【结论】aurI/aurR负调控GP72的吩嗪合成,通过抑制吩嗪合成启动子的转录而影响吩嗪类物质的产量。     

结核分枝杆菌蛋白Rv3425对细菌表型及毒力影响的研究

为探索蛋白Rv3425在结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,M. tuberculosis)中的功能,本研究以耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis,M. smegmatis)为模式菌株,构建重组了耻垢分枝杆菌Ms-Rv3425。分别将构建菌株(Ms-Rv3425)、野生株(Ms)及空载对照(Ms-Pact)接种于7H9-OADC培养基中37 ℃培养,观察Ms-Rv3425与Ms及Ms-Pact之间在生长速率、菌落形态、生物膜以及聚集度方面的差异。分别用低pH值以及含有十二烷基磺酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)、氨苄西林、异烟肼及利福平的培养基进行培养,计算存活率以分析抗逆和抗药能力;用上述压力条件培养结核分枝杆菌标准株H37Ra,分析Rv3425内源表达量的变化;进行THP-1细胞感染和BALB/c小鼠攻毒实验分析菌株的毒性变化。结果显示,与Ms及Ms-Pact相比,Ms-Rv3425的菌落形态更为粗糙且隆起,成膜及聚集能力增强;在压力条件下,Ms-Rv3425表现出更高的抗逆和抗药能力,H37Ra中Rv3425的表达量也显著上调;胞内存活率及小鼠致死率更高,各脏器病理损伤更为严重。综上所述,过表达Rv3425能够改变耻垢分枝杆菌的表型,提高抗逆性、抗药性和毒力。深入探讨PPE家族蛋白Rv3425的功能,将为结核病的防治带来新的视角。     

分枝杆菌RpsI序列差异对核糖体结构与功能的影响

核糖体结构存在动态调控,其变化与细菌发育、环境适应等过程密切相关。使用NCBI BLAST比对结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)核糖体蛋白RpsI、RpmI和RpmJ与耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)相应蛋白的氨基酸序列,发现RpsI N端氨基酸序列存在较大差异。为了探究该N端序列差异对核糖体结构与功能的影响,将表达有结核分枝杆菌rpsI基因(rpsI_Rv)的质粒整合至耻垢分枝杆菌基因组中,并利用同源重组的方法敲除耻垢分枝杆菌rpsI基因,以此构建重组菌株。聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)结果表明该重组菌株构建成功。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)显示0.5 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)于16 ℃可诱导表达RpsI_Rv。用纯化的RpsI_Rv制备特异性多克隆抗体,其效价为 1 600 000。反转录PCR 和蛋白质印迹法(Western blot)显示rpsI_Rv在重组菌株中成功表达。测定重组菌株与空载对照菌株在不同温度下的生长曲线,该重组菌株在不同温度下的生长速率未发生改变。采用通用液体倍比稀释法测定作用于核糖体不同位点的5种抗生素最小抑菌浓度(MIC₉₀),重组菌株对阿米卡星(作用于核糖体小亚基A位点的抗生素)的敏感性升高,提示分枝杆菌RpsI序列差异导致核糖体小亚基A位点附近的结构发生改变,这为分枝杆菌核糖体结构与功能的机制研究提供了数据。     

果生刺盘孢CfHAC1调控应答二硫苏糖醇胁迫的转录组分析

果生刺盘孢Colletotrichum fructicola是油茶炭疽病优势病原菌。前期研究发现bZIP转录因子CfHac1参与调控该菌的生长发育和致病性。为了揭示转录因子CfHac1调控果生刺盘孢响应内质网压力和致病机理,本研究测定了ΔCfhac1突变体对内质网压力胁迫剂的敏感性,发现突变体对二硫苏糖醇（dithiothreitol,DTT）的耐受性下降,说明CfHAC1基因可能参与调控果生刺盘孢响应内质网压力胁迫过程。进一步利用高通量RNA-seq技术对该病菌野生型菌株和CfHAC1敲除突变体菌株在DTT胁迫下的转录组进行了比较分析,结果表明差异表达基因共有2 680个,其中上调表达基因有1 181个,下调表达基因有1 499个。Gene Ontology 功能分析结果显示,差异表达基因主要参与催化活性、结合、代谢过程、细胞过程、细胞成分合成、生物过程调控和应激反应等生物学过程。KEGG功能富集分析表明,上调表达基因主要被富集到核糖体、真核细胞的核糖体生物合成、RNA转运和氰基氨基酸代谢通路中;下调表达基因显著富集在内质网蛋白质加工、N-聚糖生物合成、类固醇合成和蛋白质分泌等通路中。分析发现转录因子CfHac1调控内质网胁迫应答和致病相关基因的表达。本研究提供了在全基因组水平上对CfHAC1基因与内质网压力胁迫应答之间关联的新认识,为阐明果生刺盘孢响应内质网压力胁迫和致病机制奠定了基础。     

乙酰化修饰降低Ku蛋白的DNA结合活性

【目的】研究乙酰化修饰对Ku蛋白活性的影响。【方法】利用耻垢分枝杆菌为表达菌株,转入Ku蛋白表达质粒,纯化具有乙酰化修饰的Ku蛋白和无乙酰化的Ku蛋白突变体,比较两类蛋白的生化活性;分析氧化压力和酸性环境下耻垢分枝杆菌细胞内Ku蛋白乙酰化水平的变化。【结果】Ku蛋白过量表达的耻垢分枝杆菌比转入空质粒的对照菌株生长缓慢;乙酰化Ku蛋白比未发生乙酰化Ku蛋白修复断裂DNA的活性降低、DNA结合活性降低;氧化压力和酸性压力环境下,耻垢分枝杆菌细胞内Ku蛋白数量降低,乙酰化Ku蛋白数量变化不大。【结论】乙酰化修饰能够调节Ku蛋白的DNA结合活性,从而调节非同源末端连接修复系统的活性;Ku蛋白乙酰化程度升高是耻垢分枝杆菌对不良生长环境的反应。     

结核分枝杆菌拟核结合蛋白Lsr2阻遏调控rv1057基因转录的研究

探讨结核分枝杆菌拟核结合蛋白Lsr2是否是rv1057基因转录的阻遏蛋白。利用凝胶阻滞迁移试验分析Lsr2在体外与rv1057启动子片段的特异性结合能力;通过lacZ报告基因和荧光定量PCR检测rv1057启动子区域的不同突变形式对转录的影响;启动转录的能力;通过蛋白质免疫印迹法检测目标基因rv1057的表达。统计学处理采用t检验。Lsr2结合rv1057启动子;Lsr2与已知的阻遏蛋白TrcR都能结合rv1057启动子;缺失Lsr2结合位点的rv1057启动子能够在结核分枝杆菌生长周期中持续启动rv1057基因的转录;野生型菌株H37Rv生长早期(24 h)lsr2基因转录水平较低,而在H37Rv生长中期(48 h)、后期(120 h)lsr2基因的相对表达量变化倍数显著提高,差异具有统计学意义(t值分别为24.44、16.86,P0.05);H37Rv菌株和lsr2基因缺失菌株中trcR基因在生长早期(24 h)的相对表达量显著高于生长中期(48 h)、生长后期(120 h)的trcR表达量,差异具有统计学意义(t值分别为6.79、10.16,P0.05)。Lsr2是rv1057基因转录的阻遏蛋白,Lsr2和TrcR均可调控rv1057基因的表达。Lsr2在结核分枝杆菌生长周期的中后期大量表达并阻遏rv1057的转录,TrcR则在结核分枝杆菌生长周期的早期阻遏rv1057的转录。     

耻垢分枝杆菌的蚯蚓血红蛋白样蛋白MSMEG_3312影响其大环内酯类药物的敏感性

【目的】活性氧类分子是机体有氧代谢的自然产物,可以引起氧化损伤,导致细胞DNA突变、蛋白质失活,是细菌耐药产生的原因之一。蚯蚓血红蛋白家族是能携带氧、可逆地结合氧的一类蛋白,在氧代谢过程中发挥重要作用,与活性氧类分子介导的细菌耐药相关。预测耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)MSMEG_3312是蚯蚓血红蛋白样蛋白,其功能可能与细菌抗药性有关。【方法】通过生物信息学预测耻垢分枝杆菌MSMEG_3312的结构特征。通过基因敲除、遗传互补和抗药性分析以及启动子表达测定等方法研究MSMEG_3312与耻垢分枝杆菌抗药的相关性。【结果】与野生菌株mc2155相比,msmeg_3312敲除菌株表现为抗大环内酯类抗生素,而且回补msmeg_3312部分丧失了这种耐药表型。此外,大环内酯类抗生素的胁迫在统计上显著下调msmeg_3312启动子的表达。另外,对作用于核糖体的其他药物,敲除菌株和野生菌株没有抗药性差异。【结论】生物信息学分析显示MSMEG_3312的氨基酸序列具有典型的蚯蚓血红蛋白保守的HHE结构域,预测其二级结构含有4个α-螺旋组成的典型蚯蚓血红蛋白结构。MSMEG_3312与耻垢分枝杆菌对大环内酯类抗生素的药物敏感性相关,其可能通过影响药物与核糖体50S亚基的作用来发挥功能。     

苏云金芽胞杆菌BkdR和CcpA对bkd基因簇的转录调控

【目的】通过分析苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)转录调控因子BkdR和多效调控因子CcpA对亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸代谢基因簇bkd的转录调控,明确bkd基因簇的转录调控机制。【方法】通过β-半乳糖苷酶活性测定分析bkd基因簇启动子的诱导转录活性,采用同源重组技术敲除Bt HD73菌株的ccpA基因,通过融合His标签的方法在大肠杆菌中表达纯化BkdR和CcpA蛋白,通过凝胶阻滞实验明确BkdR和CcpA蛋白与bkd基因簇启动子的结合作用。【结果】亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸可诱导bkd基因簇启动子Pptb的转录活性。Pptb的诱导活性在bkdR突变体中明显降低,而在ccpA突变体中明显上升。BkdR和CcpA蛋白与Pptb均有结合作用。【结论】bkd基因簇的转录活性受BkdR正调控,而受CcpA负调控。     

十字花科黑腐病菌中转录调控因子HpaR1调控一个纤维素酶基因的表达

十字花科黑腐病菌（Xcc8004）中的一个转录调控因子XC₂736（HpaR1）在致病过程中具有重要的作用。前期研究发现该转录调控因子可能调控胞外纤维素酶的合成。为了解HpaR1对纤维素酶的转录调控机理,本研究对HpaR1进行原核表达纯化,并与488bp的包含XC₀639的启动子区DNA片段进行凝胶电泳迁移率试验,发现HpaR1与XC₀639启动子可以发生结合。将488bp的XC₀639的启动子DNA片段与报告基因gus融合,构建XC₀639的报告质粒pGUS0639r,分别导入野生型8004菌株和缺失突变体DM2736中,分析发现在突变体背景下GUS的表达水平比野生型背景明显降低。表明HpaR1正调控XC₀639的表达。构建XC₀639的极性整合突变体PK0639,检测发现PK0639几乎丧失胞外纤维素酶的活力;通过功能反式互补构建的互补菌株CPK0639可以恢复纤维素酶活性。研究结果表明HpaR1通过调控纤维素酶基因XC₀639的表达来调控细胞的纤维素酶活性。本研究为更深入地了解HpaR1如何调控细菌生理生化功能奠定了基础。     

猪链球菌2型强毒株05ZYH33转录调控因子Rgg基因敲除突变体与野生株的基因表达差异分析

目的:为了解猪链球菌2型强毒株05Z33转录调控因子Rgg的调控作用,用基因芯片方法分析野生株与rgg基因敲除突变体之间的差异表达基因。方法:用猪链球菌2型全基因组序列点样制备芯片,将芯片运用于rgg敲除株与野生株的基因表达差异研究,采用定量real-time PCR(qRT-PCR)验证表达谱结果。结果:在突变体中共发现45个基因表达量变化在2倍以上,其中19个基因表达上调,26个基因表达下调。这些基因在细菌毒力、免疫抗原、DNA合成和修复、基础代谢和ABC转运系统等方面起着重要作用。结论:转录调控因子Rgg是一个全局调控因子,但rgg敲除后并不影响猪链球菌的毒力。     

苹果树腐烂病菌非核糖体多肽合成酶基因VmNRPS12的功能

【目的】非核糖体多肽合成酶(NRPS)在植物病原真菌与其寄主互作过程中发挥着重要作用,明确Vm NRPS12基因在苹果树腐烂病菌致病过程中的功能,将为今后深入研究苹果树腐烂病菌NRPS作用机制提供理论依据。【方法】基于苹果树腐烂病菌全基因组数据,得到VmNRPS12基因。运用qRT-PCR技术分析VmNRPS12在侵染初期的表达水平,利用Double-joint PCR和PEG介导的原生质体转化获得该基因抗潮霉素的突变体,对突变体进行PCR检测及Southern blot验证得到敲除突变体,进一步通过重新导入该基因全长片段获得互补突变体,最后对野生型、敲除突变体和互补突变体进行菌落、产孢及致病力观察,对检测数据用SPSS软件进行差异显著性分析。【结果】定量分析显示该基因在侵染初期显著上调表达,且接种48 h后的表达量是对照的138.6倍。该基因的敲除突变体在营养生长及产孢方面与野生型菌株03-8相比无显著性差异,但致病力与野生型菌株03-8相比显著减弱,且互补突变体致病力近似恢复至野生型水平。【结论】VmNRPS12基因与苹果树腐烂病菌致病性相关。     

结核杆菌eis基因的克隆及其在耻垢分枝杆菌中的表达

目的:构建结核分枝杆菌eis基因的穿梭表达载体,鉴定其在重组耻垢分枝杆菌中的生物活性。方法:采用PCR技术克隆结核分枝杆菌eis基因,构建大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体pMV-eis,经酶切和测序鉴定其正确性,用电穿孔法将重组质粒转化至耻垢分枝杆菌mc²155中,采用SDS-PAGE和Western blot检测eis基因在耻垢分枝杆菌中的表达。结果:成功构建结核杆菌eis基因穿梭表达载体pMV-eis;生长曲线说明重组质粒不会影响耻垢分枝杆菌的体外生长;SDS-PAGE 和Western blot检测证实eis在耻垢分枝杆菌中可表达出相对分子量约42kDa的Eis蛋白。结论:成功构建了eis基因穿梭表达质粒pMV-eis,且该重组质粒在耻垢分枝杆菌中具有生物活性,为下一步研究表达产物Eis的功能奠定了一定基础。