超量表达MrCN基因提高烟草植株对TMV的抗性

利用农杆菌介导的遗传转化法将含有普通烟草Ubi．U4启动子驱动MrCN基因表达的元件导入TMV敏感烟草品种K326中,对筛选鉴定出的T0代转基因植株接种TMV,测定其接种前后不同时期的理化指标,以接种TMV的野生型植株为对照。结果显示,转基因植株和野生型植株接种TMV前叶绿素（Chl）和MDA含量YLSOD、POD和CAT酶活力均无显著差异,但接种TMV后野生型植株Chl含量逐渐降低,转基因植株Chl含量先增后降,在接种TMV后5d时转基因植株叶片Chl含量显著高于野生型植株。接种前期（0-3d）转基因植株MDA含量略低于野生型植株,但差异不显著;但接种后期（3～5d）前者的MDA含量显著低于后者。接种TMV后转基因植株中SOD、POD及CAT酶活性变化幅度较野生型植株高,以CAT的变幅最为显著。另外,Real-timePCR分析结果表明,接种TMV后3d时转基因植株删蹦、PR-1α及NrCN表达量均显著高于野生型植株。以上结果表明,通过转基因技术提高烟草抗病基NNrCN的表达量,能提高防御酶活性及病程相关基因的表达量,从而延缓植株感染TMV的发病时间,增强敏感植株对TMV的抗性。     

超量表达NrCN基因提高烟草植株对TMV的抗性

利用农杆菌介导的遗传转化法将含有普通烟草Ubi.U₄启动子驱动NrCN基因表达的元件导入TMV敏感烟草品种K326中,对筛选鉴定出的T₀代转基因植株接种TMV,测定其接种前后不同时期的理化指标,以接种TMV的野生型植株为对照。结果显示,转基因植株和野生型植株接种TMV前叶绿素（Chl）和MDA含量及SOD、POD和CAT酶活力均无显著差异,但接种TMV后野生型植株Chl含量逐渐降低,转基因植株Chl含量先增后降,在接种TMV后5 d时转基因植株叶片Chl含量显著高于野生型植株。接种前期（0³ d）转基因植株MDA含量略低于野生型植株,但差异不显著;但接种后期（3⁵ d）前者的MDA含量显著低于后者。接种TMV后转基因植株中SOD、POD及CAT酶活性变化幅度较野生型植株高,以CAT的变幅最为显著。另外,Real-time PCR分析结果表明,接种TMV后3 d时转基因植株MAPK、PR-1a及NrCN表达量均显著高于野生型植株。以上结果表明,通过转基因技术提高烟草抗病基因NrCN的表达量,能提高防御酶活性及病程相关基因的表达量,从而延缓植株感染TMV的发病时间,增强敏感植株对TMV的抗性。     

转天山雪莲sikPIP3基因烟草的获得及抗逆性鉴定

利用PCR技术从实验室建立的天山雪莲DNA文库中克隆了天山雪莲质膜水孔蛋白基因sikPIP3,构建了植物表达载体pBI121-sikPIP3,通过农杆菌介导法转化烟草品种NC89,经PCR和RT-PCR检测证明目的基因成功导入并得到了表达,采用水分胁迫进行抗旱分析和采用冷冻胁迫进行抗寒性分析。结果显示:(1)克隆出具有水孔蛋白基因特性的sikPIP3基因。(2)经断水干旱处理,转基因烟草的生长表型优于野生型烟草,特别是在断水9d的情况下,野生型烟草已经完全萎蔫,转基因烟草萎蔫症状较轻;生理指标测量结果显示,转基因烟草的相对电导率和MDA的含量低于野生型烟草,相对含水量和CAT活性高于野生型烟草。试验表明转sikPIP3烟草的抗旱性高于野生型烟草。(3)经不同温度胁迫处理,转基因烟草的生长表型优于野生型烟草,特别是在-4℃冷处理6h情况下,野生型烟草已经完全萎蔫,转基因烟草只出现少量伤斑;生理指标分析结果表明,转基因烟草的相对电导率和MDA的含量低于野生型烟草,CAT活性高于野生型烟草。试验表明转sikPIP3烟草的抗寒性高于野生型烟草。综合结果表明:sikPIP3基因在抗逆基因工程方面具有较高的应用前景。     

西伯利亚蓼非特异性脂质转移蛋白基因PsnsLTP的功能分析

通过在农杆菌介导下,利用西伯利亚蓼非特异性脂质转移蛋白基因(植物表达载体：pROKII-PsnsLTP)对烟草进行遗传转化,经卡那霉素抗性分化筛选及PCR鉴定,获得6个转基因烟草株系。接种烟草炭疽病病菌和猝倒病病菌后观察转基因植株和野生型的表型差异,在NaCl、CdCl₂、7.5% PEG6000的胁迫下进行表型观察和生理指标的测定。结果显示：与野生型烟草相比,T1代转基因植株已具有较强的耐烟草炭疽病和猝倒病的能力;其超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）活性显著增强,丙二醛（MAD）含量显著降低,且幼苗具有较好的生长性状。由此证明,西伯利亚蓼非特异性脂质转移蛋白PsnsLTP增加了转基因烟草抵御生物胁迫和非生物胁迫的能力,这些工作为深入研究PsnsLTP基因的抗逆机制提供了参考。     

龙牙楤木Aeβ-AS基因的表达对烟草中皂苷含量的影响

为探讨龙牙楤木(Aralia elata)三萜皂苷合成的关键酶基因β-香树素合成酶基因(Aeβ-AS)对三萜皂苷合成的影响。利用基因克隆技术对Aeβ-AS基因进行克隆,并对烟草进行遗传转化,分析转基因烟草中Aeβ-AS基因在各部位的表达差异,检测Aeβ-AS基因及上下游关键酶基因表达量和总三萜含量。结果表明:成功构建了植物过表达载体pROKⅡ-Aeβ-AS,并转入了野生型烟草,获得7个转基因株系,并在mRNA水平表达,且在叶子中的表达量要高于根和茎;在转基因烟草中,Aeβ-AS基因及其上下游的关键酶基因表达量均高于野生型,其中株系L21的NtFPS、NtSS基因的相对表达量最高,株系L30的NtSE、Aeβ-AS基因的相对表达量最高;与野生型烟草相比,转基因烟草的总三萜含量显著升高(1.1～1.6倍)。试验结果证明合成Aeβ-AS基因并在烟草中进行异源转化,可以使转基因烟草内的总三萜含量显著升高。     

铁皮石斛DoSMT2基因的功能分析

为了揭示铁皮石斛(Dendrobium officinale)甾醇C-24甲基转移酶2基因(DoSMT2)在甾醇代谢过程的功能,该研究通过根癌农杆菌介导法将来源于铁皮石斛的DoSMT2基因转化烟草(Nicotiana tabacum),并采用qRT-PCR技术检测DoSMT2基因在转基因烟草叶片中的表达,采用气相色谱质谱法分析菜油甾醇和谷甾醇的含量。结果显示:(1)成功获得DoSMT2基因的开放阅读框(1 119 bp),并成功构建正义植物表达载体质粒pCXSN-DoSMT2,经农杆菌介导的烟草叶盘转化法转化烟草并鉴定,获得4株阳性转基因烟草植株。(2)Southern blot结果表明,4株转基因烟草植株都有1条杂交信号带,而非转基因烟草植株没有,说明外源DoSMT2基因都以单拷贝整合到4株转基因烟草基因组中。(3)qRT-PCR检测显示,非转基因烟草未检测到外源DoSMT2基因的表达,4株转基因烟草都能检测到DoSMT2基因的表达,且表达水平差异极显著,各株系表达量高低依次为P3P1P2(P4)。(4)气相色谱质谱分析显示,转DoSMT2基因烟草叶片的菜油甾醇含量均极显著低于非转基因烟草叶片,而谷甾醇含量均极显著高于非转基因烟草叶片。研究表明,DoSMT2具有催化24-亚甲基胆甾烯醇转化形成24-亚乙基胆甾烯醇活性。     

杨树HDA902基因在低温胁迫应答反应中的功能

组蛋白去乙酰化酶在植物非生物胁迫应答反应中具有重要的调控作用。利用RT-PCR的方法从毛果杨中克隆了组蛋白去乙酰化酶基因HDA902。利用农杆菌介导法将其遗传转化到烟草中,并对转基因植株进行低温耐受性分析。研究结果表明,HDA902在烟草中的表达显著提高了转基因株系对低温的耐受性。叶片NBT和DAB染色结果表明,在低温处理后转基因烟草比野生型烟草产生较少的活性氧。丙二醛和脯氨酸含量测定结果表明,在低温条件下,转基因烟草叶片的脯氨酸含量显著高于野生型烟草,而丙二醛含量显著低于野生型烟草。这些研究结果表明,HDA902参与低温胁迫应答反应,其过量表达提高了植株耐低温的能力。     

胡杨Ring finger E3连接酶PeRH2提高烟草耐旱机制研究

近期研究表明泛素化在植物胁迫响应中扮演一个关键的角色。作为泛素-蛋白酶体系统(UPS)中的关键酶,泛素E3连接酶更是在细胞的新陈代谢中起着重要的作用。本文从胡杨中克隆了一个C端含有Ring finger结构域的蛋白(152个氨基酸)编码基因(Pe RH2),经过序列比对推断该基因编码产物为泛素E3连接酶,属于Ring finger家族中的Ring-H2构型。研究显示,甘露醇胡杨苗木在255 mmol/L甘露醇胁迫下,叶片Pe RH2表达量上调。拟南芥原生质体中瞬时表达融合质粒p Yellow0029-Pe RH2的研究表明,Pe RH2蛋白定位于细胞核。以农杆菌介导法将Pe RH2转入烟草,Sq RT-PCR结果显示,Pe RH2在转基因烟草中获得过表达。在255 mmol/L甘露醇处理下,转基因烟草幼苗耐受渗透胁迫的能力高于野生型和转空载体烟草。干旱处理后,转基因烟草的叶片保水力明显高于野生型和转空载体烟草,而叶片相对电导率、MDA的含量也要低于野生型和转空载体烟草。因此,过表达Pe RH2能够提高烟草的抗旱能力。     

油菜素内酯合成酶基因DAS5促进杨树生长及提高抗旱性的作用

以河北杨(Populus hopeiensis)为材料, 研究拟南芥(Arabidopsis thaliana)油菜素内酯(BR)生物合成酶基因DAS5对其生长表型、生物量及抗旱性的影响。结果表明: (1) 转DAS5基因河北杨植株的根长、地径、叶柄及叶片长度均显著大于野生型植株, 且地上、地下部分干重及根冠比显著高于野生型, 其拥有发达的根系; (2) 在干旱胁迫下, 转DAS5基因河北杨植株失水褪绿速度较野生型植株缓慢, 在复水后转基因植株能够较早较好地恢复活力, 萌发较多的新幼芽且长势良好; (3)控水期间, 转基因河北杨的相对生长率显著高于野生型, 且随着干旱胁迫程度的加剧, 其可溶性糖含量、游离脯氨酸含量、过氧化氢酶(CAT)活性、超氧化物歧化酶(SOD)活性均显著高于野生型。实验结果表明, 与野生型相比, 转基因植株具有较高的生长量与较强的抗干旱胁迫能力, 说明来自拟南芥的BR生物合成酶基因DAS5可以显著增加河北杨的生长量并在抵御干旱胁迫机制中发挥重要作用。     

羊草LcPIP基因遗传转化露地菊及其抗盐性鉴定

PIP是重要的水孔蛋白之一,与植物的抗逆性有关。本文用叶盘法将羊草LcPIP遗传转化露地菊火焰,通过常规PCR和GUS染色方法鉴定转基因株系,Real-time PCR检测盐胁迫下转基因和野生植株中CmPIP1和CmPIP2的相对表达量,并测定SOD、POD活性和MDA含量。结果显示,在转LcPIP基因的露地菊植株叶片中,CmPIP1和CmPIP2基因表达量均上升,是野生型植株的2倍;根部的CmPIP1与CmPIP2基因的表达量均上升,CmPIP1上升程度高于CmPIP2。在200 mmol·L~(-1) NaCl的胁迫下,野生型植株中CmPIP1基因表达量明显下降,而转基因植株中CmPIP1基因表达量在12~48 h出现明显的上升;在盐胁迫12 h后,转基因植株中CmPIP2基因表达量上升程度明显高于野生型植株。盐胁迫12 h后,转基因植株的SOD活性提高更为明显。在盐胁迫前期(0~24 h)转基因植株MDA含量增加幅度低于野生型植株;在盐胁迫后期(48~72 h)转基因露地菊POD活性出现明显上升,而野生型露地菊呈下降趋势。     

dsRNA介导的番木瓜环斑病毒（PRSV）的抗病性研究

以模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）和烟草（Nicotiana tabacum）及PRSV寄主植物番木瓜（CaricapapayaL.）作为试验材料,开展了番木瓜环斑病毒外壳蛋白基因dsRNA介导的PRSV病原抗性的研究。利用农杆菌介导法将番木瓜环斑病毒外壳蛋白CP基因反向重复表达载体pHellsgate12-CPIR（简称PHG12-CPIR）分别转化到烟草和拟南芥中,获得阳性植株,并利用渗透法和农杆菌介导的瞬时表达体系将pHG12-CPIR载体导入到番木瓜中。对转基因植株进行攻毒试验并分析了其抗病性。在接种3~7d内,在拟南芥和番木瓜上转基因植株的发病情况较轻,而野生型植株叶片与转基因植株相比,均表现出不同程度的黄化、皱缩和枯斑等症状。在接种PRSV后,番木瓜和拟南芥转化植株表现症状的叶片的比例与对照相比,结果显著低于对照,而在烟草植株上症状表现的差异不明显。在3种植物上RT-PCR检测结果显示,在接种番木瓜环斑病毒PRSV后,野生型植株中有高浓度的病毒积累,而转pHG12-CPIR基因植株中几乎没有病毒积累,推测转pHG12-CPIR基因植株中瞬时表达系统已启动RNAi机制抑制了CP基因的表达。     

新疆雪莲水孔蛋白sikPIP_1基因的克隆与功能分析

利用PCR技术从已建立的新疆雪莲cDNA文库中克隆雪莲水孔蛋白基因sikPIP1,构建植物表达载体pBI121-sikPIP1,利用农杆菌介导法获得转基因烟草,PCR和RT-PCR检测证明该基因成功导入并得以转录,并对检测结果均为阳性的植株通过水分胁迫和温度胁迫进行抗旱性和抗寒性分析。结果显示:(1)克隆得到长为880 bp,具有水孔蛋白特性的sikPIP1基因,完整ORF为840 bp。(2)水分胁迫中,断水7 d后转基因烟草生长表型明显优于野生型烟草,生理指标测定结果显示,转基因烟草的相对电导率和丙二醛含量均低于野生型烟草,相对含水量高于野生型烟草。(3)不同温度胁迫处理,转基因烟草表型显著优于野生型,特别是0℃以下低温胁迫,野生型烟草出现严重的萎蔫,而转基因烟草受伤害程度较轻;生理指标结果显示转基因烟草相对电导率、丙二醛含量低于野生型烟草。结果表明,转sikPIP1基因提高了烟草抗旱能力和抗寒能力。     

棉花乙烯合成基因促进拟南芥和烟草不定根发生的研究

从棉花纤维cDNA中克隆获得乙烯合成基因GhACO3,构建了植物过量表达载体p35S::GhACO3.通过花序侵染法和叶盘法分别转化拟南芥和烟草,利用卡那霉素筛选及分子检测获得转基因阳性拟南芥和烟草植株.结果表明,GhACO3基因已整合到拟南芥和烟草基因组中;经过纯合筛选后获得转基因T2代拟南芥植株;与野生型拟南芥相比,GhACO3基因对拟南芥不定根发生具有显著促进作用;与野生型烟草植株相比,转GhACO3基因烟草不定根发生得到了显著的促进.研究表明,GhACO3基因的过量表达能够促进拟南芥和烟草不定根的形成发育,为进一步探讨GhACO3的生物学功能和进行转基因育种奠定了基础.     

烟草NtNAC1基因的克隆及其在烟草中的抗旱功能分析

NAC转录因子在植物信号转导及非生物损伤过程中起重要作用。本实验从烟草c DNA文库中克隆了NtNAC1基因,c DNA编码区全长861 bp,编码286个氨基酸。进化树分析结果显示,Nt NAC1基因编码的氨基酸序列与马铃薯同源性最高。农杆菌介导的遗传转化获得37株转基因烟草,用20%PEG6000处理转基因和野生型植株7 d。结果显示,转基因植株的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)的酶活性都高于野生型,丙二醛(MDA)和脯氨酸(Pro)含量都低于野生型。RT-PCR分析结果显示,Nt NAC1基因以及Nt NAC基因表达高于野生型,脯氨酸合成的2个关键酶吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)和鸟氨酸-δ-氨基转移酶(δ-OAT)基因表达低于野生型。选取T_0代转基因和野生型种子,对苗期根系进行耐旱性分析。结果发现,在300 mmol·L~(-1)甘露醇胁迫下,转基因根系比野生型长,野生型根系的生长明显受到抑制。这表明转Nt NAC1基因的表达可能提高了植株的抗旱能力。     

小黑杨PsnHB22基因在烟草中的遗传转化研究

HD-Zip转录因子在光信号转导、非生物胁迫、叶片发育等方面发挥重要的作用，HB22转录因子是HD-ZipⅠ亚家族的成员之一。为研究PsnHB22基因的功能，从小黑杨（Populus simonii×P.nigra）cDNA中克隆PsnHB22基因并构建植物表达载体进行烟草（Nicotiana tabacum）的遗传转化，以获得该基因过量表达的转基因株系。对转基因株系进行PCR、qRT-PCR分子检测后观察表型，结果显示在营养生长时期，转基因烟草叶片窄小并且株高显著低于野生型对照。测定转基因烟草及野生型叶片的叶绿素含量，发现转基因烟草叶绿素含量显著高于野生型。由此推测PsnHB22基因在植株高生长、光合作用及叶片的形态建成等过程中起着重要的作用。     

褪黑素合成酶基因转化烟草及转化植株抗氧化系统变化

通过根癌农杆菌(含植物表达载体YXu55)介导的转化技术,将褪黑素生物合成酶-芳烷基胺N-乙酰转移酶(Arylalkylamine N-acetyltransferase,AANAT)与羟基吲哚O-甲基转移酶(Hydroxyindole O-methyltransferase,HIOMT)基因导入到烟草(秦烟95)中。对所获得的庆大霉素抗性烟草株系进行Southern blotting和RT-PCR分子生物学检测,结果表明,AANAT-HIOMT基因已成功地整合到烟草基因组中,并且可以在mRNA水平上进行转录。用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)测定转化株系的褪黑素含量表明,转AANAT-HIOMT基因烟草株系的褪黑素含量均明显高于pZP122(不含AANAT和HIOMT基因的空白质粒)转基因株系和未转基因的对照植株,证明AANAT-HIOMT基因在转基因植株中的表达增强了褪黑素的合成能力。对不同株系抗氧化系统的部分指标进行了测定,并与其亲本对照植株比较,发现AANAT-HIOMT基因在转基因植物中的表达引起超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)活性增加,谷胱甘肽(GSH)浓度...     

超量表达AtBAS1基因对烟草中烟碱和降烟碱合成的影响

为明确拟南芥(Arabidopsis thaliana)光敏色素B激活标签的抑制蛋白1(phy B activation-tagged suppressor1,BAS1)基因对烟草(Nicotiana tabacum)中烟碱、降烟碱和N-亚硝基降烟碱合成的影响,通过构建含有不同启动子的植物表达载体p SH-p LXM5-BAS1和p SH-35S-BAS1遗传转化烟草。在8~10叶期分别取转基因和野生型烟草植株相同部位的叶片,采用LC-MS方法对样品中烟碱、降烟碱、亚硝基降烟碱含量进行测定,结果表明转基因烟草烟碱含量和降烟碱含量与野生型相比均明显提高。转p LXM5-BAS1基因和转35S-BAS1基因植株烟碱含量分别是野生型植株2.9倍和2.95倍;同时测得降烟碱含量分别为野生型的3.35倍和3.76倍;在转基因和野生型烟草中均未检测到亚硝基降烟碱。表明超量表达At BAS1对烟草的烟碱和降烟碱合成存在显著影响。据NCBI数据库中报道的烟碱合成相关基因PMT和QPT,降烟碱合成相关基因CYP82E4v1、CYP82E5v2、CYP82E10的序列,设计各基因的Real-time PCR引物,并以烟草β-Actin基因作为内参,Real-Time PCR结果表明烟碱和降烟碱合成相关基因表达均出现不同程度的上调。综上可知,在烟草中超量表达At BAS1基因,促使烟碱和降烟碱合成相关基因表达的上调,直接导致了烟草中烟碱含量和降烟碱含量的大幅提高。本研究为后续深入挖掘影响烟碱及降烟碱生成及转化的新基因并最终构建完整的烟碱代谢网络提供了借鉴,也为研究烟碱向降烟碱转化过程中信号因子和信号传递提供了一个新途径。     

转小麦冷胁迫蛋白截短基因烟草及其抗病性分析

TA3-13是克隆于小麦冷胁迫蛋白基因的截短片段。原核表达的TA3-13蛋白能够诱导烟草产生显著的抗烟草花叶病毒(TMV)的作用。文章将TA3-13基因片段克隆到植物表达载体pBI121上,构建成转基因重组体pB-3-13,通过冻融法转化农杆菌EHA105,构建成转基因侵染菌株。采用叶盘法将pB-3-13转化三生烟草,经卡那霉素抗性筛选,获得48株T0代再生植株。通过PCR检测,鉴定出33株转基因单株,收获了20株种子作为T1代株系。PCR-Southern杂交结果显示,PCR阳性条带与TA3-13探针有特异性杂交,说明外源基因被转化到烟草的基因组中。选取两个T1代株系的烟草植株用于各项测定。GUS组织化学活性鉴定和RT-PCR检测结果显示,外源基因可以成功地表达。接种TMV病毒后,转基因烟草抗TMV的能力较转空载体烟草提高3～5倍。转基因烟草具有抗TMV侵入和抗病毒病害发展的作用,同时转基因烟草可以抗细菌软腐病菌的扩展。     

葡萄蔗糖转运蛋白在烟草中的反义表达及其对转基因烟草的影响

将葡萄蔗糖转运蛋白VvSUC27cDNA以反义方向插入到含有CaMV35s启动子的真核表达载体pBI121载体中,然后转化到烟草(Nicotianatobacumcv.Samsun)植株中.转反义VvSUC27cDNA的烟草植株在含有20g/L蔗糖的培养基上能够正常生长发育,但是通过切片观察,发现其根部发育较弱,且叶片叶绿体含量增加.可溶性糖测定发现,转基因烟草根部蔗糖含量只有野生型烟草的51%.14C蔗糖吸收实验发现转基因烟草转运外界蔗糖的能力大大降低.