COPD 差异表达基因的生物信息学分析及在LUSC样本中的表达

为确定慢性阻塞性肺病(COPD)的分子标记物及COPD与肺鳞状细胞癌(LUSC)共存的差异表达基因,探寻COPD合并肺癌的预测因子,发现新的治疗靶点。本研究采用生物信息学方法,从GEO数据库中筛选3套基因芯片数据集,挖掘COPD患者小气道上皮细胞(SAEC)的差异表达基因(DEG)以及潜在的生物标记物,并通过基因本体(GO)、京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析预测DEGs的功能及参与的代谢途径。继而对DEGs构建PPI网络,使用Cytoscape软件筛选子模块和Hub基因,并将Hub基因通过TCGA数据库分析其在LUSC中的差异表达情况及差异基因间的相关性。结果共获得52个上调基因和24个下调基因,代谢通路主要集中在细胞色素P450对外源物质的代谢、化学致癌、花生四烯酸代谢及甲状腺激素合成四条途径上,通过Cytoscape软件从PPI网络中筛选得到2个功能模块和10个Hub基因,进一步验证发现其中5个基因在TCGA数据库中的LUSC样本中同样差异表达。由此推测SPP1、ALDH3A1、SPRR3、KRT6A和SPRR1B 可能为COPD 分子标记物及COPD与LUSC共存的DEGs,从而为研究COPD和LUSC的发病机制及二者潜在关系奠定良好的基础。     

稳定表达外源性p16基因肺癌A549细胞株的建立及鉴定

为构建稳定表达外源性抑癌基因p16的肺癌A549细胞株,用脂质体介导的基因转染方法,借助真核质粒表达载体（pcDNA3)。将抑癌基因p16转移入此基因缺失的人肺癌细胞株A549细胞中,经G418筛选,获得稳定表达的细胞克隆,用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）及免疫组织化学鉴定p16基因的表达,同时对克隆细胞分泌蛋白进行活性检测。结果显示转染p16基因的A549细胞中可以检测到p16mRNA及蛋白的表达,说明建立的p16真核表达载体能在肺肿瘤细胞中分泌表达蛋白,表达P16抑癌蛋白的A549细胞株的建立有助于研究抑癌基因p16在肺癌发生中的作用。     

慢性鼻-鼻窦炎伴鼻息肉基因表达谱的生物信息学分析

本研究从美国国立生物信息中心(NCBI)的子数据库基因表达数据库(GEO)中选择基因表达谱GSE36830数据集,采用GEO2R筛选正常钩突和鼻息肉组织之间的差异表达基因(DEGs),对关键通路和差异表达基因进行数据库挖掘和分析,经筛选后的差异表达基因采用戴维在线工具对其进行基因本体富集分析(GO)、京都基因和基因组百科全书(KEGG)分析,然后将DEGs导入String数据库进行蛋白质互作网络分析,绘制差异表达基因互作网络图,将其数据导入Cytoscape软件中,筛选网络中心节点和关键基因,分析关键子网络。共筛选出699个DEGs,其中475个基因为上调表达基因,224个基因为下调表达基因。在GO分析中,针对生物过程,上调的DEGs包括:炎症反应、免疫反应、细胞趋化性、炎症反应的正向调节和细胞的粘附等;下调的DEGs主要参与:唾液分泌、生物矿物组织发展、细胞氨基酸生物合成过程、视网膜内稳态及离子跨膜转运等。在KEGG分析中,上调的DEGs主要在参与造血细胞系、细胞因子-细胞因子受体相互作用、破骨细胞分化、趋化因子信号通路、癌症中的转录失调、哮喘、金黄色葡萄球菌感染等信号通路中富集,而下调的DEGs在唾液腺分泌及胆汁分泌信号通路中富集。差异表达基因互作网络图筛选出前10个关键基因:ITGAM、IL10、CD86、TLR8、ITGAX、CCL2、CCR7、SRC、EGF及ITGB2。本研究得到了一组鼻息肉差异表达基因的生物信息学分析结果,但仍需进一步用基础试验来验证。本文分析的结论为慢性鼻-鼻窦炎、鼻息肉的研究提供了新的研究方向,也为鼻息肉发病机制研究的思路提供了一定的建设性作用。     

肾透明细胞癌Caki-1细胞系差异表达基因的生物信息学分析

目的比较肾透明细胞癌Caki-1细胞系与正常肾上皮细胞系ASE-5063中的差异表达基因（DEGs）,寻找潜在的肾透明细胞癌特异性分子标志物。 方法利用GEO数据库自带的GEO2R在线分析工具分析基因芯片GSE78179,将筛选出的DEGs分别导入Metascape、STRING以及Cytoscape进行综合分析并筛选出核心基因。最后使用FunRich等软件对筛选出的核心基因进行GO和KEGG富集分析。 结果共筛选出562个DEGs,其中上调基因345个,下调基因217个。进一步使用MCODE筛选出36个关键基因,GO功能分析发现这些基因与细胞粘附分子活性、趋化因子活性、细胞通讯和信号转导等密切相关;KEGG通路富集结果则表明差异基因主要集中在趋化因子信号通路、TNF信号通路以及NF-κB信号通路等多种与肿瘤相关的通路上。 结论运用生物信息学方法筛选出肾透明细胞癌Caki-1细胞系中DEGs,其中数个核心基因广泛参与多种肿瘤的病理进程,但尚未在肾透明细胞癌有相关研究报道,提示其可能是治疗肾透明细胞癌的潜在靶点。     

基于拓扑分析方法鉴定与胃癌相关的生物标志物

胃癌(gastric cancer, GC)是最常见的恶性肿瘤之一。由于GC发病隐匿的特性,其早期检测困难。因此,研究与GC早期诊断和预后相关的生物标志物至关重要。从GEO数据库下载了3组基因表达数据集GSE79973、 GSE19826和GSE13911,通过Limma包筛选差异表达基因(differentially expressed genes, DEGs),并使用DEGs、 STRING V11数据库和Cytoscape构建了DEGs的蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction, PPI)网络,通过4种拓扑分析方法取交集筛选hub基因,并通过单变量Cox分析、多变量Cox分析、 Lasso回归分析、生存分析、通路分析以及文献法验证hub基因。从3个数据集中分别筛选了1 599个、 333个和662个DEGs。通过拓扑分析方法筛选了4个hub基因,即CDK1、AURKA、PTTG1和UBE2C。GO和KEGG富集分析结果表明4个hub基因参与了细胞外基质-受体相互作用、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、小细胞肺癌和蛋白质消化吸收等通路。...     

胰腺癌中CDK1的表达与预后的生物信息学分析

为探讨胰腺癌的发病机制并为胰腺癌的防治提供生物信息学依据,用GEO2R在线工具分析GSE16515中胰腺癌患者肿瘤组织和相应正常组织的差异表达基因(differentially expressed genes, DEGs),通过DAVID数据库对DEGs进行GO分析和KEGG通路富集分析,然后通过STRING数据库构建蛋白质相互作用(protein-protein interaction, PPI)网络,用Cytoscape软件进行关键基因(hub基因)筛选和功能模块分析,并在GEPIA数据库对hub基因进行验证,用CCLE数据库检测靶基因在胰腺癌组织及细胞系中的表达水平。分析结果显示胰腺癌中筛选出的376个DEGs主要涉及细胞周期、p53信号通路、蛋白质消化吸收、ECM-受体相互作用、PI3K-Akt信号通路、血小板激活信号通路。GEPIA数据库验证结果显示10个hub基因均在胰腺癌组织中高表达,其中8个hub基因与胰腺癌患者的不良预后有关。CCLE数据库检测结果显示周期蛋白依赖性激酶1 (cyclin-dependent kinase 1, CDK1)在胰腺癌组织和细胞中均有较高的表达水平。本研究结果表明CDK1可能与胰腺癌的发生发展最为相关,为进一步探究胰腺癌的发病机制提供了生物信息学依据。     

高表达精脒/精胺N1-乙酞基转移酶对人肺癌A549细胞株生长的影响

旨在研究人精脒/精胺N1-乙酰基转移酶(spermidine/spermine N1-acetyltransferase,SSAT)高表达对人肺癌A549细胞生长的影响。以pCR2.1-SSAT质粒为模板,PCR法扩增人SSAT基因并克隆至pcDNA3.1表达载体。重组质粒转染A549细胞后,RT-PCR法和Western blotting法筛选SSAT高表达的细胞株。MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期。成功构建pcDNA3.1-SSAT重组质粒,用该质粒转染A549细胞后,筛选获得稳定高表达SSAT的细胞株。SSAT高表达导致细胞生长抑制,S期细胞减少和自发性凋亡细胞增多。结果显示,稳定高表达SSAT可在A549肺癌细胞中部分模拟多胺类似物类抗癌药物的药理活性,导致瘤细胞生长抑制和细胞凋亡。     

MDCK细胞和MDCK-G1细胞感染H1N1流感病毒后病毒滴度和细胞转录组表达差异分析

目的通过分析细胞表达基因及其相关信号通路的差异等信息,探索MDCK和MDCK-G1细胞株在接种H1N1流感病毒后出现病毒滴度和细胞生长趋势差异的内在生物学特性等原因。方法通过Illumina测序平台对2株细胞进行转录组测序(RNA sequencing, RNA-seq)和测序结果生物信息学分析后,选择了17个差异基因进行实时定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)验证。结果 MDCK和MDCK-G1细胞差异基因(differentially expressed genes, DEGs)|log_2(FoldChange)|0和padj≤0.05总数为2 786个。相比于MDCK细胞,MDCK-G1细胞有967个基因的表达显著上升,1 819个基因的表达显著下降。差异基因通过基因本体(Gene Ontology, GO)数据库富集功能注释和京都基因和基因组数据库(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)进行通路分析发现,2株细胞在免疫调控和细胞生长周期调控上均存在差异,qRT-PCR验证的17个基因中有16个基因的表达趋势与转录组测序结果一致。结论 2株细胞的转录谱存在显著差异。     

轮状病毒感染患者外周血单个核细胞的转录组学分析

轮状病毒(Rotavirus,RV)是引起急性肠胃炎的主要病原体,分析RV感染患者的人外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中差异表达基因(Differentially expressed genes,DEGs)有利于探讨人PBMC在清除RV中的作用。为此,本研究采集2019年2月-2019年6月长春儿童医院中RV感染患者和健康儿童血液,分离PBMC,通过转录组测序(RNA sequencing,RNA-seq)技术比较RV感染患者与健康儿童之间的RNA表达图谱,借助基因本体论(Gene Ontology,GO)数据库功能富集分析、京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)、Reactome通路富集分析DEGs,使用实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,qPCR)技术进行验证。结果显示,与健康对照组相比,RV感染轻症患者PBMC中有1619个DEGs;重症患者PBMC中有2816个DEGs,主要与干扰素(Interferon,IFN)反应、中性粒细胞、溶酶体、核小体、染色质等相关。qPCR验证轻症患者干扰素刺激基因(IFN-stimulated genes,ISGs)15表达上调,白介素(Interleukin,IL)1β表达下调;重症患者IL15、ISG15表达上调,IL1β表达下调,与转录组结果相一致。本研究提示,RV感染可能激活人I型和II型IFNs反应抵御病毒感染,但也会抑制溶酶体相关基因,对细胞自噬过程产生影响。     

CRISPR/Cas9技术介导的稳定沉默LDHA表达对肺癌A549细胞增殖的影响

目的:利用CRISPR/Cas9技术构建稳定沉默乳酸脱氢酶A(LDHA)的A549细胞系,并探讨LDHA沉默对细胞增殖能力的影响。方法:构建特异性靶向LDHA基因的CRISPR/Cas9系统重组载体p X260-LDHA,转染A549细胞后经嘌呤霉素筛选获得LDHA沉默的稳定细胞株,并用定量PCR和免疫印迹实验分别检测LDHA m RNA和蛋白的沉默效率。利用MTT法检测A549细胞的增殖情况。结果:测序结果证实,CRISPR/Cas9系统重组载体p X260-LDHA构建成功;筛选出LDHA沉默A549细胞株,定量PCR和免疫印迹实验证实LDHA m RNA和蛋白的表达量均明显下调。MTT法证实:培养24,48,72h后,LDHA沉默A549细胞与对照细胞相比,其增殖被抑制。结论:转染靶向LDHA基因的CRISPR/Cas9系统重组载体,可明显下调LDHA m RNA和蛋白表达,抑制肺癌细胞A549的增殖。     

干扰NSUN2通过调控细胞周期蛋白表达抑制黑素瘤细胞增殖

为探讨太阳结构域家族蛋白酶2(NOP2/Sun RNA methyltransferase 2, Nsun2)RNA甲基化酶在黑素瘤细胞中的生物学功能,本研究以小鼠黑素瘤B16细胞为对象,构建靶向干扰Nsun2基因的shRNA慢病毒干扰载体,包装病毒后感染B16细胞。与对照组相比,干扰组细胞中Nsun2的敲低效率达到80%。EdU染色结果表明,干扰Nsun2显著抑制B16细胞DNA合成能力。转录物组测序技术系统分析干扰组与对照组细胞基因表达水平,共筛选获得1 062个差异表达基因(DEGs),其中678个表达上调,384个表达下调。DEGs主要富集在染色体、着丝粒区、蛋白质结合等GO条目。KEGG分析表明,DEGs显著富集在细胞周期、DNA复制、细胞衰老等通路。荧光定量PCR和转录物组测序结果均发现,Cdk2、Ccna2、Cdc25b等促进细胞分裂的相关基因显著下调,而Gadd45g和Gadd45a等阻滞细胞增殖的基因显著上调。本研究表明,NSUN2通过调控细胞周期和DNA复制等生物学过程,影响黑素瘤细胞增殖,为黑素瘤发生和发展的分子机制研究提供参考。     

α-硫辛酸作用肺癌细胞的转录组分析

为了获得α-LA作用肺癌细胞后的转录组数据库和差异表达基因,我们将A549细胞处理组和对照组作为测试样品,采用Illumina Hi Seq TM2000测序技术进行转录组测序,并进行系统的生物信息学分析。对照组和处理组两两比较共获得6 748个差异表达基因。GO(gene ontology)分类分析表明,差异表达基因属于细胞组分、分子功能和生物学过程的46个类别。KEGG Pathway显著性富集分析提示差异表达基因共涉及15条途径,包括肿瘤相关通路、内质网蛋白加工、细胞周期、核糖体、剪接体等相关途径。对α-LA作用肺癌细胞的转录组进行拼接、组装和功能注释,得到大量转录本信息,为探究α-LA作用肺癌细胞后基因差异表达及相关分子机制提供了宝贵的基因组数据库资源。     

GWGS芯片整合分析识别外周血细胞中与骨质疏松症相关的枢纽基因

为了对骨质疏松症基因芯片数据集进行整合分析并识别出外周血细胞中与骨质疏松症相关的枢纽基因,通过检索GEO和ArrayExpress数据库获得骨质疏松症相关的表达谱芯片数据集;运用GWGS (genome-wide global significance)方法对纳入的数据集进行整合分析,筛选出差异表达基因(differentially expressed genes, DEGs);然后,运用GO (gene ontology)富集分析和KEGG (kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路富集分析对差异表达基因进行功能注释,并建立蛋白质相互作用(protein-protein interaction, PPI)网络,筛选出骨质疏松症相关的枢纽基因。公共数据库检索得到3个符合纳入排除标准的研究集, GWGS整合分析筛选出排序前200的DEGs,这些基因主要富集的GO条目为脂多糖的细胞反应、凋亡过程和炎症反应,与骨质疏松症相关的KEGG富集通路为破骨细胞分化等。PPI分析进一步检测到与骨质疏松症相关的10个枢纽基因,其中9个基因已有研究报道和骨质疏松症的发生发展相关,而ELANE基因还未有研究报道与骨质疏松症有关。ELANE基因同时在人的骨髓组织、小鼠骨髓和骨组织中高表达,这个基因很可能与骨质疏松症有潜在的联系。本研究的结果将有助于进一步理解骨质疏松症的分子致病机理。     

FKBP12真核表达载体的构建及稳定转染A549细胞株的建立

目的:构建FK506结合蛋白12(FK506 binding proteins 12,FKBP12)真核表达载体并建立稳定转染A549细胞株。方法:RT-PCR扩增人平滑肌细胞FKBP12基因片断,构建pcDNA3.1/Hygro(+)-FKBP12真核表达载体,经琼脂糖电泳、特异性内切酶切割及测序验证其正确性。脂质体法转染真核细胞A549,HygromycinB筛选建立稳定转染的细胞株,免疫印迹法检测稳定转染的细胞株。结果:构建了FKBP12真核表达载体并建立了稳定转染的A549细胞株,成功表达FKBP12蛋白。结论:FKBP12真核表达载体成功构建及稳定转染A549细胞株的建立,为深入研究基于FKBP12靶点药物的机制奠定基础,进而为探索安全、高效的免疫抑制剂提供新的途径。     

肾纤维化关键基因的生信筛选及分析

[目的]利用生物信息学技术筛选与肾纤维化相关基因，并预测与基因相关通路，疾病、细胞类型和有关药物。[方法]在公共基因芯片数据库(GEO)中获取与肾纤维化相关三个基因数据集，利用Venn图鉴定出共表达的差异基因，Metascape工具对差异基因进行功能(GO)和通路富集(KEGG)分析，还利用STRING构建蛋白相互作用网络(PPI)网络以及可视化工具Cytoscape筛选关键基因，最后用及Enrichr和Comparative Toxicogenomics Database(CTD)数据分析有关疾病、细胞类型和药物。[结果]与肾纤维化相关的数据集GSE148420、GSE38117、GSE54441经Venn图共得到83个DEGs。经Cytoscape对STRING工具得到的PPI网络可视化后，筛选出10个与肾纤维化相关的关键基因，分别是F13B、ALDH8A1、A1CF、PAH、KMO、ALDH6A1、SPP2、ACAT1、ABAT、CAT。GO和KEGG富集显示这些基因与氧化还原酶活性，血小板致密颗粒，色氨酸、结氨酸、亮氨酸和异亮氨酸等氨基酸代谢通路有关。利用Enrichr和CTD...     

基于转录组测序的宁夏枸杞不同品种果实活性成分合成差异表达基因分析

为探究不同品种宁夏枸杞果实活性成分生物合成相关基因的表达水平,筛选关键差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs),揭示宁夏枸杞品种间活性成分含量差异的分子机制,本研究采用Illumina NovaSeq 6000高通量测序技术,对宁夏枸杞‘宁杞1号’和‘宁杞7号’青果期、转色期及成熟期果实进行转录组测序,比较2个品种果实不同发育期相关基因表达谱的变化。结果显示:转录组测序共获得811818178条clean reads,有121.76 Gb有效数据。‘宁杞1号’和‘宁杞7号’在青果期、转色期和成熟期差异表达基因分别有2827、2552和2311个;分别有2153、2050和1825个差异基因在基因本体论(gene ontology,GO)、京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)富集分析和同源蛋白簇(clusters of orthologous groups of proteins,KOG)分析等6个数据库中被成功注释。青果期、转色期和成熟期果实的差异表达基因,在GO数据库分别有1307、865和624个被富集到生物学过程、细胞组分及分子功能3个部分中;KEGG通路富集结果均集中在代谢途径、次生代谢物生物合成和植物-病原互作过程;在KOG数据库,3个发育期分别注释了1775、1751和1541个差异表达基因。对注释的基因进行PubMed数据库检索,在青果期、转色期和成熟期分别筛选到与枸杞活性成分合成相关的差异表达基因18、26和24个,这些基因主要参与类胡萝卜素、类黄酮、萜类、生物碱和维生素等代谢途径。选取7个差异表达基因进行RT-qPCR验证,结果与转录组测序数据表达趋势一致。本研究从转录水平为不同品种宁夏枸杞活性成分含量差异提供了初步证据,为进一步挖掘枸杞活性成分生物合成的关键基因及解析其表达调控机制提供了研究基础。     

SUSD2基因干扰表达载体的构建及在A549细胞中鉴定北大核心

[目的]构建SUSD2基因短发夹RNA(shRNA)的表达载体,并在人非小细胞肺癌(NSCLC)A549细胞中鉴定。[方法]设计合成SUSD2基因shRNA片段,连接到经Bam HⅠ和EcoRⅠ双酶切的psi-m H1 shRNA载体中,构建干扰表达载体psi-m H1-SUSD2 shRNA,酶切后测序鉴定;将干扰载体psi-m H1-SUSD2 shRNA转染A549细胞,荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western Blot法检测干扰载体的干扰效率。[结果]酶切和测序结果显示成功构建了SUSD2基因shRNA的表达载体,q-PCR和Western Blot结果显示最佳干扰载体可使SUSD2 mRNA相对表达量下调75%以上,并可明显抑制A549细胞中SUSD2蛋白的表达。[结论]成功构建了SUSD2基因干扰表达载体,并在A549细胞中有效干扰SUSD2基因的表达。     

人乳头状瘤病毒癌蛋白E6和E7双标记质粒的构建及应用

目的:构建人乳头状瘤病毒(human papillomavirus,HPV)-16 E6、E7癌蛋白及其突变型的双筛选标记质粒并筛选出稳定表达HPV-16癌蛋白的肺癌A549细胞株。方法:以携带新霉素抗性基因neo的pEGFP质粒(pEGFP-N1)为空载体,在EcoRⅠ和BamHⅠ位点间插入HPV-16 E6、E7及其突变型基因。新构建的质粒鉴定后转染A549细胞并用G418筛选,多次挑取单克隆后用流式细胞仪分选带荧光的细胞。结果:PCR、双酶切鉴定结果及DNA序列测定结果均证实质粒构建正确;PCR扩增结果显示细胞中存在目的基因;流式细胞术结果显示细胞阳性率高;Western blotting结果显示细胞能表达HPV-16 E6、HPV-16 E7蛋白。结论:成功构建pEGFP-E6、E7质粒并筛选出稳定表达E6和E7癌蛋白的A549细胞株,为进一步研究HPV对肺癌的影响奠定了基础;同时发现G418筛选结合流式细胞仪分选可提高稳定转染细胞的阳性率。     

基于转录组的肝豆状核变性调控网络的构建和分析

本研究旨在利用生物信息学方法构建经铜诱导的ATP7B基因敲除HepG2细胞系的转录调控网络。探讨关键转录因子在肝豆状核变性发生、发展中的潜在作用机制。收集公共基因表达数据库(gene expression omnibus, GEO)中包含野生型、ATP7B基因敲除型、铜诱导的野生型和铜诱导的ATP7B基因敲除型HepG2细胞系数据。筛选由铜诱导产生的差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs)后进行基因本体论(gene ontology,GO)、京都基因和基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)富集分析。基于蛋白相互作用网络,识别疾病关键基因和功能模块,并对关键功能模块中的基因进行富集分析。最后,构建转录调控网络,筛选核心转录因子。共筛选出1 034个差异表达基因,其中上调525个,下调509个。上、下调关键功能模块分别包括了3785个和3931个基因。关键功能模块中的基因主要定位于细胞-基质连接、染色体、剪接复合体、核糖体等区域,共同参与了mRNA加工、组蛋白修饰、RNA剪切...