梓醇对氧糖剥夺诱导PC1 2 细胞凋亡的保护作用

目的：观察梓醇对氧糖剥夺（OGD）诱导PC12细胞凋亡的保护作用。方法：采用Hoechst 33258 DNA染色法,四甲基偶氮唑盐（MTT）检测细胞活性;化学比色法测定乳酸脱氢酶（LDH）的释放量,用流式细胞技术检测细胞凋亡比例以及P53和Bcl-2蛋白。结果：OGD可导致PC12细胞活力明显下降,LDH释放量增加、P53蛋白表达上升,Bcl-2蛋白表达下降。梓醇可明显改善细胞形态结构,显著降低LDH释放量、降低P53蛋白的表达,提高Bcl-2蛋白的表达,降低细胞凋亡率。结论：梓醇通过调节细胞凋亡相关基因的表达而抑制细胞凋亡。     

siRNA沉默SIRT1基因对宫颈癌细胞HeLa增殖和凋亡的影响

化学合成靶向SIRT1基因的小干扰RNA,脂质体法转染人宫颈癌细胞株HeLa,观察小干扰RNA沉默SIRT1基因对HeLa增殖及细胞凋亡的影响。在优化siRNA SIRT1转染条件的基础上,应用RT-PCR和Western blot分别检测各组SIRT1 mRNA、SIRT1蛋白及凋亡相关蛋白的表达;CCK-8法检测细胞增殖抑制率;Hoechst荧光染色法和流式细胞仪检测细胞凋亡。结果表明,siRNA SIRT1转染细胞组SIRT1 mRNA水平和蛋白表达量明显低于对照组;siRNA SIRT1转染组细胞增殖受抑制,细胞凋亡率明显增加;凋亡相关蛋白P53、P21表达上调,Survivin表达下调。上述结果表明:siRNA SIRT1诱导的HeLa细胞凋亡与P53、P21、Survivin通路关系密切,但siRNA SIRT1诱导HeLa细胞凋亡的详尽机制有待进一步研究。     

黄连素预处理对6-羟基多巴胺所致PC12细胞损伤的影响

目的:观察黄连素(Berberine,BBR)预处理对6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)诱导的PC12细胞的影响,并探讨二型超氧化物歧化酶(Mn-SOD,SOD2)是否介导了BBR的保护作用。方法:将PC12细胞分为5组,分别为正常培养的对照组(Control)、25μM的6-OHDA损伤组、1μM的BBR预处理24 h组(BBR+6-OHDA)、SOD2-siRNA干扰组(SOD2-siRNA+BBR+6-OHDA)和乱序siRNA处理组(SC-siRNA+BBR+6-OHDA),孵育24 h后,采用噻唑蓝法(Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide,MTT)检测细胞活力,试剂盒检测培养基乳酸脱氢酶(Lactic Dehydrogenase,LDH)、细胞内活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)、还原型谷胱甘肽(Glutathione,GSH)和过氧化氢酶(Catalase,CAT)的含量,使用流式细胞仪检测凋亡率,Western blot检测SOD2和凋亡蛋白Cleaved caspase-3的表达。结果:与Control组相比,6-OHDA诱导PC12细胞24 h后,细胞活力显著降低,SOD2表达、GSH和CAT的含量明显减少,培养基上清液LDH活力、细胞凋亡率、Cleaved caspase-3表达和ROS水平显著增加(P<0.05),而BBR预处理可显著恢复6-OHDA诱导的PC12细胞活力、SOD2表达、GSH和CAT水平,并降低细胞凋亡率、凋亡蛋白表达和细胞ROS水平(P<0.05),而SOD2-siRNA显著逆转了BBR预处理产生的上述保护作用(P<0.05),SC-siRNA则未对BBR预处理产生的上述作用造成明显影响(P>0.05)。结论:黄连素预处理可减轻6-OHDA诱导的PC12细胞损伤,而SOD2分子介导了BBR预处理对暴露于6-OHDA的PC12细胞的保护作用。     

KDR靶向RNA干扰对MCF一7细胞凋亡的影响

目的：研究KDR靶向RNA干扰对MCF-7细胞凋亡的影响,探讨其可能的机制。方法：采用阳离子脂质体Lipofecta．mine2000TM作为转染试剂将人KDR基因的siRNA转染人类乳腺细胞株MCF-7,诱RNAi,采用Hoechst33258染色和半定量RT—PCR检测Caspase-3、survivin的mRNA表达及细胞凋亡变化;比色法检测Caspase．3的活性;利用免疫组织化学方法检测survivin的表达,并用图像分析仪分析蛋白表达强度。结果：靶向KDR的siRNA转染MCF-7后,Caspase-3的mRNA表达上调,survivin基因mRNA及蛋白表达水平下调（P〈0．05）。结论：KDRsiRNA通过减少乳腺癌细胞survivin的表达,增加Caspase．3表达来促进肿瘤细胞凋亡,发挥其抗肿瘤作用。     

siRNA沉默Survivin基因对鼻咽癌CNE-2细胞凋亡的影响

合成Survivin小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)序列,用于转染人鼻咽癌细胞株CNE2,体外观察Survivin siRNA转染后CNE-2细胞Survivin mRNA、蛋白的表达、细胞增殖和凋亡情况。设计合成3段特异性Survivin siRNA,用siRNA转染鼻咽癌CNE-2细胞株,设置空白对照和阴性对照组,通过Real-time PCR检测CNE-2细胞的Survivin mRNA相对表达量,Western blotting检测Survivin蛋白的表达,流式细胞术及原位细胞凋亡检测转染后细胞凋亡情况。siRNA转染CNE-2细胞后,siRNA 1组和3组mRNA表达抑制率分别为(68.46±7.94)%、(49.44±3.78)%,siRNA 2组结果无显著差异(p0.05)。蛋白相对表达量只有siRNA 1组降低,表达抑制率为(30.61±2.47)%,流式细胞术和原位细胞凋亡检测转染后CNE-2细胞数量明显降低,细胞凋亡比例增高。siRNA干扰沉默Survivin基因能有效抑制CNE-2细胞的增殖和诱导细胞凋亡。本研究为Survivin基因可能作为治疗鼻咽癌的一个靶点,为Survivin基因沉默可能是治疗鼻咽癌高效的途径提供体外实验支持。     

小干扰RNA靶向EGFR基因逆转卵巢癌细胞顺铂耐药的研究

目的：探讨载体表达的小干扰RNA（siRNA）影响卵巢癌耐药细胞株EGFR基因的表达并逆转其顺铂耐药的可行性。方法：体外构建EGFR小发卡状RNA（shRNA）的表达质粒,脂质体法介导将其转染入SKOV3/DDP细胞。实验分为正常对照组、空质粒转染组、非特异性转染组和特异性转染组。采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测EGFR mRNA的表达;使用免疫细胞化学法（ICC）检测EGFR蛋白的表达;使用四甲基偶氮唑蓝法（MTT）测定各组细胞对顺铂的半数抑制浓度（IC50）。结果：EGFR shRNA转染组细胞EGFR mRNA的表达与其他两组相比明显减弱（P〈0.01）,EGFR蛋白表达明显下调（P〈0.01）;顺铂敏感性比正常对照组提高了约2.5倍。结论：针对EGFR合成的siRNA能够有效地抑制EGFR mRNA和蛋白的表达,并能恢复其对顺铂的敏感性。应用RNAi技术,能够逆转卵巢癌细胞对化疗药物的耐药性。     

HAX-1抑制过氧化氢诱发的乳腺癌细胞MCF-7凋亡

目的：应用RNA干扰（RNAi）技术特异地干扰HAX-1在乳腺癌细胞MCF-7中的表达,研究其在过氧化氢诱导的细胞凋亡中的作用。方法：应用载体pSR-GFP／Neo构建针对HAX-1基因的小干扰RNA（siRNA）表达质粒;转染MCF-7细胞,G418筛选稳定细胞系,Western blot鉴定筛选的细胞克隆;用流式细胞仪检测筛选的细胞系在过氧化氢条件下的凋亡率。结果：电泳和测序证实合成的siRNA序列正确并准确克隆到pSR-GFP／Neo载体中;Western blot证实获得MCF-7／HAX-1 siRNA稳定细胞株,其HAX-1蛋白水平降低95％左右;用1mmol／L过氧化氢处理获得的稳定细胞株8h,细胞凋亡率明显高于对照组。结论：HAX-1能够保护乳腺癌细胞MCF-7免于过氧化氢诱导的细胞凋亡。     

抗结缔组织生长因子特异性小干扰RNA的设计、合成及筛选

目的 设计和合成针对抗肝纤维化关键基因抗结缔组织生长因子（connective tissue growth factor,CTGF）的特异性小干扰RNA（siRNA）,并筛选高效的CTGF siRNA抗肝纤维化序列.方法 参照siRNA设计原则,应用RNA在线设计软件,设计3段RNA干扰候选序列,分别转染正常干细胞株（L-02）,以转染非特异性siRNA（与CTGF mRNA无同源性）作为对照,应用Western 印迹检测L-02细胞CTGF蛋白质表达.结果 与对照相比,转染siRNA的L-02细胞CTGF蛋白表达明显下调,且siCTGF-1、siCTGF-2、siCTGF-3各片段干扰率分别为44.91 %、93.99 %、81.34%,其中以siCTGF-2干扰率最高,效果最明显.转染非特异性siRNA的L-02细胞CTGF蛋白表达无明显变化（P＜0.05）.结论 不同的CTGF siRNA对L-02细胞CTGF表达水平具有不同的干扰效能,成功合成能高效阻抑CTGF表达的CTGF siRNA,为进一步探索更特异、更有效的抗肝纤维化基因治疗这一新途径打下坚实基础.     

siRNA对肝纤维化的抑制作用

目的：研究肝星状细胞（use）中smad2特异性小干扰RNA（siRNA）对I型胶原表达的抑制作用,探讨抗肝纤维化的基因治疗新方法。方法：设计合成靶向Smad2基因的siRNA,将筛选成功的siRNA瞬时转染入体外培养的肝星状细胞（HSC）,并给予转化生长因子p（TGF．B）刺激,应用RT—PCR和Westernblot技术检测对照组与实验组I型胶原mRNA水平和蛋白水平表达差异,研究siRNA对I型胶原表达的抑制作用。结果：siRNA能明显降低肝星状细胞中Smad2的RNA和蛋白的表达水平,证实筛选的siRNA有效,能特异性抑制Smad2的基因表达;TGF-β刺激肝星状细胞后,与对照组比较,siRNA转染组细胞外基质（ECM）成分I型胶原的表达水平明显降低（P〈0．05）。结论：siRNA能够抑制TGFβ对肝星状细胞的激活,阻断TGFB—Smads传导通路,使I型胶原分泌下调,有效抑制TGFB诱导的肝纤维化。     

梓醇对Aβ损伤SH-SY5Y细胞BDNF表达的影响及机制研究

摘要 目的：探讨梓醇对β-淀粉样肽（β-amyloid, Aβ）损伤SH-SY5Y细胞脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor, BDNF）表达的影响及调节BDNF表达的机制。方法：以全反式维甲酸诱导分化的神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y为研究对象，研究梓醇对Aβ 损伤细胞的作用。采用MTT实验测定细胞存活率，ELISA测定BDNF的含量，Western blot检测转录因子cAMP反应元件结合蛋白（cAMP response element binding protein, CREB）及其活化形式磷酸化CREB（pCREB）表达量，RT-PCR测定BDNF mRNA及转录子的表达水平；用RNA干扰的方法阻断CREB表达后，用RT-PCR测定BDNF mRNA表达量的变化。结果：梓醇预保护提高Aβ损伤SH-SY5Y细胞的存活率，显著增加细胞培养上清中BDNF含量和胞内BDNF mRNA水平，促进BDNF转录子IV及其关键调节转录因子pCREB的表达，干扰CREB表达后，梓醇上调BDNF mRNA表达的作用部分消失。结论：梓醇可能通过上调CREB磷酸化促进BDNF的表达，从而发挥神经保护作用。     

依达拉奉对硝普钠诱导的PC12细胞凋亡的保护作用

目的：探讨依达拉奉对硝普钠诱导的PCI2细胞凋亡的影响。方法：体外培养PCI2细胞,并分为依达拉奉对硝普钠保护组（含500μmol／L硝普钠和75μmol／L依达拉奉）、硝普钠诱导组（含500μmol／L硝普钠）和对照组。采用MTT法检测细胞的增殖率：流式细胞术检测细胞的凋亡情况;Western-blot检i受4凋亡抑制蛋白Bcl-2和凋亡促进蛋白Bad的表达。结果：与对照组相比,硝普钠处理的PCI2细胞增殖率显著降低,而细胞凋亡率显著升高,细胞内Bcl-2的表达显著减少,而Bad的表显著增加,差异均具有统计学意义（P〈0．05）;与单纯硝普钠诱导组相比,依达拉奉处理组细的胞增殖率显著增加而细胞凋亡率显著减少,同时Bcl－2的表达显著增加,而Bad的表达明显减少,差异均具有统计学意义（P〈0．05）。结论：依达拉奉对硝普钠诱导的PCI2细胞凋亡具有抑制作用,可能通过增加Bcl-2的表达并降低Bad的表达发挥抗凋亡作用。     

siRNA抑制S100A4表达对卵巢癌细胞CP70生物学特性的影响

目的：探讨人卵巢癌顺铂耐药细胞株CP70沉默S100A4基因后,CP70细胞对顺铂敏感性、凋亡及细胞迁移的影响。方法：设计并合成S100A4基因特异性的siRNA并转染入卵巢癌细胞CP70,48 h后应用RT-PCR和Western Blot检测在mRNA和蛋白水平siRNA对S100A4的影响,MTT法检测转染siRNA后卵巢癌细胞CP70对顺铂敏感性的变化。用流式细胞术检测顺铂（40μM）对转染S100A4 siRNA后对卵巢癌细胞CP70凋亡的影响,Transwell法观察siRNA抑制S100A4后对卵巢癌CP70迁移能力的影响。结果：与空白对照组、阴性对照组相比,S100A4siRNA转染组CP70细胞的S100A4基因和蛋白表达降低（P〈0.01）。MTT法检测顺铂敏感性发现S100A4 siRNA转染组CP70细胞顺铂敏感性增强。在顺铂刺激下,siRNA转染组细胞凋亡率高于其他各组,差异具有统计学意义（P〈0.05）。Transwell发现CP70细胞迁移能力明显下降（P〈0.05）。结论：S100A4 siRNA能够明显抑制CP70细胞S100A4的表达,从而增强细胞对顺铂的敏感性,促进细胞凋亡,减弱细胞的迁移能力。S100A4有望成为逆转卵巢癌铂类耐药的治疗靶点。     

褪黑素通过提高p53和Fas的表达促进小鼠肝癌H22细胞凋亡

目的：研究褪黑素（MLT）对小鼠肝癌细胞株H22的促凋亡作用及其机理。方法：采用丫啶橙（AO）染色、培养液乳酸脱氢酶（LDH）活性检测和流式细胞术（FCM）观察MLT的促凋亡作用;采用RT-PCR方法检测MLT处理前后细胞的p53 mRNA、Fas mRNA的水平。结果：AO染色后H22细胞呈现明显核浓缩的凋亡形态;培养液LDH活性检测及FCM分析均提示MLT诱导H22细胞发生凋亡;RT-PCR结果显示p53、Fas表达增强。结论：MLT能促进H22细胞p53和Fas的表达,从而诱导细胞发生凋亡。     

mcl-1特异性siRNA对HepG2细胞增殖及凋亡的影响

目的：肝癌分子靶向治疗是目前研究的热点,肝癌相关基因mcl-1在肝癌增殖及凋亡中的作用尚不明确,本研究拟探讨mcl-1特异性siRNA对体外培养肝癌细胞HepG2增殖及凋亡的影响。方法：设计、合成有效的mcl-1特异性siRNA序列,体外转染HepG2细胞;通过绘制细胞生长曲线和MTT实验检测mcl-1特异性siRNA对HepG2细胞增殖的影响;通过AnnexinV／PI双标记流式细胞仪检测mcl-1特异性siRNA对HepG2细胞凋亡率的影响。结果：通过绘制细胞生长曲线发现,mcl-1特异性siRNA能够抑制HepG2细胞的增殖（P〈0．05）,MTT实验提示转染mcl-1特异性siRNA24h、48h、72h后,HepG2细胞存活率均显著下降（P〈O．05）;流式细胞仪检测分析发现,转染mcl．1特异性siRNA后AnnexinV＋／PI-细胞百分率显著增高（P〈0．01）,提示mcl-1具有促进HepG2细胞凋亡的作用。结论：Mcl-1蛋白具有促进肝癌细胞增殖,抑制肝癌细胞凋亡的作用,这种分子特性符合肿瘤靶向治疗的要求,Mcl-1可能成为肝癌靶向治疗的潜在靶点。     

酒精促PC12细胞凋亡及对神经鞘磷脂合酶表达和活性的影响

目的 观察酒精诱导PCI2细胞凋亡及其凋亡过程中神经鞘磷脂合酶活性和mRNA表达量的变化.方法 MTr法测定酒精对PCI2细胞增殖的抑制作用.Hoeelmt33258染色荧光显微镜观察PCI2细胞凋亡形态学变化.DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡梯状DNA条带.RT-PCR法检测酒精对PCI2细胞SMSI和SMS2 mRNA表达的影响.薄层层析法测定SMS的活性.结果 PCI2细胞去血清培养24 h,酒精浓度在100、200、400和800 mmoL/L时,细胞存活率分别是单纯去血清的87.54%、70.73%、57.89%和51.70%,表现出较强的细胞增殖抑制作用（P〈0.05）;细胞核形态学变化显示酒精处理组凋亡细胞增多,表现染色质凝集,细胞核变小、核碎裂成碎片等典型细胞凋亡特征性变化,凋亡率随着酒精浓度的增大而升高,去血清组的酒精浓度为100、200和300 mmol/L时,细胞凋亡率呈剂量依赖关系;琼脂糖凝胶电泳可见酒精处理组有不同程度的DNA断裂,显示凋亡细胞典型的梯状DNA.RT-PCR检测酒精对PCI2细胞SMS转录水平结果显示,不同浓度酒精作用于PCI2细胞0.5 h,SMSI表达量无显著变化,当作用时间达1h和2 h,SMSl表达量显著增加,并呈剂量依赖性,而SMS2的mRNA表达则不受酒精作用的影响;薄层层析法检测细胞总SMS活性显示,不同浓度酒精作用2 h,细胞SMS活性随酒精浓度增加而升高.结论 酒精可导致PCI2细胞凋亡并与酒精浓度呈正相关.酒精致PCI2细胞凋亡过程中SMSl的mRNA表达量增高,酶活性增强,提示酒精致PCI2细胞凋亡作用与鞘磷脂循环有关.     

siRNA抑制c—myc基因的表达对宫颈癌细胞增殖的影响

目的：利用siRNA（small interference RNA）技术研究C-myc基因的对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响。方法：依据Promega公司在网上提供的设计软件,设计针对C-myc基因的siRNA,合成DNA模板,体外转录合成siRNA。通过阳离子聚合物jet—SITM—ENDO将合成的siRNA转染入HeLa细胞,以未转染细胞以及错义序列siRNA—scr转染细胞为对照。用细胞计数法检测siRNA对HeLa细胞增殖的影响。流式细胞法检测细胞周期及蛋白表达的变化,RT—PCR法比较转染前后C-myc mRNA表达水平的变化。结果：细胞计数法结果显示,转染24h后c-myc基因siRNA明显抑制MCF-7细胞增殖,转染48h后,抑制效率稳定。c-myc基因siRNA转染后能有效地抑制HeLa细胞的增殖,阻滞细胞周期于G0／G1期,siRNA转染组c-myc mRNA、蛋白的表达量明显低于空白对照组、错义序列组。结论：体外转录合成的siRNA可有效降低HeLa细胞c-myc基因的表达,抑制细胞增殖。     

Survivin和RhoA双基因沉默对卵巢癌细胞的增殖与侵袭影响

目的：探讨RNA干扰（RNAi）双向沉默Survivin和RhoA基因表达对人卵巢癌H08910PM细胞增殖、凋亡及侵袭能力的影响。方法：构建Survivin和RhoA基因的串联microRNA干扰载体（Survivin-RhoA-microRNA）,通过脂质体介导转染人卵巢癌H08910PM细胞作为实验组,对照组为空载体转染组。转染48小时后,RT—PCR检测Survivin和RhoA的mRNA表达,Western．Blot检测Survivin和RhoA的蛋白质表达;利用MTT法、Transwell小室体外侵袭实验及流式细胞术检测转染后卵巢癌细胞的增殖、侵袭及凋亡情况。结果：Survivin—RhoA—microRNA明显抑制了H08910PM细胞中Survivin和RhoA基因mRNA和蛋白的表达：转染48小时后,实验组SurvivinmRNA和RhoAmRNA表达抑制率分别为68．82％、90．23％,Survivin和RhoA蛋白表达抑制率分别为63．91％、88．47％;MTT分析显示实验组细胞OD490的值为0．706±0．177,较对照组（1．172±0．241）明显降低,差异有统计学意义（P〈0．05）;流式细胞术检测实验组细胞凋亡率为36．41±3．34％,较对照组（2．92±0．78％）明显升高（P〈0．01）;实验组细胞侵袭百分比为12．56±6．17％,较对照组（32．96±5．14％）明显降低（P〈0．05）。结论：成功构建Survivin和RhoA串联microRNA干扰载体（Survivin．RhoA．microRNA）。Survivin和RhoA双基因沉默显著抑制了卵巢癌H08910PM细胞的增殖和侵袭能力,并增加其凋亡率,两者具有协同作用,为双靶点治疗卵巢癌提供了新的思路和策略。     

靶向PUMA的siRNA对缺氧/复氧诱导大鼠心肌细胞凋亡的保护作用

为探讨p53上调凋亡调制物(p53 up-regulated modulator of apoptosis,PUMA)在大鼠心肌细胞缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenatio,H/R)损伤中的作用,本研究将靶向PUMA的siRNA(si-PUMA)转染大鼠心肌细胞以建立PUMA沉默表达模型,观察其对心肌细胞H/R损伤的影响.RT-PCR和Western印迹结果表明,最适转染浓度50 nmol/L si-PUMA能靶向抑制H/R损伤心肌细胞的PUMA表达;MTT法检测心肌细胞存活率及培养基乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性测定结果发现,si-PUMA组细胞存活率较H/R 6 h模型组明显提高,培养液中LDH活性显著降低(P<0.01);分光光度法及Annexin V-FITC/PI联合染色流式细胞凋亡检测结果显示,si-PUMA组caspase-3活性较H/R 6h组明显下调,细胞凋亡率明显降低(P<0.01);RT-PCR结果提示,与H/R6 h组相比,si-PUMA组Bax及Bcl-2表达分别出现显著下调及上调(P<0.05).以上结果表明,靶向PUMA的siRN...     

抑制VEGF基因表达对乳腺癌细胞细胞周期的影响

目的：研究针对VEGF基因的siRNA（small interferenceRNA）对乳腺癌MCF-7细胞细胞周期的影响。方法：依据Promega公司在网上提供的设计软件,设计针对VEGF基因的siRNA,合成DNA模板,体外转录合成siRNA。脂质体转染法将合成的siRNA转染入MCF-7细胞,以未转染细胞以及错义序列siRNAscr转染细胞为对照。用细胞计数法检测siRNA对MCF-7细胞增殖的影响：流式细胞法检测细胞周期变化,RT—PCR法比较转染前后p21、CyclinDl表达水平的变化,Westemblot检测转染前后磷酸化ERK的表达。结果：细胞计数法结果显示,转染24h后siRNA明显抑制MCF-7细胞增殖,转染48h后,抑制效率稳定。siRNA转染后能有效地抑制MCF-7细胞的增殖,阻滞细胞周期于G0／G1期,S期细胞明显减少,G0／G1期细胞比例逐渐增多;p21mRNA表达显著上调,抑制CyclinD1mRNA及磷酸化ERK蛋白的表达。结论：体外转录合成的siRNA可能通过上调细胞周期蚤白激酶抑制剂p21的表达,下调CyclinDl及磷酸化ERK的表达,将细胞周期阻滞于G0／G1期,从而显著抑制MCF-7细胞的增殖。