拟南芥磷酸酶基因亚细胞定位与组织表达

通过克隆拟南芥磷酸酶PP2C家族基因At3g51370,构建了绿色荧光蛋白融合表达载体,用基因枪将构建好的载体轰击洋葱表皮细胞进行瞬时表达分析,发现该At3g51370基因表达蛋白定位在细胞核中;用实时定量PCR方法分析At3g51370基因的组织表达特性,发现该基因在花器官中的表达量明显高于其它组织.进一步构建了含At3g51370基因的启动子和GUS报告基因的植物表达载体,经农杆菌介导转化拟南芥,对转基因拟南芥进行GUS组织化学染色,分析该启动子在不同生长时期与不同组织中的转录活性,结果发现,在幼苗期At3g51370基因主要集中在根尖分生组织和顶端分生组织表达,在成年植株中则集中在生殖器官如花和果荚柄等部位表达,在光照和黑暗条件下,At3g51370基因的表达特性没有明显差异.研究表明,At3g51370可能与其它核定位的PP2C磷酸酶一样参与了基因表达的调控,可能在拟南芥早期发育阶段的细胞增值分裂相关信号转导途径中发挥功能,并在花器官的发育过程中行使功能,且不参与光信号转导.     

小鼠一个新基因mLPTS的克隆、表达及亚细胞定位

利用EST拼接技术,RT－PCR及DNA序列测定,首次成功克隆了小鼠新基因mLPTS。获得的mLPTS基因片段长1244bp,编剧了一个由332个氨基酸组成的蛋白质。该蛋白质与人的LPTS蛋白有78％的同源性,LPTS基因是本实验室通过定位候选克隆策略获得的一个新的肝癌相关基因。它在肝癌组织中不表达或低表达,并参与细胞生长的负调控。小鼠mLPTS基因在小鼠的各个组织中都有表达,与人LPTS基因的表达组织分布相同。分析比较了LPTS蛋白在不同物种间的序列同源性,发现LPTS在进化上是高度保守的,是一个具有重要功能的基因。将mLPTS基因与绿色荧光蛋白EGFP融合构建真核表达载体,在中国仓鼠卵CHO细胞中表达,发现mLPTS基因表达产物位于细胞核仁中,为进一步研究该基因的功能及作用途径提供了重要信息。     

香蕉MaBTB基因的表达分析及亚细胞定位

利用荧光定量PCR分析在不同处理下的香蕉采后果实中MaBTB基因的表达,在正常成熟的果实中,MaBTB基因的表达与乙烯的释放量呈正相关;相反,在1-MCP处理的香蕉果实中,该基因的表达相对变化不明显;用乙烯处理的香蕉果实,其表达量在第3天达到高峰,比正常成熟的早11 d。这些结果表明MaBTB基因在香蕉采后果实中是受乙烯诱导表达的。最后,亚细胞定位分析表明MaBTB基因定位在细胞核上。     

拟南芥3个蛋白磷酸酶2C基因编码蛋白的亚细胞定位及组织表达分析

利用gateway技术从拟南芥中克隆了3个蛋白磷酸酶2C基因At5G66080、At1G68410和At5G06750,3个基因的ORF全长分别为1 158 bp、1 311 bp和1 182 bp,分别编码一条385、376和393个氨基酸残基的多肽.构建了3个基因的植物表达载体35S:GFP:At5G66080、35S:GFP:At1G68410和35S:GFP:At5G06750,采用基因枪法进行的洋葱表皮细胞GFP瞬时表达实验表明,荧光信号主要分布在细胞核上,显示这3个基因的产物可能在细胞核上发挥作用.利用实时荧光定量PCR研究At5G66080、At1G68410和At5G06750基因在不同组织中的表达特性,结果表明:3个基因在各个器官均有表达,但表达量不同;At5G66080、At1G68410和At5G06750基因在花中表达量最大;At5G66080和At5G06750基因在根、叶和叶柄中的表达量次之,在茎中的表达量最低;At1G68410基因在根中的表达量次之,在茎、叶和叶柄中的表达量较低.     

斑马鱼IRF11基因的鉴定、亚细胞定位及表达特征

早期的研究表明IRF11是鱼类特有的IRF家族成员。查询最近解析的斑马鱼第九版基因组时,发现斑马鱼IRF1和IRF11命名出现了混乱。通过对脊椎动物IRF1和IRF11基因位点进行同线型分析表明,IRF11与IRF1是两个不同的基因,不宜命名为IRF1b和IRF1a。系统进化树分析发现,在脊椎动物中IRF11基因比IRF1起源更早;两栖类以后的脊椎动物基因组只有IRF1,没有IRF11,其中原因可能是因为基因丢失。斑马鱼IRF11与脊椎动物IRF1一样,其表达蛋白定位在细胞核中。缺失分析揭示斑马鱼IRF11的DBD有一个能引导蛋白定位进入细胞核的序列。表达分析发现poly（I:C）能诱导斑马鱼IRF11的表达,但其表达水平低于IRF1。     

酵母蛋白质相互作用与基因表达谱和亚细胞定位的相关性

研究酵母（yeast）蛋白质相互作用与基因表达谱和蛋白质亚细胞定位的关系.首先,构建了蛋白质相互作用正样本集、负样本集、随机组对负样本集和混合样本集.然后,对于4个数据集中的所有蛋白质对,通过比较它们的基于距离的基因共表达的分布以及它们中具有已知亚细胞定位的蛋白质对的共定位出现率,实现了这些高通量数据的交叉量化分析.结果揭示,与非相互作用蛋白质对相比,相互作用蛋白质对的基因表达谱具有较高的相似性;相互作用蛋白质对更倾向于具有相同的亚细胞定位.结果还揭示出这些蛋白质特征相关的总体趋势.     

粉葛PtCHI基因的克隆、原核表达和亚细胞定位

为探究葛根品种间异黄酮类物质代谢关键酶基因PtCHI的分子机制差异，并揭示其品种间异黄酮物质含量差异的原因，该研究以野葛品种‘桂葛8号’和粉葛品种‘桂葛1号’为材料，经乙醇提取并通过高效液相色谱仪对野葛和粉葛中葛根素和总黄酮的含量进行测定，基于已报道的野葛CHI基因，通过同源克隆方法分离粉葛中PtCHI基因，并在体外进行蛋白表达，同时在拟南芥原生质体中研究PtCHI基因的定位。结果表明：(1)野葛中的葛根素含量显著高于粉葛的，野葛的总黄酮含量也高于粉葛但未达到显著水平。(2)成功分离到粉葛PtCHI基因，长度为742 bp且包含672 bp完整的ORF框，编码223个氨基酸，与野葛的CHI基因具有99%的同源性。(3)CHI基因在粉葛中的表达量为茎>根>叶子，在野葛中则为根>茎>叶子，除叶子外野葛中CHI基因的表达量均显著高于粉葛。(4)经预测，粉葛PtCHI蛋白为稳定的亲水性蛋白且大小为27.8 kD,二、三级结构以α-螺旋为主，具有25个磷酸化位点，与野葛、大豆和乌拉尔甘草的亲缘关系较近，与F3H2、F3H、4CL4、DFR2及CHS发生互作的可能性较大。(...     

杆状病毒Ac60基因的原核表达与亚细胞定位研究

用PCR方法从AcMNPV基因组中扩增到ORF60基因,插入原核表达载体pET-28a(+),构建pETAc60质粒,再将该质粒转化大肠埃希菌BL21,在IPTG诱导下表达了分子量约为16 ku的融合蛋白.用纯化的表达产物免疫新西兰大白兔制备了多克隆抗体,应用该抗体检测了AcMNPV感染的昆虫宿主细胞(Si9)中ORF60基因的表达,结果显示:在感染后的细胞中有2条分子量分别约为33 ku和17 ku蛋白质带能与所制备的抗体发生特异性反应.间接免疫荧光分析发现:在病毒感染的晚期,Ac60蛋白同时存在于所感染宿主的细胞核和细胞质中.     

GAS41蛋白的表达、抗体制备及其亚细胞定位

GAS41是新发现的与神经胶质瘤密切相关的基因。为了对该基因进行深入的功能研究,成功地将GAS41基因构建于原核表达载体pQE—N3,转化BL21（DE3）获得融合表达产物。对含融合蛋白的包含体进行溶解和复性,通过免疫新西兰大白兔获得兔抗GAS41多克隆抗体。采用Western印迹技术,用该抗体检测GAS41基因的原核和真核表达产物,证明该抗体有较好的针对GAS41蛋白的专一性,可用于对GAS41的结构和功能研究。同时,用该抗体通过荧光免疫细胞进行定位分析发现,GAS41蛋白均匀分布于COS7细胞的细胞核中,提示GAS41可能是一个重要的转录因子。     

小麦铝胁迫基因TaAIP的克隆表达分析及亚细胞定位

以小麦抗逆相关蛋白TaMAPK2作为诱饵,利用酵母双杂交系统进行筛库,获得互作蛋白TaAIP。氨基酸序列分析发现TaAIP具有wali保守区,并且与一些物种的铝诱导蛋白相似。实时荧光定量PCR分析显示,TaAIP基因受到铝、干旱以及高盐胁迫上调表达。半定量RT-PCR结果表明,TaAIP在小麦茎中表达,在根部、叶片以及花中没有表达。亚细胞定位实验发现,TaAIP定位在细胞膜上。这些结果为深入分析TaAIP的抗逆性作用机理打下基础。     

牛Sry亚细胞定位及其对Sox9基因表达的影响

为鉴别牛Sry基因的下游目的基因,并确定Sry蛋白在细胞内的定位区域, 本试验构建pcDNA3.1-Sry表达载体和pEGFP-N1-Sry亚细胞定位表达载体, 在原代培养的生殖嵴细胞和卵巢颗粒细胞中进行Sry过表达,并对性别控制相关基因在Sry过表达前后的表达水平变化进行检测,包括Sf1 (Steroidogenic fator-1)、Gata4 (GATA binding protein 4)、Wt1 (Wilms'tumor gene)、Sox9 (Sry-related HMG box-9)、Amh (Anti Mullerian Hormone)和Dax1 (Dosage sensitive sex reversal locus-1);并在两种细胞中进行了Sry亚细胞定位研究.Sry在两种细胞中过表达后,在生殖嵴细胞中Sox9的表达水平被显著上调,但在卵巢颗粒细胞中未观察到Sox9基因被上调,而其他几个基因的表达水平未受Sry影响;亚细胞定位结果表明牛Sry主要分布在细胞核内.本试验说明牛Sry可能间接调控Sox9表达,或存在其他不需要Sry参与的调控通路调控Sox9表达;牛Sry蛋白起转录因子作用.     

羊口疮024基因的表达、多抗制备及亚细胞定位

目的 克隆表达羊口疮病毒（Orf virus,ORFV）024基因,制备多克隆抗体,检测其免疫原性,并对其进行亚细胞定位分析。方法 根据GenBank中羊口疮病毒024基因序列设计引物,进行PCR扩增。将其亚克隆至表达载体,构建原核重组质粒pGEX-6P-1-024以及真核重组质粒pEGFP-N1-024。将原核重组质粒转化Rosetta(DE3)细胞,IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定024蛋白的表达情况。纯化后的024蛋白免疫BALB/c雌鼠,获得血清并制备多克隆抗体,进行Western-blot分析。将构建的真核质粒转染MDBK细胞,24 h后通过免疫荧光观察其在细胞中的表达及亚细胞定位。结果 SDS-PAGE结果表明,羊口疮病毒024基因在Rosetta(DE3)细胞中正确表达,大小为59 kDa。Western-blot结果表明024蛋白能与制备的多抗发生特异性反应,具有良好的反应原性。荧光显微镜下结果表明024蛋白转染MDBK细胞后主要在细胞质中表达。结论 本实验为后续深入研究ORFV 024基因功能和致病机制奠定了基础。     

杜仲MVA和MEP途径相关基因的亚细胞定位与表达分析

通过对杜仲基因组分析,筛选并克隆出MVA途径和MEP途径的相关基因全长（EuDXR,EuMCT,EuCMK,EuMDS,EuACOT,EuHMGS和EuHMGR）,并通过生物信息学方法分析其结构特征,结果表明上述基因与其他已知物种相应基因的相似度达73%~85%。通过构建亚细胞定位表达载体,并瞬时转化烟草下表皮细胞后激光共聚焦显微镜下观察显示,EuDXR,EuMCT,EuCMK,EuMDS基因编码蛋白定位于叶绿体,EuACOT和EuHMGR基因编码蛋白定位于内质网,EuHMGS基因编码蛋白定位于细胞质膜。利用转录组测序技术分析上述基因的时空表达特性表明,MEP途径相关基因在杜仲叶片中大量表达,而MVA途径相关基因在杜仲幼果中大量表达,且杜仲幼果比叶片中的橡胶含量高,因此,推断MVA途径在杜仲橡胶合成中占主导作用。     

copine V蛋白的亚细胞定位

目的：确定copine V蛋白的亚细胞定位,初步研究该蛋白的生物学功能.方法：将copine V编码区基因分别构建真核表达载体pEGFP-copine V（或pRED-copine V）,转染HEK293、HeLa细胞,在激光共聚焦荧光显微镜下与转染空载体pEGFP-N1（或pRED-N1）的细胞比较观察.结果：经限制性内切酶分析鉴定,构建的重组表达载体正确.通过激光共聚焦荧光显微镜观察,转染了重组载体pEGFP-copine V的细胞荧光信号集中分布于胞膜和内膜系统;进一步研究表明copine V定位于内质网而非线粒体,而空载体则在整个细胞中均匀分布.结论：copine V蛋白定位于细胞膜和内质网上,而不定位于线粒体.     

高羊茅春化基因FaVRN1亚细胞定位与差异表达分析

高羊茅在生长季出现生殖枝,抑制新枝形成,不利于草坪质量及其持久性生长.研究春化基因的分子特征,探索抑制生殖生长的分子育种新途径,对坪用型高羊茅品种改良具有重要意义.本研究在克隆高羊茅春化基因FaVRN1的基础上,构建高羊茅春化基因FaVRN1与绿色荧光蛋白基因GFP融合的植物表达载体p-FaVRN1-hGFP,利用基因枪转化法转入洋葱表皮细胞,荧光显微镜检测融合基因的瞬时表达,并运用实时荧光定量PCR分析春化基因FaVRN1在春化与非春化条件下的表达差异.研究结果表明,FaVRN1基因编码的蛋白产物位于细胞核,符合它作为转录因子特性;春化条件下,FaVRN1基因的表达随处理时间延长逐渐增加.非春化条件下,FaVRN1基因的表达随处理时间延长而降低.FaVRN1基因在春化条件下的表达水平远高于非春化条件,FaVRN1基因的表达受春化条件正调控.     

FAM92A1-289基因的真核表达载体构建和亚细胞定位

利用PCR方法扩增FAM92A1-289全长,经BamH I和Xho I酶切后连接入pEGFP-N1真核表达载体,构建pEGFP-N1-FAM92A1-289重组表达质粒,转染Hela细胞,利用荧光显微镜观察FAM92A1-289在细胞中的定位。经双酶切和核酸序列分析证实重组质粒包含有正确编码的FAM92A1-289读码框。荧光显微镜观察到空质粒pEGFP-N1转染后,整个细胞内弥散绿色荧光,而转染pEGFP-N1-FAM92A1-289重组载体后,可见绿色荧光分布于Hela细胞核中,显示FAM92A1-289定位于细胞核。成功构建人FAM92A1-289真核表达载体,FAM92A1-289定位于哺乳细胞的细胞核中。     

copine Ⅴ蛋白的亚细胞定位

目的:确定copineⅤ蛋白的亚细胞定位,初步研究该蛋白的生物学功能。方法:将copineⅤ编码区基因分别构建真核表达载体pEGFP-copineⅤ(或pRED-copineⅤ),转染HEK293、HeLa细胞,在激光共聚焦荧光显微镜下与转染空载体pEGFP-N1(或pRED-N1)的细胞比较观察。结果:经限制性内切酶分析鉴定,构建的重组表达载体正确。通过激光共聚焦荧光显微镜观察,转染了重组载体pEGFP-copineⅤ的细胞荧光信号集中分布于胞膜和内膜系统;进一步研究表明copineⅤ定位于内质网而非线粒体,而空载体则在整个细胞中均匀分布。结论:copineⅤ蛋白定位于细胞膜和内质网上,而不定位于线粒体。     

新麦草IPT基因亚细胞定位、过表达载体构建及鉴定

摘要：为了验证IPT基因在新麦草中的功能,研究以DT型和ST型的新麦草分蘖节为材料,通过RNA-seq分析和qRT-PCR试验验证IPT的相对表达量并进行GO富集分析,采用PCR法克隆IPT基因,构建1300-cYFP-IPT过表达载体,并进行生物信息学分析;通过烟草瞬时转染法和蛋白质印迹法鉴定IPT蛋白的亚细胞定位及表达情况。结果显示：IPT与tRNA二甲基烯丙基转移酶活性相关,在新麦草分蘖中起上调作用;克隆得到新麦草IPT基因全长,并构建了1300-cYFP-IPT过表达载体,其开放阅读框（ORF）为1362bp;多序列比对与保守结构域分析表明,新麦草IPT蛋白存在PLN02840蛋白保守结构域,与二粒小麦、小麦及硬粒小麦IPT蛋白的亲缘关系较近;蛋白质二级结构预测显示新麦草IPT蛋白二级结构由α-螺旋、延伸链、β-折叠和不规则卷曲组成;分析显示丝氨酸的磷酸化位点最有可能是蛋白发挥功能的潜在磷酸化位点;烟草瞬时转染显示IPT蛋白正常表达,定位于叶绿体中;Western blot结果显示连接载体的目的蛋白IPT正常表达,大小为76.8kDa。研究表明IPT基因在新麦草分蘖过程中上调分蘖数,1300-cYFP-IPT载体可在植株叶绿体中正常表达;该研究为后续新麦草IPT基因进一步功能验证提供试验材料和理论依据。