p21 RNAi的pSUPER载体的构建及功能鉴定

目的:构建抑制p21基因表达的pSUPER RNAi载体(pSUPER-p21)并鉴定其功能.方法:化学合成一对编码短发夹RNA序列的、靶向大鼠p21基因的寡核苷酸链,各60个碱基,退火,克隆到经Bg1 Ⅱ、HindⅢ双酶切的pSUPER质粒上,构建重组RNAi质粒(pSUPER-p21).通过双酶切鉴定及测序分析验证构建效果.将正确构建的质粒转染大鼠原代培养皮质神经元,western blotting检测经红藻氨酸处理的神经元中p21蛋白表达.结果:pSUPER-p21载体经双酶切鉴定及测序分析,结果表明60个碱基成功插入到预计位点,并且序列完全一致.Western blotting结果证实pSUPER-p21载体可特异性抑制红藻氨酸诱导的原代培养皮质神经元中p21蛋白表达的上调.结论:靶向p21的pSUPER RNAi载体构建成功,该载体可特异性抑制p21基因表达.     

PTEN RNA干扰载体pSUPER的构建及功能鉴定

目的:构建抑制PTEN基因表达的pSUPER RNA干扰(RNAi)载体pSUPER PTEN并鉴定其功能。方法:化学合成一对编码短发夹RNA序列,靶向细胞PTEN基因的寡核苷酸链,退火,克隆到经BglⅡ、HindⅢ双酶切的pSU-PER质粒上,构建重组RNAi质粒pSUPER PTEN,通过双酶切鉴定及测序分析验证构建效果;将构建正确的质粒转染肝癌HepG2细胞,免疫印迹和qPCR检测HepG2中PTEN的表达及其对AKT信号通路的影响。结果:双酶切鉴定及测序结果分析表明碱基成功插入pSUPER PTEN载体指定位点,同时序列一致;免疫印迹结果证明pSUPER PTEN载体可抑制HepG2细胞中PTEN的表达,并且提高AKT的磷酸化水平。结论:靶向PTEN的pSUPER PTEN载体构建成功,该载体能够特异性抑制PTEN基因的表达。     

红藻氨酸诱导原代培养皮质神经元兴奋毒中p21变化及机制的研究

目的：探讨p21在红藻氨酸诱导的原代培养皮质神经元兴奋毒中的变化及可能机制。方法：原代培养大鼠皮质神经元经红藻氨酸（KA）处理24h后,激光共聚焦显微镜透射光下观察细胞损伤,应用Western blotting方法检测p21与p53蛋白表达的变化,用染色质免疫共沉淀（ChIP）-聚合酶链反应（PCR）方法检测p53与p21基因启动子上p53反应元件1结合情况。结果：KA处理后神经元明显损伤,部分细胞胞体缩小、变圆,突起变短、减少或消失,p21与p53蛋白表达上调,并且p53与p21基因启动子上的p53反应元件1结合增加。结论：在KA诱导的原代培养皮质神经元兴奋毒作用中p21蛋白表达上调,而p53直接参与了p21的激活。     

人类成肌发育候选基因ASB12 RNAi稳定细胞系的构建与鉴定

目的:利用siRNA表达载体构建抑制人类成肌发育候选基因ASB12表达的pSUPER RNAi载体(pSU-PER-ASB12),筛选构建C2C12-pSUPER-ASB12稳定表达细胞系。方法:化学合成一对编码短发夹RNA序列的、靶向成肌发育候选基因ASB12的寡核苷酸链60个碱基,退火,克隆到经BglⅡ、XhoⅠ双酶切的pSUPER质粒上,构建重组RNAi质粒(pSUPER-ASB12)。通过酶切鉴定及测序分析检测构建效果。将正确构建的质粒转染小鼠骨骼肌细胞C2C12,通过G418筛选,免疫荧光检测,RT-PCR分析,建立稳定表达pSUPER-ASB12的细胞系C2C12-pSUPER-ASB12。结果:pSUPER-ASB12载体经酶切鉴定及测序分析,结果表明60个碱基成功插入到预计位点,并且序列完全一致。C2C12-pSUPER-ASB12稳定表达细胞系可表达绿色荧光蛋白,RT-PCR检测结果显示C2C12-pSUPER-ASB12细胞中ASB12表达量明显降低。结论:靶向ASB12的pSUPER RNAi载体和C2C12-pSUPER-ASB12稳定表达细胞系构建成功,为进一步从分子水平探讨ASB12在成肌发育中的功能奠定了基础。     

大鼠GluR2基因启动子控制的萤火虫荧光素酶表达载体的构建

目的构建大鼠GluR2基因启动子控制的萤火虫荧光素酶表达载体,并检测其在神经元中的表达。方法采用PCR方法获得GluR2基因启动子区目的片段（-298～＋283）,双酶切后插入到pGL3-Basic载体中构成重组表达载体,使萤火虫荧光素酶报告基因的表达受GluR2启动子控制。将构建的重组表达载体或pGL3-Basic载体分别与内参质粒pRL—CMV（表达海肾荧光素酶）共转染原代培养皮质神经元,24h后用双荧光检测试剂盒测定萤火虫荧光素酶及海肾荧光素酶活性。结果重组表达载体经双酶切及测序鉴定证明构建正确,该重组表达载体在神经元中特异性高表达萤火虫荧光素酶。结论成功构建大鼠GluR2基因启动子控制的萤火虫荧光素酶表达载体,并检测到该载体在神经元中的特异性表达。     

心脏发育候选基因PYGO1 RNAi逆转录病毒载体系统的构建与鉴定

利用RNA干扰技术构建PYGO1基因RNA干扰(RNAi)的真核表达质粒(pSUPER-PYGO1)。首先,针对PYGO1 cDNA序列设计并化学合成一对编码短发夹RNA序列,经退火插入到由BglⅡ和XhoⅠ酶切的pSU-PER质粒上构建重组RNAi质粒pSUPER-PYGO1。通过XbaⅠ酶切鉴定及测序分析验证构建效果,将正确构建的质粒转染大鼠心肌细胞系H9c2建立产生逆转录病毒的细胞克隆。通过RT-PCR和Western blot检测pSU-PER-PYGO1对H9c2细胞中PYGO1 mRNA和PYGO1蛋白的干扰效果。pSUPER-PYGO1质粒经酶切鉴定及测序分析,发现59nt寡核苷酸成功插入到预计位点,且序列完全一致;RT-PCR和Western blot检测结果显示转染pSUPER-PYGO1的细胞中PYGO1 mRNA和PYGO1蛋白量明显降低。因此,靶向PYGO1的pSUPER RNAi载体构建成功,为进一步从分子水平探讨PYGO1在心脏发育中的功能奠定了基础。     

Stathmin SiRNA表达载体抑制stathmin的表达

目的:构建stathmin特异性SiRNA质粒表达载体,探讨其对鼻咽癌5-8F细胞stathmin的沉默作用.方法:合成用于stathmin基因特异性干扰表达的DNA片段,经退火形成双链DNA片段,片段克隆到质粒表达载体pGenesil 1.1上.载体导入JM109菌株进行筛选与扩增,采用酶切和测序对克隆表达载体进行鉴定.应用脂质体将鉴定后的重组表达质粒载体转入鼻咽癌5 -8F细胞,RT-PCR与Western Blot分析stathmin基因表达.结果:经酶切和测序鉴定,插入SiRNA质粒表达载体的stathmin特异性碱基序列和方向正确.重组质粒表达载体转染鼻咽癌细胞后,细胞转染效率达78.8 ±6.8％,stathmin基因在鼻咽癌中的表达明显下降.结论:构建的stathmin基因SiRNA质粒表达载体能抑制stathmin的表达.     

人CD46 RNAi 逆转录病毒载体系统的构建与鉴定

目的:构建并筛选携带针对CD46基因的pSUPER retro RNAi逆转录病毒载体,从而特异、有效地抑制人CD46mRNA水平。方法:利用DNA重组技术,将2条60nt能转录产生靶向CD46小发夹RNA(shRNA)的寡核苷酸序列,定向克隆入逆转录病毒载体pSUPER retro,并转化大肠杆菌JM109。结果:重组载体经PCR及限制性内切酶酶切鉴定初步成功后送测序,结果表明序列正确。结论:特异性沉默CD46基因的pSUPER retro RNAi逆转录病毒载体构建成功,为后续转染Jurkat细胞,研究CD46在T细胞的信号转导中的作用奠定了基础,对进一步研究T细胞相关疾病及开展细胞免疫缺陷的治疗方面提供了新的思路与方向。     

重组穿梭质粒pAdTrack-CMV-Akt1构建及鉴定

目的:构建大鼠Akt1-p Ad Track-CMV腺病毒穿梭质粒并鉴定其蛋白表达。方法:提取SD大鼠海马总RNA,利用RT-PCR方法扩增大鼠Akt1的c DNAs,将其亚克隆入T载体,双酶切鉴定后将其与经过同样处理的腺病毒穿梭质粒载体p Ad Track-CMV连接,经酶切和测序进行鉴定。将p Ad TrackCMV-Akt1转染293细胞,免疫印迹鉴定Akt1的表达。结果:成功克隆出Akt1目的基因,并将其亚克隆入腺病毒穿梭载体p Ad Track-CMV。免疫印迹结果显示,转染p Ad Track-CMV-Akt1的细胞中能检测出Akt1的特异性条带。结论:成功构建重组大鼠Akt1腺病毒穿梭质粒,且其在真核细胞中能高效表达。     

大鼠瘦素基因重组腺相关病毒的构建及在原代神经元细胞中的过表达

目的构建携带大鼠瘦素(leptin)基因的重组腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV),并鉴定其在原代鼠神经元细胞中介导的瘦素过表达,为肥胖症基因治疗研究奠定实验基础。方法提取大鼠脂肪组织总RNA,利用RT-PCR技术,获取目的基因瘦素cDNA,通过重组DNA技术,得到瘦素cDNA与pGEM-T载体的重组质粒,阳性重组子用PCR及测序分析鉴定。用Spe I和EcoR V双酶切将pGEM-Leptin中的瘦素基因片段切出,再克隆到AAV2表达质粒pTR-UF22中,构建瘦素重组AAV2载体pAAV2-CBA-leptin。以pDG作为辅助质粒用HEK293细胞包装AAV2-CBA-Leptin,并用一步重力流柱法纯化病毒,由荧光定量PCR测定病毒基因组DNA的拷贝数即为病毒滴度。然后将AAV2-CBA-Leptin及对照病毒AAV2-CBA-EGFP感染大鼠原代神经元细胞,分别用免疫染色和Western blotting鉴定外源基因在神经元的表达。结果测序证实瘦素基因与GenBank提供的原始序列完全一致。重组载体经酶切鉴定与预期结果完全一致,HEK293细胞包装病毒效果良好,得到滴度为1.5×1012vg/mL纯化的重组瘦素病毒AAV2-CBA-Leptin。Western blotting检测显示AAV2-CBA-Leptin能介导瘦素在大鼠神经元细胞中过表达,并随着病毒量的增加而增强。AAV2-CBA-EGFP感染鼠神经元细胞5d后95%左右的细胞有明显的绿色荧光,免疫染色和DAPI核酸染色显示荧光细胞均为神经元而神经胶质细胞无荧光。结论成功构建并包装了瘦素重组AAV2病毒并可介导瘦素在神经元细胞中高效、特异表达,从而为研究瘦素在中枢神经系统控制体重和糖尿病等方面的功能及基因治疗研究打下基础。     

核磷蛋白NPM1的RNA干扰慢病毒载体的构建及鉴定简

目的：构建高效抑制核磷蛋白NPMl基因的短发夹RNA（shRNA）干扰载体。方法：以人NPM1基因为靶序列,设计并合成shRNA序列,将其连入RNA干扰慢病毒载体p113．7;酶切鉴定插入shRNA序列片段的质粒,经测序正确后转染293T细胞;Western印迹检测得到抑制效果好的载体pll-shRNA,将其-9慢病毒载体共转染293T细胞,进行病毒的包装,将得到的病毒感染HTl080细胞,通过RT-PCR、Western印迹等方法验证其抑制效果。结果：酶切证实构建的载体pll-shRNA中已插入外源基因片段,转染293T细胞后都有抑制效果,其中pll-shRNA2的抑制效果最好;用pll-shRNA2病毒感染HTl080细胞,RT-PCR和Western印迹检测分别在RNA和蛋白质水平证实NPMl的表达显著降低。结论：构建的RNA干扰载体pll-shRNA2能有效抑制NPMl的表达,为NPMl功能的研究提供了有力工具。     

FXYD6 shRNA表达载体的构建及其在体外对胰腺癌细胞增殖的影响

目的：构建FXYD6短发夹RNA（shRNA）表达载体,体外评价其对胰腺癌细胞sw1990的增殖与FXYD6蛋白表达的抑制效果。方法：基于microRNA mir-30天然结构,设计表达4对FXYD6 shRNA的互补DNA序列,克隆入pCGM30质粒载体,连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α,PCR法筛选阳性克隆,经酶切和基因测序鉴定;利用LipofectAMINE2000将pCGM30-FXYD6shRNA转染至胰腺癌细胞sw1990,MTT法检测转染后胰腺癌细胞增殖的变化,Western blot检测胰腺癌细胞中FXYD6蛋白表达水平的变化。结果：设计合成了4对表达FXYD6 shRNA的互补DNA序列,构建了4个表达FXYD6 shRNA的重组质粒;基因测序证实shRNA编码序列与设计的片段完全一致,酶切鉴定证实载体构建成功;体外实验表明,转染胰腺癌细胞sw1990的增殖能力和FXYD6蛋白表达水平明显降低（P〈0．05）,FXYD6蛋白表达水平随时间延长逐渐降低（P〈O．01）,但细胞增殖能力无明显变化（P〉0．05）。结论：构建了4个表达FXYD6 shRNA的重组质粒载体,可有效抑制FXYD6的表达;抑制胰腺癌细胞sw1990中FXYD6的表达可以抑制细胞的增殖,提示FXYD6可能是一个具有潜在临床应用价值的基因治疗靶点。     

重组人胱抑素C的原核表达及鉴定

目的构建重组人胱抑素C（cystatinC,CysC）的原核高效表达质粒,诱导表达并纯化获得CysC重组蛋白。方法根据大肠埃希菌编码蛋白的特性设计CysC编码基因序列,人工合成目的基因克隆至pET-22b（＋）表达载体中,测序及酶切鉴定正确后诱导其在大肠埃希菌BL21中表达,所获得的包涵体蛋白经亲和层析纯化后采用SDS—PAGE及Western印迹鉴定。结果酶切结果证实构建的表达质粒结构正确;测序结果显示克隆的基因序列所编码的蛋白与GenBank中的CysC氨基酸序列相符;SDS-PAGE及Western印迹结果证实获得的重组CysC融合蛋白分子量约为16kD,经NP亲和层析纯化获得纯度大于90％的目的蛋白。结论建立了重组人CysC的原核高效表达系统并获得了CysC重组蛋白。     

乙型肝炎病毒X基因真核表达载体的构建及表达

目的:构建含有天然完整的乙型肝炎病毒(HBV)X基因序列的真核表达载体,观察其在肝癌细胞株中的表达。方法:设计并合成HBV X基因的引物,用PCR方法从含完整HBV全基因的HepG2细胞中扩增X基因序列,并将其连接到真核表达载体pVAX-1上,酶切、PCR鉴定;用Triton X-114去除质粒内毒素后,采用电穿孔法将重组质粒pVAX-HBV X和空质粒pVAX-1分别转染SMMC-7721细胞,RT-PCR法检测HBV X基因mRNA的表达,Western印迹鉴定HBV X蛋白(HBx)的表达。结果:酶切和PCR鉴定证实pVAX-HBV X载体中包含完整的HBVX基因片段,该重组质粒转染的SMMC-7721细胞中HBV X基因mRNA及HBx蛋白的表达稳定。结论:构建了HBV X基因的真核表达载体,为X基因及其编码蛋白的生物学功能的研究提供了可靠的基因材料。     

人胱硫醚β合成酶原核表达纯化及鉴定

目的：构建人胱硫醚β合成酶（human cystathionineβ-synthase,hCBS）基因原核表达载体,在E.coli BL21（DE3）中表达,并进行纯化和酶活性检测。方法：以胰腺细胞cDNA文库为模板,采用聚合酶链式反应（PCR）扩增hCBS基因蛋白编码区的全序列,克隆入原核表达载体pET32a（＋）,构建重组质粒pET32a（＋）-hCBS。经限制性内切酶双酶切及DNA序列分析鉴定目的基因后与人CBS基因（基因bank号：BT007154.1）完全一致,转入E.coli BL21（DE3）中,由IPTG诱导表达融合蛋白。结果：经SDS-PAGE、Western blot分析,证明诱导表达的蛋白为重组人CBS（rhCBS）。再由Ni-NTA树脂亲和层析,并脱盐冷冻干燥后获得重组rhCBS（约19 mg/L培养物）,并测得其比活力约为57 kU/g。结论：成功地表达纯化出具有功能活性的重组蛋白rhCBS,为进一步研究该酶的相互作用蛋白以及其在生物学和临床科学的作用奠定了基础。     

大鼠CXCR4基因RNAi慢病毒载体的构建及其在骨髓间质干细胞中的表达

为深入研究CXCR4在骨髓间质干细胞(MSCs)体内迁移中的作用, 构建CXCR4基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体并实现其在大鼠MSCs (rMSCs)中表达。根据大鼠CXCR4 mRNA序列, 设计并合成包含各靶序列的互补DNA链,插入pSUPER载体的H1 RNA启动子后面, 产生pRiCXCR4, 将其中的CXCR4 shRNA表达结构酶切插入慢病毒载体质粒pNL-EGFP, 产生pNL-RiCXCR4-EGFP。在脂质体介导下与包装质粒pHELPER和包膜质粒pVSVG共转染293T细胞, 包装生产慢病毒,测定慢病毒功能滴度。慢病毒转导rMSCs后, 用Real-time RT-PCR、Western blotting和流式细胞术检测RNAi组(CXCR4a、CXCR4b和CXCR4c)、空载体组(Mock)和对照组(Control)中CXCR4表达情况。结果显示, 酶切和测序证实pRiCXCR4质粒构建正确, 产生能同时表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和CXCR4 shRNA的慢病毒载体质粒pNL-RiCXCR4-EGFP, 未浓缩和浓缩慢病毒悬液的功能滴度分别为6.4×104TU/mL和6.9×106TU/mL。慢病毒转导rMSCs 48 h后, 与空载体组和空白组相比, 3个RNAi组均不同程度抑制CXCR4表达, CXCR4b-MSC组在mRNA水平抑制了95.6%, 抑制作用最明显。大鼠CXCR4基因RNAi慢病毒载体构建成功, 为深入研究CXCR4在rMSCs向损伤组织定向迁移的作用奠定了基础。