他克莫司对HaCaT细胞NF-kB表达的影响

目的:探讨他克莫司对HaCaT细胞中NF-kB分子表达的影响.方法:培养人HaCaT细胞,分别与10 μ mol.l-1和50 μ mol.l-1他克莫司溶液共孵育后,通过RT-PCR和Western-blot方法,分别从基因和蛋白水平,观察NF-kB分子表达的变化.结果:经10 μ mol.l-1和50 μ mol.l-1的他克莫司(FK506)溶液孵育后,HaCaT细胞中NF-kB分子表达明显低于对照组,同时体现一定的剂量效应,50 μ mol.l-1组的表达水平更低.结论:他克莫司可以剂量依赖性地抑制HaCaT细胞中NF-kB的分子表达.     

核因子-κB在HUVEC细胞凋亡信号通路中的作用

目的：探讨核因子-κB（NF-κB）在人脐静脉内皮细胞凋亡信号通路中的作用。方法：体外培养人脐静脉内皮细胞系（HUVEC）,实验分为正常对照组、AngⅡ组和Gliotoxin干预组。应用改良MTF法,观察0．01μmol／L、0．1μmol／L、μmol／L和10μmol／L4种浓度的AngⅡ在不同时间对HUVEC细胞活性的影响。应用DNA凝胶电泳和流式细胞术检测AngⅡ作用于细胞后引起细胞凋亡的情况。应用免疫细胞化学技术检测NF-κB p65的核移位,评价NF-KB活化情况。结果：10μmol／L AngⅡ作用于细胞24h时,细胞活性下降,DNA凝胶电泳和流式细胞结果提示细胞发生凋亡,凋亡细胞率明显高于正常对照组,差异具有统计学意义（P〈0．05）,0．1mg／L Gliotoxin可拮抗AngⅡ的细胞抑制活性作用;免疫细胞化学技术显示,HUVEC细胞经AugⅡ诱导后,NF-κB出现明显核移位现象,提示NF-κB发生活化;Gliotoxin明显抑制NF-κB活化,与AngⅡ组相比,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论：①ArcⅡ可引起HU—VEC细胞发生凋亡;而NF-κB特异性抑制剂Ghotoxin能够拮抗AngⅡ对HUVEC细胞的作用;②NF-κB可能是AngⅡ调控HUVEC细胞生存／凋亡通路中的重要信号转导分子。     

CREB和NF-κB在p38MAPK所致脊髓星形胶质细胞活化中的作用（英文）

目的：探讨CREB和NF-κB在p38MAPK所致脊髓星形胶质细胞活化中的作用,明确脊髓星形胶质细胞活化中p38MAPK细胞信号转导途径的作用。方法：分离培养SPF大鼠脊髓星形胶质细胞,设正常组、SP刺激组（SP组,10-7mol/L）、SP刺激＋SB203580（10μmol/L）阻断p38MAPK组（SP＋SB组）、SP刺激＋PD98059（10μmol/L）阻断CREB组（SP＋PD组）、SP刺激＋SN50（10μmol/L）阻断NF-κB（SP＋SN组）。WB法、免疫荧光法、ELISA法检测12 h和24 h时p-p38、p-CREB、NF-κBp65水平及GFAP、TNF-、IL-1β水平变化。结果：SP组脊髓星形胶质细胞p-p38、p-CREB、NF-κBp65显著升高,GFAP水平显著增高,同时TNF-和IL-1β水平显著增高。与SP组比较,用SB203580阻断p38MAPK通路后,SP＋SB组p-p38、p-CREB、NF-κBp65显著降低,GFAP、TNF-和IL-1β水平显著降低。用PD98059阻断CREB通路后,SP＋PD组p-p38、NF-κBp65无显著变化,p-CREB显著降低,GFAP水平降低,同时TNF-和IL-1β水平降低。用SN50阻断NF-κB通路后,SP＋SN组p-p38、p-CREB无显著变化,NF-κBp65显著降低,GFAP水平降低,同时TNF-和IL-1β水平降低。结论：体外培养中,SP刺激后脊髓星形胶质细胞显著活化,p38MAPK活化后通过CREB及NF-κB信号途径导致胶质细胞炎性因子水平显著升高。     

一种有效的小鼠气道内siRNA给药方式模型建立

目的建立一种有效的哮喘小鼠气道内siRNA给药方式。方法雌性BALB／c小鼠以卵蛋白致敏法建立哮喘小鼠模型后,以NF-κB（p50）基因为靶基因,通过自制雾化器分别将NF-κB siRNA（20μmol／L,100μL／只）溶液及相同浓度的非干扰siRNA溶液分别雾化注射入实验组和对照组小鼠气道内。给药后,处死小鼠取肺组织,通过荧光定量PCR检测NF-κB基因表达变化,确定该给药方式的有效性。结果通过直接气道内雾化给药的方式能显著降低NF—KB基因表达水平（NF-κB下调1．743倍,P=0．0035）。结论采用气道直接雾化给药的方法能有效降低靶基因的表达。     

布地奈德对A549细胞胸腺基质淋巴细胞生成素表达作用的研究

目的:观察细胞因子刺激气道上皮细胞胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)表达是否涉及核因子κB(NF-κB),并探讨糖皮质激素布地奈德对气道上皮细胞TSLP表达和NF-κB核转位的影响.方法:A549细胞与细胞因子白介素1β(IL-1β)、白介素4(IL-4)和布地奈德共同孵育,以不加任何细胞因子或布地奈德培养的A549细胞为对照组,采用RT-PCR方法测定TSLP mRNA表达,细胞免疫荧光方法检测TSLP和NF-κB的表达情况.结果:与对照组比较,IL-1β(10 ng/ml)及IL-4(10 ng/ml)显著刺激A549细胞TSLP mRNA表达,且NF-κB(p65)核转住增加(均P＜0.05).布地奈德干预后TSLP mRNA的表达和NF-κB(p65)的核转位显著减少(P＜0.05).结论:细胞因子促进气道上皮细胞诱导性表达TSLP与NF-κB激活有关,抑制TSLP表达和NF-κB激活可能是布地奈德治疗哮喘的重要机制.     

黄芩苷对脂多糖诱导的巨噬细胞NF-κB活化和炎症因子表达的影响

目的:研究黄芩苷对脂多糖(LPS)诱导小鼠巨噬细胞核因子κB(NF-κB)及肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素6(IL-6)表达的影响.方法:分别用LPS(终浓度1μgomL-1)和LPs+黄芩苷(终浓度10,50,100μmol moloL-1)处理生长良好的小鼠巨噬细胞RAW264.7,用RT-PCR法和Elisa法检测细胞及其上清液中TNF-α、IL-6 mRNA和蛋白的表达变化,用Western Blot法检测细胞核内NF-κB p65蛋白含量变化.结果:LPS刺激RAW264.7细胞可导致NF-κB激活,上调TNF-α、IL-6表达;黄芩苷预处理能降低LPS诱导的NF-κB出活化和TNF-α、IL-6表达.结论:黄芩苷可通过抑制NF-κB活化,下调LPS诱导的巨噬细胞TNF-α、IL-6的生成,发挥抗炎作用.这可能是其抗动脉粥样硬化的作用机制之一.     

NF-κBp50参与IL-4在THP-1细胞中诱导DC-SIGN的表达

树突状细胞表面特异的胞间黏附分子3捕获非整合素(DC-specific intercellular adhesion molecule-3-grabbing nonintegrin,DC-SIGN)是树突状细胞表面特异的蛋白,在抗原呈递过程中起关键作用.这种特异性的表达和DC-SIGN的调节机制有关.到目前为止,DC-SIGN表达调控的机制还不是很清楚.IL-4是诱导DC-SIGN表达的最重要的细胞因子之一,而NF-κB是调控细胞信号转导的一个重要调控因子,两者都和DC-SIGN的表达调节相关.研究了IL-4和NF-κB对DC-SIGN启动子活性、对DC-SIGN表达的影响以及IL-4和NF-κB之间相互作用的关系.发现:DC-SIGN启动子中NF-κB位点缺失可以使DC-SIGN启动子活性下降大约50%,NF-κBp50可以促进DC-SIGN在THP-1细胞的表达,IL-在THP-1细胞诱导DC-SIGN表达的同时,也促进了NF-κBp50的表达.这些结果显示,在THP-1细胞中NF-κBp50参与IL-4诱导的DC-SIGN表达.     

CREB 和NF-κB在p38MAPK所致脊髓星形胶质细胞活化中的作用

目的:探讨CREB和NF-κB在p38MAPK所致脊髓星形胶质细胞活化中的作用,明确脊髓星形胶质细胞活化中p38MAPK细胞信号转导途径的作用。方法:分离培养SPF大鼠脊髓星形胶质细胞,设正常组、SP刺激组(SP组,10-7mol/L)、SP刺激+SB203580(10μmol/L)阻断p38MAPK组(SP+SB组)、SP刺激+PD98059(10μmol/L)阻断CREB组(SP+PD组)、SP刺激+SN50(10μmol/L)阻断NF-κB(SP+SN组)。WB法、免疫荧光法、ELISA法检测12 h和24 h时p-p38、p-CREB、NF-κBp65水平及GFAP、TNF-、IL-1β水平变化。结果:SP组脊髓星形胶质细胞p-p38、p-CREB、NF-κBp65显著升高,GFAP水平显著增高,同时TNF-和IL-1β水平显著增高。与SP组比较,用SB203580阻断p38MAPK通路后,SP+SB组p-p38、p-CREB、NF-κBp65显著降低,GFAP、TNF-和IL-1β水平显著降低。用PD98059阻断CREB通路后,SP+PD组p-p38、NF-κBp65无显著变化,p-CREB显著降...     

白藜芦醇对猪前体脂肪细胞凋亡的作用及机理

旨在研究白藜芦醇对猪前体脂肪细胞凋亡的作用,探讨其分子机制。以50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L、400 μmol/L白藜芦醇处理猪前体脂肪细胞,采用Hoechst 33258染色剂染色,光学和荧光显微镜分别观察细胞的形态学变化。semi-qRT-PCR和Western blotting方法检测凋亡相关基因sirt1、caspase-3、bcl-2、bax、p53、NF-κB的mRNA和蛋白的表达变化。结果表明,白藜芦醇处理后,前体脂肪细胞出现明显的细胞凋亡,伴随细胞体积缩小,染色质凝集,核质固缩等特征显现,与对照组相比200 μmol/L处理组细胞的凋亡率显著升高 (P＜0.05)。凋亡相关基因sirt1、caspase-3和bax的mRNA和蛋白表达水平显著上调 (P＜0.05),而bcl-2、p53、NF-κB等基因的表达水平明显下调 (P＜0.05)。进一步证实白藜芦醇特异性地增加sirt1的表达活性,而sirt1的上调影响caspase-3和bcl-2家族因子的活性,同时参与调控p53和NF-κB的转录表达。因此,推测sirt1调控凋亡相关因子表达是白藜芦醇诱导前体脂肪细胞凋亡的关键原因。     

二苯乙烯苷通过抑制NF-κB的激活减轻MPP＋诱导的PC12细胞凋亡

目的：探讨2,3,5,4＇-四羟基二苯乙烯-2-o-β-D-葡萄糖苷（2,3,5,4＇-tetrahydroxystibene-2-o-β-D-glucoside,TSG）对1-甲基-4-苯基吡啶离子（1-methy-4-phenylpyridinium,MPP＋）诱导PC12细胞凋亡的影响及其可能机制。方法：四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色试验检测PC12细胞活性;Hoechst33258染色法测定细胞凋亡;Westernblotting检测NF-κB（P65）和IκBα蛋白的表达。结果：MPP＋（300μmol/L）作用于PC12细胞24h后,与正常对照组比较,细胞存活率降低（53.3±3.4%）（P〈0.01）;细胞染色质固缩,细胞核呈致密浓染。TSG（1,5,10μmol/L）预处理24h后,细胞存活率增加（60.8±1.9%）,（70.1±1.8%）（P〈0.01）,（81.2±1.9%）（P〈0.01）;细胞核凝聚明显减少,且具有量一效关系。另外,MPP＋可使PC12细胞核中NF-κB（P65）蛋白表达升高,细胞浆中IκBα蛋白表达降低;与MPP＋处理组细胞相比,TSG预处理后,PC12细胞核中高表达的NF-κB（P65）蛋白水平明显降低,细胞浆中低表达的IκBα蛋白水平升高。结论：TSG对MPP＋诱导的PC12细胞凋亡具有浓度依赖性的抑制作用,其作用机制可能与抑制NF-κB的激活有关。     

甘油三酯代谢对紫外线照射后HaCaT细胞的影响及机制研究

目的:研究甘油三酯代谢过程对紫外线照射后HaCaT细胞的影响及机制研究。方法:HaCaT细胞分为4组,分别为对照组、紫外线照射组、紫外线照射并予甘油三酯组、紫外线照射并予甘油三酯合成酶抑制剂TOFA组,查看MMP-1、COX-2和IL-1β在mRNA及蛋白水平上的变化,并查看其上游转录因子NF-κB/IκB的表达情况。结果:1)甘油三酯可以抑制紫外线照射后细胞外基质溶解蛋白MMP-1的表达(P0.05)。2)甘油三酯可以抑制紫外线照射后炎症相关蛋白COX-2和IL-1β的表达(P0.05)。3)甘油三酯合成酶抑制剂TOFA可以增强外线照射后细胞外基质溶解蛋白MMP-1以及炎症相关蛋白COX-2和IL-1β的表达(P0.05)。4)其调节过程可能通过NF-κB/IκB信号传导通路实现(P0.05)。结论:甘油三酯对紫外线的照射后的HaCaT细胞有保护作用,若抑制其代谢将减弱其保护作用。     

内毒素引起的乳鼠心肌细胞血红素加氧酶—1基因的表达

为了探讨在内毒素作用下的乳鼠心肌细胞（neonatal rat cardiomyocytes,NRCMs）血红素加氧酶－1（heme oxygenase-1,HO-1）基因的表达及其在细胞损伤中的作用,分别用10、30及50μg/ml的脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）,10μg/ml LPS 10μmol/ml锌原卟啉Ⅸ（Zn-protoporphyrin-Ⅸ,ZnPPⅨ）和单纯10μmol/ml ZnPPⅨ与培养的NRCMs共同孵育6h,以及10μg/ml LPS与NRCMs共同孵育9h和18h。分别观察细胞HO－1 mRNA表达、MDA含量、LDH释放量与台盼蓝摄取率的变化。结果显示,同样与细胞孵育6h,LPS10μg/ml时HO－1 mRNA表达比对照组增加81.2％,30μg/ml时表达量增加126.3％,50μg/ml时表达量增加92.8％;LPS为10μg/ml时,孵育9h后HO－1 mRNA的表达量比对照组增加93.6％,孵育18h后一增加105.8％。LPS30、50μg/ml,10μg/ml LPS＋10μmol/ml ZnPPⅨ与细胞孵育6h及LPS 10μg/ml孵育18h后,细胞MDA含量、LDH释放量与台盼蓝摄取率明显增加（P＜0.01）;单纯10μg/ml LPS与单纯10μmol/ml ZnPPⅨ孵育6h后,上述指标均无明显升高。结果表明,LPS可诱导NRCMs HO－1 mRNA的表达,且在较低LPS剂量范围内具有时间依赖性和浓度依赖性;NRCMs HO-1 mRNA的表达可减低LPS引起的细胞损伤,这可能是细胞产生的一种自身保护性反应。     

矿化液和地塞米松增强大鼠原代骨髓基质细胞NF-κB受体活化剂配体的表达

NF-κB受体活化剂配体(receptoractivatorforNF-κBligand,RANKL)是调节破骨细胞生成的重要因子,它可在骨髓基质细胞中表达。矿化液(含10-8mol/L地塞米松、10mmol/Lβ-甘油磷酸钠、50μg/mlL-抗坏血酸)能够诱导骨髓基质细胞向成骨细胞分化,为探讨矿化液及其主要成分地塞米松对大鼠原代骨髓基质细胞表达RANKL的影响,采用矿化液培养原代大鼠骨髓基质细胞48h,通过免疫荧光染色观察RANKL的表达变化。结果显示矿化液和地塞米松在短期内均能增强鼠骨髓基质细胞RANKL的表达,提示地塞米松促进破骨细胞形成的分子机制可能与骨髓基质细胞RANKL表达的改变密切相关。     

5-烯丙基-7-二氟亚甲基白杨素（C19H14O4F2）诱导人卵巢癌CoC1细胞凋亡

目的 观察5-烯丙基-7-二氟亚甲基白杨素（ADFMChR）诱导人卵巢癌（CoCl）细胞凋亡的作用。方法 以体外培养的人卵巢癌CoCl为研究对象。采用软琼脂克隆测定ADFMChR对细胞集落的影响;流式细胞术（FCM）检测ADFMChR诱导细胞凋亡率;凝胶电泳观察ADFMChR诱导基因DNA梯形条带。Westernblot分析ADFMChR对CoCl细胞PPARγ,NF-κB,Bcl-2,Bax蛋白表达的影响。结果软琼脂克隆显示ADFMChR呈剂量依赖性抑制细胞集落形成;FCM分析发现ADFMChR呈剂量依赖性诱导细胞凋亡;ADFMChR（30μmol／L）孵育CoCl细胞48h后,DNA琼脂糖凝胶电泳呈现典型梯形条带。Westernblot分析结果表明ADFMChR以剂量依赖方式上调CoCl细胞PPARγ和Bax蛋白表达,下调NF-κB和Bcl-2蛋白表达。结论 ADFMChR诱导人卵巢癌CoCl细胞凋亡与其活化PPARγ,抑制NF-κB表达和提高Bax／Bcl-2比值有关。     

乙肝病毒X蛋白通过NF-κB通路调节肝癌细胞迁移、侵袭的研究

慢性乙肝病毒感染是亚洲国家肝癌的常见病因,乙肝病毒所表达的乙肝病毒X蛋白(Hepatitis B virus X protein,HBx)是肝癌发生发展的重要推动因子。核因子-κB(Nuclear factorκB,NF-κB)是模式识别受体下游重要的转录因子,肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor,HGF)/c-Met途径能够促进NF-κB活化,并通过活化的NF-κB来调节肝癌细胞的迁移、侵袭等生物学环节。但HBx是否直接通过NF-κB通路来调节肝癌细胞的迁移、侵袭尚未明确。为探究HBx通过NF-κB通路调节肝癌细胞迁移、侵袭的作用,本研究采用培养肝癌HepG2细胞并分组,空白对照组用不含药物及质粒的DMEM处理,空白质粒组转染1.2μg的pcDNA3.1空白质粒,HBx质粒组转染不同浓度的HBx表达质粒pcDNA3.1-HBx,HBx+PDTC组转染1.2μg的HBx表达质粒pcDNA3.1-HBx并用含有50μmol/L PDTC的DMEM进行处理;皮下注射HepG2细胞建立移植瘤小鼠模型,称量移植瘤的质量。检测细胞迁移及侵袭活力、细胞及移植瘤中NF-κB通路分子、迁移基因、侵袭基因的表达。结果显示,与空白对照组、空白质粒组比较,HBx质粒组细胞中NF-κB、HGF、c-Met、N-cadherin、Vimentin、MMP2、MMP9的蛋白表达水平及相对愈合面积、侵袭数目均明显增多(P0.05);与HBx质粒组比较,HBx+PDTC组细胞中NF-κB、HGF、c-Met、N-cadherin、Vimentin、MMP2、MMP9的蛋白表达水平及相对愈合面积、侵袭数目均明显减少(P0.05);与空白对照组、空白质粒组比较,HBx质粒组移植瘤的质量及移植瘤中NF-κB、HGF、c-Met的蛋白表达水平明显增加(P0.05)。本研究得出结论,HBx能够促进肝癌细胞的迁移、侵袭,且该作用与激活NF-κB通路有关。     

二苯乙烯苷通过抑制NF-κB的激活减轻MPP+诱导 的PC12细胞凋亡

目的:探讨2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-o-β-D-葡萄糖苷(2,3,5,4’-tetrahydroxystibene-2-o-β-D-glucoside,TSG)对1-甲基-4-苯基吡啶离子(1-methy-4-phenylpyridinium,MPP+)诱导PC12细胞凋亡的影响及其可能机制。方法:四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色试验检测PC12细胞活性;Hoechst33258染色法测定细胞凋亡;Westernblotting检测NF-κB(P65)和IκBα蛋白的表达。结果:MPP+(300μmol/L)作用于PC12细胞24h后,与正常对照组比较,细胞存活率降低(53.3±3.4%)(P<0.01);细胞染色质固缩,细胞核呈致密浓染。TSG(1,5,10μmol/L)预处理24h后,细胞存活率增加(60.8±1.9%),(70.1±1.8%)(P<0.01),(81.2±1.9%)(P<0.01);细胞核凝聚明显减少,且具有量一效关系。另外,MPP+可使PC12细胞核中NF-κB(P65)蛋白表达升高,细胞浆中IκBα蛋白表达降低;与MPP+处理组细胞相比,TSG预处理后,PC12细胞核中高表达的NF-κB(P65)蛋白水平明显降低,细胞浆中低表达的IκBα蛋白水平升高。结论:TSG对MPP+诱导的PC12细胞凋亡具有浓度依赖性的抑制作用,其作用机制可能与抑制NF-κB的激活有关。     

甘草次酸抑制骨肉瘤细胞MG63增殖的NF-κB信号通路机制*

目的: 探讨甘草次酸抑制骨肉瘤细胞MG63增殖的机制。方法: 实验应用骨肉瘤细胞MG63作为研究对象,分5组。空白组、甘草次数组(50 μmol/L、100 μmol/L和200 μmol/L)、阳性对照组。每组6个复孔。空白组为不含有甘草次酸的DMEM的培养基,甘草次酸组分别加入50 μmol/L、100 μmol/L和200 μmol/L的甘草次酸,阳性对照组加入白藜芦醇(40 μmol/L)。将细胞接种于培养瓶内,当细胞进入生长平台期后使用0.1%的胰酶消化并按1×10⁶ cells/ml的密度接种于96孔板中,继续培养24 h。采用甲基四氮唑蓝检测细胞的增长率,Annexin V / PI双标记流式细胞术检测骨肉瘤细胞MG63的凋亡,蛋白质印迹法检测NF-κB蛋白的表达。结果: 与空白对照组相比,甘草次酸孵育24 h后,各组的骨肉瘤细胞G63增殖率明显降低 (P＜0.05)、凋亡细胞比例明显升高(P＜0.05);甘草次酸孵育48 h后,骨肉瘤细胞G63增殖率和NF-κB蛋白的相对表达量均明显降低(P＜0.05)、凋亡细胞比例明显升高(P＜0.05)。与阳性对照组比较,甘草次酸孵育24 h后,50 μmol/L甘草次酸组的细胞增殖率显著增高、100 μmol/L和200 μmol/L甘草次酸组的骨肉瘤细胞的增殖率显著降低(P＜0.05),甘草次酸孵育48 h后,50 μmol/L组和100 μmol/L组骨肉瘤细胞的增殖率显著升高,而200 μmol/组显著降低(P＜0.05);甘草次酸孵育24 h后,50 μmol/L、100 μmol/L和200 μmol/L组的骨肉瘤细胞的凋亡率均显著降低 (P＜0.05);而甘草次酸孵育48 h后,50 μmol/L、100 μmol/L组的骨肉瘤细胞的凋亡率也显著降低,而200 μmol/L组的凋亡率则显著升高。各剂量组间比较,200 μmol/L甘草次酸组的效果最佳,差异有显著性(P＜0.05);孵育48 h后,200 μmol/L甘草次酸组的效果无论在骨肉瘤细胞的增殖率还是凋亡比例其效果均优于阳性对照组(P＜0.05)。结论: 甘草次酸对骨肉瘤细胞G63增殖有抑制作用,其机制可能通过影响NF-κB信号通路,达到抑制骨肉瘤细胞MG63 增殖的作用。     

PI3K激活NF-κB信号通路保护中子辐射致IEC-6细胞损伤

中子属于高传能线密度电离辐射,能产生比κ射线更为严重的放射损伤,肠上皮对中子辐射高度敏感,迄今未见有关中子辐射致肠上皮细胞损伤中PI3K对NF-κB信号通路调控的研究报道.本研究旨在探讨中子照射后肠上皮细胞中PI3K对NF-κB信号通路的调控及其在中子辐射致肠上皮细胞损伤中的作用.选取肠上皮细胞系-6（intestinal epithelial cell No.6,IEC-6）进行传代培养,随机分为对照组、4Gy中子照射组和4Gy中子照射＋LY294002处理组,照射组和LY294002处理组细胞采用4Gy中子均匀照射,LY294002处理组细胞在照前24h给予终浓度为10κmol/L的LY294002,各组于照射后6和24h采用MTT比色法、流式细胞术和免疫印迹（Western blot）方法检测IEC-6细胞增殖活力、凋亡与坏死率以及NF-κB信号通路相关分子NF-κB（p65）,IKKκ和IκBκ的表达变化.研究发现,4Gy中子照射后6和24h,IEC-6细胞增殖活力下降,凋亡和坏死率增加;应用LY294002后IEC-6细胞增殖活力较照射组明显下降,IEC-6细胞凋亡和坏死率较照射组增加.4Gy中子照射后6和24h,IEC-6细胞NF-κB（p65）和IKKκ表达升高,IκBκ表达降低;应用LY294002后NF-κB（p65）和IKKκ表达降低,IκBκ表达升高,表明4Gy中子照射可引起IEC-6细胞增殖活力下降,凋亡和坏死率增加;PI3K可激活NF-κB信号通路,对中子辐射IEC-6细胞损伤发挥保护作用.     

针对核因子-κBP65基因的短发夹干扰RNA逆转录病毒载体构建与鉴定

目的：构建针对人核因子κB亚基P65基因mRNA的短发夹干扰RNA（shRNA）逆转录病毒表达载体,并探讨小干扰RNA（siRNA）靶向抑制NF—κB P65基因表达的作用。方法：根据shRNA设计原则,在人NF-κB P65全长序列中选取含19个核苷酸靶序列,设计形成siRNA的DNA模板并克隆到shRNA表达载体pSUPER．retro．neo中,构建针对NF—κB P65基因的shRNA表达载体。经293A细胞包装,并感染NIH3T3细胞进行病毒滴度测定后,感染THP-1细胞。分别采用RT—PCR和Western blot从mRNA和蛋白水平检测干扰效果。结果：限制性酶切和基因测序证实针对人NF-κB P65亚基的shRNA表达逆转录病毒载体成功构建;其感染THP-1细胞后,NF—κB P65的mRNA和蛋白表达明显抑制。结论：成功构建了NF-κB P65 shRNA逆转录病毒表达载体,该载体能高效感染THP-1并明显抑制NF—κB P65的表达。     

NF-κB“圈套”抑制PC12细胞中NF-κB活性模型的建立

目的:观察NF-κB"圈套"(κB-decoy)寡核苷酸对LPS诱导PC12细胞中NF-κB活化的抑制过程,建立κB-de-coy抑制NF-κB活化的细胞模型。方法:将培养于6孔板的PC12细胞进行分组转染,实验组:LF2000+κB-decoy(6μg/well);对照组:LF2000+错配-decoy;正常组:LF2000。转染48h后,加入LPS(200ng/ml),作用0.5～4h。分别用免疫细胞化学染色和Westernblot方法检测PC12细胞内NF-κB的表达及活化。结果:与正常组相比较,转染错配-decoy的对照组细胞,随着LPS刺激时间的延长,NF-κB的表达和活化明显增加(P0.01),2～4h达到高峰;与对照组相比较,转染κB-decoy实验组的PC12细胞,随着LPS刺激时间的延长,NF-κB的表达处于较稳定水平,在LPS刺激的各时间点中明显低于对照组(P0.01)。结论:κB-decoy可以降低生理状态下PC12细胞内NF-κB的正常表达水平,抑制病理状态下NF-κB的活化。