P100蛋白及其片段重组质粒构建与表达

目的分别将人类p100基因,p100的SN基因片段和TD片段定向连入pERFP-CI质粒,使它们可与红色荧光蛋白在HeLa细胞内融合表达,从而为进一步研究P100蛋白及其片段的定位、功能及与其它蛋白的相互关系奠定实验基础。方法PCR分别扩增出P100蛋白全长,SN片段和TD片段基因的序列,定向克隆至真核表达载体pERFP-CI,构建相应的3种重组质粒。将构建成功的质粒转染入HeLa细胞,荧光显微镜下可观察红色荧光融合蛋白表达。结果①PCR法获得P100基因序列,长度为2659bp,SN基因片段1918bp,TD基因片段741bp;②将重组质粒直接进行双酶切鉴定可见P100片段,将经过蓝白斑筛选后的重组子经双酶切再与pERFP-CI载体连接并酶切得到SN片段和TD片段;③转染重组质粒后可观察到红色荧光蛋白的表达。结论3种外源片段成功载人pERFP-CI质粒;P100全长、SN片段、TD片段均可与红色荧光蛋白在HeLa细胞中融合表达。     

USP22基因克隆及其融合蛋白真核表达载体的构建

目的克隆人类泛素水解酶22（ubiquitin—specific processing enzyme22,USP22）基因,构建与绿色荧光蛋白融合表达的真核载体。方法利用RT—PCR技术以HeLa细胞总RNA为模板分别扩增USP22基因cDNA序列两片段,依次插入真核表达载体pEGFP—N1;重组质粒转染HEK293T细胞,观察融合蛋白表达及绿色荧光的分布。结果测序结果显示USP22序列与GenBank收录数据一致,酶切显示重组质粒pEG—FP—USP22构建无误,质粒转染后有80％左右HEK293T细胞表达绿色荧光,且在胞质与胞核中广泛分布。结论成功克隆USP22基因并构建与GFP融合表达的真核载体,为进一步深入研究USP22基因的生物学功能奠定了基础。     

核磷蛋白NPM1的RNA干扰慢病毒载体的构建及鉴定简

目的：构建高效抑制核磷蛋白NPMl基因的短发夹RNA（shRNA）干扰载体。方法：以人NPM1基因为靶序列,设计并合成shRNA序列,将其连入RNA干扰慢病毒载体p113．7;酶切鉴定插入shRNA序列片段的质粒,经测序正确后转染293T细胞;Western印迹检测得到抑制效果好的载体pll-shRNA,将其-9慢病毒载体共转染293T细胞,进行病毒的包装,将得到的病毒感染HTl080细胞,通过RT-PCR、Western印迹等方法验证其抑制效果。结果：酶切证实构建的载体pll-shRNA中已插入外源基因片段,转染293T细胞后都有抑制效果,其中pll-shRNA2的抑制效果最好;用pll-shRNA2病毒感染HTl080细胞,RT-PCR和Western印迹检测分别在RNA和蛋白质水平证实NPMl的表达显著降低。结论：构建的RNA干扰载体pll-shRNA2能有效抑制NPMl的表达,为NPMl功能的研究提供了有力工具。     

重构型人caspase-8基因的表达诱导HeLa细胞凋亡

以两种大、小亚基基因次序颠倒的重构型人caspase-8基因的pIRES2-EGFP真核表达载体转染HeLa细胞,用间接免疫荧光染色、免疫细胞化学染色和电镜观察等方法,研究重构型人caspase-8基因在HeLa细胞中的表达及其促凋亡活性.结果显示,两种重构型人caspase-8基因在HeLa细胞中的表达可以有效地诱导HeLa细胞凋亡.     

人RhoB基因真核表达载体的构建和表达分析

旨在构建带Flag标签的人RhoB基因真核表达载体并检测其表达。提取人胚肾细胞HEK-293T总RNA并反转录获得cDNA;设计引物并利用PCR技术扩增RhoB基因的ORF序列;将所扩增序列插入到带Flag标签的pCMV5真核表达载体,插入位点位于限制性内切酶SalⅠ和XbaⅠ之间,得到真核表达载体Flag-RhoB。酶切并测序验证该质粒的准确性。将成功构建的Flag-RhoB质粒转染乳腺癌MCF7细胞、宫颈癌HeLa细胞以及结直肠癌HCT116细胞,Western Blotting检测RhoB蛋白的表达情况;转染Mv.1.Lu细胞,免疫荧光技术检测该蛋白在细胞中的定位情况。成功扩增出RhoB基因的ORF序列;连入pCMV5中获得真核表达质粒Flag-RhoB;酶切鉴定得到590 bp大小的片段,测序结果显示连入的是RhoB基因的cDNA序列与GenBank相符。Western Blotting结果显示,该质粒可在MCF7细胞、HeLa细胞及HCT116细胞中正确表达。免疫荧光实验显示过表达的RhoB蛋白主要定位于细胞膜上,细胞质中也有分布。成功构建了带Flag标签的人RhoB基因的真核表达载体,该质粒可在细胞中顺利表达。     

RNA干扰技术抑制内源性绿色荧光蛋白的表达

目的建立稳定表达绿色荧光蛋白(GFP)的细胞株;构建短发夹RNA(shRNA)表达质粒并观察其对内源性GFP的抑制作用。方法转染pEGFP-N1至HepG2细胞,利用G418筛选获得稳定表达GFP的细胞株(HepG2.GFP);设计合成针对GFP基因的siRNA对应的DNA片段,插入转录载体pTZU6 1,构建shRNA表达载体pSHGFP,转染HepG2.GFP,荧光显微镜观察细胞荧光强度,以western blot检测GFP蛋白水平,以RT-PCR检测mRNA水平。结果利用PCR方法从HepG2.GFP细胞基因组DNA中检测到GFP基因;pSHGFP能够显著抑制该细胞中GFP的表达。结论GFP基因成功整合至HepG2细胞基因组中,pSHGFP能够显著抑制内源性GFP的表达,该系统能够用于RNA干扰机制等研究中。     

核苷酸切除修复基因XPA反义RNA表达载体的构建及其抑瘤功能

采用RT PCR方法扩增出 4 2 6bp着色性干皮病A(xerodermapigmentosumgroupA ,XPA)cDNA片段 (2～ 4 2 7bp) ,反向插入pcDNA3 1质粒构建XPA反义RNA表达载体 .经测序证实 ,该片段序列与XPAmRNA对应片段完全互补 .通过脂质体Lipofectamine 2 0 0 0将重组质粒转染肺癌A5 4 9细胞 ,RT PCR检测表明转染XPA反义RNA重组质粒能够抑制肺癌细胞XPAmRNA表达 ;MTT实验表明转染XPA反义RNA的肺癌细胞对顺铂敏感性增强 .本研究为深入探讨NER途径基因功能及临床克服肿瘤耐药提出了一个新的思路     

PLK1基因沉默抑制HeLa细胞凋亡

以高表达Polo样激酶1（Polo-like kinase 1,PLK1）的宫颈癌细胞系HeLa细胞为模型,观察针对PLK1基因的短发夹状RNA（short hairpin RNA,shRNA）对其凋亡和增殖的影响.设计并合成了针对PLK1的shRNA,将其导入构建的携带增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的RNAi（RNA interference）表达载体中.通过 RT-PCR和Western 印迹分别检测HeLa细胞PLK1基因和蛋白水平的表达,以流式细胞仪和PI-Hochest双染法测细胞凋亡,MTT法检测细胞的增殖水平.成功构建了携带EGFP的RNAi表达载体pEGFP-H1.转染shRNA后,HeLa细胞PLK1的表达降低至30%.与对照组和空载体转染组相比,shRNA转染组的HeLa细胞凋亡率明显增加,其增殖活性则明显降低.本课题构建的RNAi表达载体便于观察靶基因的转染情况,且不影响H1启动子的体内转录.PLK1的基因沉默能明显增加HeLa细胞的凋亡,抑制该细胞的增殖,有可能为未来肿瘤的治疗找到新的靶点和有效途径.     

Smad4基因siRNA表达载体的构建与鉴定

目的:以Smad4基因为靶标构建小干扰RNA(siRNA)真核表达载体.方法:根据GenBank公布的人Smad4核酸序列及SiRNA设计原则,用AmbionRNAi在线软件,筛选得到2个19 bp片段为靶序列,合成两端带有Bam H Ⅰ、HindⅢ酶切位点的发夹结构寡核苷酸序列,经过退火,将此序列克隆到真核表达质粒pSilencerTM3.1-H1 neo vector中,构建成重组质粒,酶切及测序验证.脂质体介导转染人原代增生性瘢痕成纤维细胞,经G418筛选细胞克隆,并用RT-PCR检测Smad4基因的表达.结果:成功构建了pSilencerTM3.1.H1 neo-Smad4 shRNA表达载体克隆,插入片段测序结果与合成的siRNA序列一致.RT-PCR结果显示转染shRNA1、shRNA2重组质粒的成纤维细胞内Smad4 mRNA水平均降低,其中以pSilencerTM3.1-H1-Smad4 shRNA1更为明显(P＜0.01).结论:构建P-Smad4 shRNA袁达载体成功,为进一步研究Smad4基因的RNA干扰奠定了基础.     

双基因真核表达载体pIRES-BMP2-TGFβ3的构建与鉴定

目的：构建与鉴定骨形态发生蛋白BMP2和转化生长因子TGFβ3双基因真核表达载体pIRES-BMP2-TGFβ3。方法：首先,用PCR方法从质粒pGEMT/BMP2中扩增出BMP2基因全长,并将其连入双基因真核表达载体pIRES,得到质粒pIRES-BMP2,其次,从人胚胎组织提取总RNA,反转录成cDNA,以反转录的cDNA为模板,PCR扩增出TGFβ3基因全长,将TGFβ3基因连入质粒pIRES-BMP2;用酶切的方法筛选出阳性重组质粒,并进行测序鉴定。结果：酶切鉴定证明已将BMP2和TGFβ3两个基因连入载体中,测序结果完全正确。结论：成功构建PIRES-BMP2/TGFβ3双基因真核表达载体。     

HeLa/GFP-Plk1/Cherry-H2B稳定细胞系的构建简

目的：构建可研究Polo样激酶1（Plkl）定位的HeLa细胞系。方法：用PCR方法扩增Plkl基因,定向克隆到pRex-EGFP-IRES-Hygm载体中,构建pRex-EGFP-Plkl-IRES-Hygro表达载体;利用逆转录病毒感染的方法,向HeLa细胞系中依次转染pRex-EGFP-Plkl-IRES-Hygro、pRex-Cherry-H2B-IRES-Hygro,构建Hela/GFP-Plkl/Chef．ry-H2B稳定细胞系;激光共聚焦显微镜观察Hela/GFP-Plkl/Cherry-H2B稳定细胞系在不同有丝细胞分裂期时Plkl的定位。结果：质粒酶切及测序证明pRex-EGFP-Plkl-IRES-Hygro载体构建正确;在Hela/GFP-Plkl/Cherry-H2B稳定细胞系有丝分裂中期和末期时,观察到Plkl分别定位于着丝粒和中间体上。结论：构建了Hela/GFP-Plkl/Cherry-H2B稳定细胞系,为研究Plkl在有丝分裂不同时期的调控机制提供了细胞模型。     

小鼠白细胞介素33真核表达质粒的构建及表达

克隆小鼠IL-33基因构建其真核表达质粒,并转染COS-7细胞检测其表达。提取C57BL/6小鼠肺组织总RNA,经反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）扩增小鼠IL-33基因,酶切后插入pcDNA^TM3.1/myc HisA构建其真核表达质粒pcDNA-3.1-IL-33,重组质粒转染COS-7细胞,RT-PCR和免疫印迹法（western blotting）检测目的基因表达。结果显示,pcDNA3.1-IL-33中插入的片段序列测定结果与小鼠IL-33cDNA序列一致,重组质粒转染COS-7细胞后检测到相应mRNA及蛋白表达。成功克隆了小鼠IL-33基因cDNA,并构建其真核表达质粒。     

双基因真核表达载体pIRES-BMP2-TGFβ3 的构建与鉴定

目的:构建与鉴定骨形态发生蛋白BMP2和转化生长因子TGFβ3双基因真核表达载体pIRES-BMP2-TGFβ3。方法:首先,用PCR方法从质粒pGEMT/BMP2中扩增出BMP2基因全长,并将其连入双基因真核表达载体pIRES,得到质粒pIRES-BMP2,其次,从人胚胎组织提取总RNA,反转录成cDNA,以反转录的cDNA为模板,PCR扩增出TGFβ3基因全长,将TGFβ3基因连入质粒pIRES-BMP2;用酶切的方法筛选出阳性重组质粒,并进行测序鉴定。结果:酶切鉴定证明已将BMP2和TGFβ3两个基因连入载体中,测序结果完全正确。结论:成功构建PIRES-BMP2/TGFβ3双基因真核表达载体。     

PPARγ基因真核表达载体的构建及其在乳腺癌MDA—MB-231细胞中的表达

目的：构建以绿色荧光蛋白（GFP）为报告基因的重组表达质粒pEGFP—C1—PPARγ,观察小鼠PPARγ基因在MDA-MB-231细胞中的表达及定位。方法：采用克隆和亚克隆技术构建小鼠PPARγ基因真核表达载体,脂质体Lip2000介导转染MDA—MB-231细胞,real—time PCR和western—blot验证其mRNA和蛋白的表达,荧光显微镜观察该基因亚细胞定位。结果：酶切和测序结果证实重组质粒含有PPAIh编码区序列且插入方向正确,转染后观察该基因亚细胞定位于胞核,胞质有弥散分布。结论：成功构建了小鼠PPARγ基因真核表达载体,该基因在MDA—MB-231细胞中成功表达,PPARγ基因主要集中表达于胞核。     

人HCN2真核表达载体的构建及在HEK293细胞中的表达

目的：构建含有人HCN2基因的真核表达载体,并观察在人胚胎肾细胞（HEK293）中的表达情况。方法：对人HCN2基因全序列进行分析,进行oligo设计,通过PCR,扩增HCN2全长cDNA,通过双酶切（XhoI和BamHI）装入真核表达载体pIRES2-EGFP中,脂质体法转染入HEK293细胞中,利用真核表达载体中带有绿色荧光蛋白GFP报告基因,对转染效率进行监测,采用反转录-聚合酶链反应检测HCN2 mRNA表达,全细胞膜片钳技术检测HCN2通道电流。结果：测序及酶切结果表明HCN2基因正确,荧光显微镜下,转染细胞观察到绿色荧光,反转录-聚合酶链反应检测到HCN2 mRNA表达,膜片钳检测到hHCN2基因编码的通道电流。结论：成功地构建了HCN2真核表达载体并进行了起搏通道HCN2基因的异源性表达。     

稳定表达人Fhit突变体细胞系的建立

目的:构建人脆性组氨酸三联体(Fhit)突变体真核表达载体并建立稳定表达人Fhit突变体的细胞株,以便进一步研究Fhit与复制蛋白A(RPA)在体内的相互作用。方法:将3种人Fhit突变体cDNA克隆至带有HA标签的真核表达载体pREP10上,构建人Fhit突变体真核表达载体,转染HeLa细胞,经潮霉素B加压筛选阳性克隆,用Western印迹鉴定稳定表达Fhit突变体蛋白FhitA、FhitD和FhitF的阳性细胞株。结果:经PCR鉴定及序列分析,Fhit突变体基因真核表达载体pREP10/FhitA/D/F-HA构建正确,转染人HeLa细胞,筛选出Fhit突变体表达较高的细胞株。结论:建立了3株稳定表达Fhit突变体的细胞株HeLa-FhitA/D/F,为研究Fhit与RPA的相互作用在DNA损伤应答中发挥的作用奠定了基础。     

Antiviral Effect of Interferon-Induced Guanylate Binding Protein-1 against Coxsackie Virus and Hepatitis B Virus B3 in Vitro

Guanylate binding protein-1(GBP-1)is an interferon-induced protein.To observe its antiviral effect against Hepatitis B virus(HBV)and Coxsackie virus B3(CVB3),we constructed an eukaryotic expression vector of human GBP-1(hGBP-1).Full-length encoding sequence of hGBP-1 was amplified by long chain RT-PCR and inserted into a pCR2.1 vector,then subcloned into a pCDNA3.1(-)vector.Recombinant hGBP-1 plasmids and pHBV1.3 carrying 1.3-fold genome of HBV were contransfected into HepG2 cells,and inhibition effect of hGBP-1 against HBV replication was observed.Hela cells transfected with recombinant hGBP-1 plasmids were challenged with CVB3,and viral yield in cultures were detected.The results indicated that recombinant eukaryotic expression plasmid of hGBP-1 was constructed successfully and the hGBP-1 gene carried in this plasmid could be efficiently expressed in HepG2 cells and Hela cells.hGBP-1 inhibit CVB3 but not HBV replication in vitro.These results demonstrate that hGBP-1 mediates an antiviral effect against CVB3 but not HBV and perhaps plays an important role in the interferon-mediated antiviral response against CVB3.     

稳定干扰核糖体蛋白RPS7基因表达的宫颈癌HeLa细胞株的建立

目的建立稳定抑制RPS7基因表达的宫颈癌HeLa细胞株。方法设计并合成靶向人RPS7基因的shRNA寡核苷酸片段,克隆到逆转录病毒载体pSIREN中,构建重组质粒pSIREN-RPS7-shRNA,转染293T细胞,将包装产生的重组逆转录病毒感染宫颈癌HeLa细胞,经嘌呤霉素筛选获得稳定的细胞克隆,用real-timePCR和Western印迹检测细胞中RPS7mRNA和蛋白表达水平。结果获得了经测序鉴定正确的重组逆转录病毒质粒,逆转录病毒感染HeLa细胞后用嘌呤霉素筛选出的稳定细胞中,RPS7mRNA和蛋白水平均显著低于干扰对照细胞。结论成功构建了靶向人RPS7基因的shRNA逆转录病毒载体,建立了稳定抑制RPS7基因表达的宫颈癌HeLa细胞株．为进一步研究RPS7在宫颈癌中的生物学功能和作用机制提供了可靠的细胞模型。     

人Polo样激酶1活性缺失突变体和结构域在293细胞中的瞬时表达

目的:构建人Polo样激酶1(Plk1)活性缺失突变体及结构域突变体的真核表达载体,并在293细胞中表达。方法:用二次PCR方法扩增Plk1基因并点突变,将82位赖氨酸突变为精氨酸,定向克隆到pcDNA3-Flag载体中;用普通PCR方法扩增Plk1激酶区域及Polo盒区域(PBD)基因,定向克隆到pcDNA3-Flag载体中;将上述质粒转染293细胞进行瞬时表达,Western印迹检测Plk1蛋白的表达。结果:构建了Flag-Plk1(K82R)、Flag-Plk1KD、Flag-Plk1PBD真核表达质粒,在293细胞中均可有效表达,蛋白相对分子质量分别为68×103、45×103、31×103。结论:在293细胞中表达了Flag-Plk1(K82R)、Flag-Plk1KD、Flag-Plk1PBD蛋白,有助于进一步探究Plk1对底物的功能。