血小板生成素改构体基因的克隆和序列分析

采用PCR技术,根据文献报道的鼠TPO成熟肽基因序列,设计并合成两对引物,以鼠TPO cDNA为模板,扩增获得mTPO N端153个氨基酸的478bp cDNA片段及鼠TPO全长1032bp cDNA片段,mTPO153片段与合成的碱性成纤维生长因子序列中Lys119-Lys135as的51bp肝素结合位点DNA片段连接,克隆到M13mp18及M13mp19载体中进行双向测序;同时将扩增的鼠TPO全长cDNA片段克隆到M13mp18及M13mp19载体中进行双向测序。证明获得鼠血小板生成素与肝素结合位点基因及鼠TPO全长基因,继之以pMAL-C2X为表达载体构建表达质粒,并经PCR及酶切鉴定。     

汉滩病毒84FLi株L片段全长cDNA克隆的构建及鉴定

目的：克隆汉滩病毒84FLi株L片段的cDNA。方法：提取病毒总RNA,反转录为cDNA模板,用高保真的Toq酶扩增出含有L片段部分克隆的片段84L1（1-1875）、84L2（1725—3352）、84L3（2921-4961）和84L4（4727—6533）,将这4个片段分别与T载体pGEM-T-Easy连接,转化感受态大肠杆菌后获得4个克隆pGEM—L1、pGEM—L2、pGEM—L3和pGEM—L4。利用酶切连接方法获得pGEM—L12和pGEM-L34,2段产物覆盖全长的L片段,并且于2921—3352nt区域内相互重叠;再利用酶切连接的方法获得了含有L片段全序列的cDNA克隆。结果：获得6个含有L片段部分片段的克隆,进而酶切组装为含有L片段全序列的cDNA克隆。结论：应用分段克隆和逐次拼接法成功构建了84FLi株L片段全序列的cDNA克隆。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性克隆的构建

目的 确定"猪高热综合征"的主要病原是否为猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),为探寻高致病性病毒基因组结构和功能、高致病性蓝耳病发病机制,以及进一步研制针对后者的基因工程疫苗奠定基础。方法 根据PRRSV基因组序列设计特异性引物,分5段扩增了高致病性PRRSV JX143株的全长cDNA,将各cDNA片段克隆到pBlueScriptⅡSK(+)载体中,进而利用重叠区中的单酶切位点将其连接成JX143株的全长cDNA克隆pJX143和含有遗传标记MluⅠ限制性内切酶的基因组全长cDNA克隆pJX143-M。结果全长cDNA克隆经体外合成RNA后转染MA-104细胞,均获得稳定的拯救病毒。通过比较亲本病毒与拯救病毒的病毒滴度、多步生长曲线和利用拯救病毒vJX143进行动物回归试验,结果 发现病毒学及生物学特性没有显著差异。结论 PRRSV的JX143株病毒确实是引起"猪高热综合征"的主要病原;建立了首个高致病性PRRSV的感染性cDNA克隆,证明拯救病毒与亲本病毒生物学特性相同。     

脊髓灰质炎病毒中Ⅰ9株基因组克隆及其部分结构分析

以脊髓灰质炎病毒RNA为模板,反转录合成了长链ds-cDNA。将合成的脊灰病毒中I9株ds—cDNA片段重组到质粒pAT153上,获得了约占脊灰病毒中I9基因组95％以上的cDNA克隆。对克隆的中I9cDNA部分片段作了限制性内切酶图谱分析和部分核酸的序列分析,发现脊灰病毒中I9部分核酸顺序有所改变。     

应用逆转录聚合酶链反应法扩增类胰岛素生长因子Ⅱ基因

利用酸性异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法从人胚胎组织中提取总RNA,经Oligo(dT)纤维柱分离纯化出mRNA。用逆转录与聚合酶链反应相结合的RT-PCR法,扩增出人类胰岛素生长因子Ⅱ(IGFⅡ)的cDNA片段,在限制性内切酶Sma Ⅰ存在的连接体系中,将扩增出的cDNA片段克隆进PUC12的Sma Ⅰ位点处。经限制性内切酶EcoR Ⅰ、Sal Ⅰ、Eco47Ⅲ酶切鉴定其方向。以重组质粒的双链DNA为模板,用末端终止法测定其全部核苷酸顺序,证实其核苷酸编码的IGFⅡ在氨基酸顺序上与文献报道的相同。     

限制性内切酶介导的重叠延伸在人环氧合酶-1(COX-1)基因克隆中的应用

建立一种用于克隆全长基因的、限制性内切酶介导的重叠延伸法 .对全长基因进行分段扩增 ,并利用适当的限制性内切酶对基因序列内相应的限制性位点进行酶切 ,从而使分段扩增片段得以重叠并互为模板 ,在DNA聚合酶的作用下延伸获得全长基因 .将环氧合酶 1 (COX 1 )基因的外显子 9巧妙地拼接到了缺失外显子 9的COX 1cDNA片段中 ,获得了COX 1基因的全长cDNA .该方法分 3步进行 .首先 ,通过RT PCR分别扩增跨外显子 9的cDNA片段和缺失外显子 9的cDNA片段 ,并克隆到pMD1 8 T载体上 ;其次 ,PCR扩增外显子 9片段 ,限制性内切酶StuI酶切缺失外显子9cDNA片段的重组质粒 ,二者以一定的比例混合 ,互为模板 ,在pfuDNA聚合酶的作用下进行延伸 ,从而产生一个双链的DNA分子 .最后 ,以延伸产物为模板 ,用COX 1cDNA两端的引物进行PCR扩增 ,产生包含外显子 9的COX 1基因的全长cDNA .这种限制性内切酶介导的重叠延伸方法 ,对于克隆mRNA剪接水平上受调控的基因尤为有用 ,同时也为基因的重组和修饰提供一个新的思路     

里氏木霉纤维二糖酶bglII基因的cDNA克隆及其在大肠杆菌中的表达*

将里氏木霉总RNA反转录得到cDNA第一链,并以之为模板进行 RT-PCR合成约1.4kb的纤维二糖酶基因cDNA,将所得的cDNA经测序后克隆到温度敏感型表达载体pJW2中,经PCR和双酶切鉴定筛出阳性重组子,温度诱导后,经酶活测定,bgl II基因在大肠杆菌中得到了表达,酶活为0.75IU/mL。     

寻找克隆基因的探针

基因表达和DNA复制应用到基因克隆的具体方法和技术及其概念在不断发展变化。首先DNA是应用纯化了的限制性内切酶在核酸序列上的特异部位切割下来的DNA片段,许多DNA片段用DNA连接酶把它们拼接成克隆工具。限制性内切酶和DNA连接酶在进行筛选时已加以纯化了,这两种酶在商业上是有价值的。     

里氏木霉纤维二糖酶bgl II基因的cDNA克隆及其在大肠杆菌中的表达

将里氏木霉总RNA反转录得到cDNA第一链,并以之为模板进行 RT-PCR合成约1.4kb的纤维二糖酶基因cDNA,将所得的cDNA经测序后克隆到温度敏感型表达载体pJW2中,经PCR和双酶切鉴定筛出阳性重组子,温度诱导后,经酶活测定,bgl II基因在大肠杆菌中得到了表达,酶活为0.75IU/mL.     

里氏木霉纤维二糖酶bg1Ⅱ基因的cDNA克隆及其在大肠杆菌中的表达

将里氏木霉总RNA反转录得到cDNA第一链，并以之为模板进行RT－PCR合成约1．4kb的纤维二糖酶基因cDNA,将所得的cDNA经测序后克隆到温度敏感型载体pJW2中，经PCR和双酶切鉴定筛出阳性重组子，温度诱导后，经酶活测定，bg1Ⅱ基因在大肠杆菌中得到了表达，酶活为0．75IU／mL。     

人Ⅱ型囊泡单胺转运体基因的克隆

目的 为获得人Ⅱ型囊泡单胞转运体（vesicular monomine transporter-2VMAT2)以治疗帕金森病,克隆添加Kozak序列的VMAT2cDNA,用于真核细胞表达。方法 从人胎脑中提取总RNA,逆转录成cDNA,设计一对引物用PCR方法扩增目的cDNA片段并将其重级一起pGEM-Easy-T载体中,酶切鉴定插入片段后,进行全序列测定。结果 RT-PCR扩增到1637bp的带有Kozak序列的cDNA片段。结论 克隆人VMAT2cDNA片断,可用于真核细胞表达。     

番茄内质网ω-3脂肪酸去饱和酶基因原核表达载体的构建与鉴定

通过RT-PCR的方法从番茄叶片克隆到内质网ω-3脂肪酸去饱和酶(LeFAD3)基因的部分编码区,该片段cDNA为309 bp,将其克隆到pET-30a(+)载体中,酶切位点分别是BamH I和Sac I,构建了原核表达载体pET-LeFAD3,并在大肠杆菌BL21中表达融合蛋白,经IPTG诱导蛋白表达,提取蛋白并采用SDS-PAGE和蛋白质免疫印迹法检测目的蛋白的表达情况.酶切鉴定结果表明,LeFAD3基因原核表达载体构建成功,目的蛋白成功表达.     

内皮素A型受体胞内区cDNA的克隆及序列分析

为研究内皮素受体在细胞内的信号传导途径,通过聚合酶链反应(PCR)的方法获得了480bp的内皮素A型受体胞内区cDNA片段,将其克隆进载体pUC19进行核苷酸序列分析,结果表明克隆的cDNA片段与报道的内皮素A型受体cDNA序列只有一个碱基的不同且为同义突变。最后,将克隆的cDNA片段定向克隆进酵母双杂交系统中的引诱蛋白表达载体pGBT9,为探寻与内皮素A型受体相互作用的蛋白质打下了基础。     

单酶切cDNA-AFLP改良法分离草菇冷诱导基因

采用单酶切cDNA-AFLP改良法克隆分离了十条草菇冷诱导基因片段VC7、VC8、VC9、VC10、VC11、VC12、VC13、VC14、VC15、VC16。DNA序列测定结果表明,克隆分离的十条DNA片段分别为504bp、549bp、555bp、301bp、189bp、602bp、605bp、834bp、703bp、1085bp。同源性BLAST程序搜索结果显示,除VC14与粗糙脉孢菌Neurosporacrassa的钙磷型ATP酶基因有较高的同源性外,其余九条DNA片段目前都没有搜索到同源的核酸序列;而其翻译的蛋白质序列,除了VC11和VC15目前未能搜索到同源的蛋白质序列外,其余八条DNA片段翻译的蛋白质序列与粗糙脉孢菌Neurosporacrassa、裂殖酵母Schizosaccharomycespombe、链霉菌Streptomycesavermitilis等的有关蛋白质序列具有较高的同源性。     

中华鳖孵化一周胚胎的肾脏/尿生殖嵴混合组织的cDNA文库构建与特征

为克隆到与胚胎发育有关的新基因,以孵化一周的中华鳖(Trionyxsinensis)胚胎的肾脏及尿生殖嵴混合组织为原始材料,采用SMART和长距离PCR技术,构建了一个中华鳖cDNA表达文库。分析结果表明,该未扩增的cDNA文库大约含有4.134×105个克隆。任意挑取了192个克隆,提取质粒后用SfiⅠ酶切鉴定表明没有插入片段的克隆为9个,插入了cDNA片段的克隆为183个,插入的cDNA片段大小范围为0.4-3.8kb。其中,插入片段在0.4-1.0kb之间的克隆为19个,在1.1-2.0kb之间的克隆为53个,在2.1-3.0kb之间的克隆为92个,大于3.1kb的克隆为19个。另外,任意挑选45个克隆,提取质粒后,从5′端进行测序,Blast分析表明,除了21个序列在GenBank中找不到同源序列外,其余24个序列在GenBank中均被证实有各自相应的同源序列,这些序列代表6种类型的基因核糖体蛋白基因、代谢酶基因、组织特异性表达的基因、转录因子基因、受体蛋白基因及其它基因。该发育阶段特异性cDNA文库可以进一步用于中华鳖胚胎发育过程中相关基因的鉴定分离、结构功能分析、以及表达调控机制等研究。     

人呼吸道合胞病毒兰州株基因组全长cDNA克隆的构建及鉴定

目的构建用于呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)体外拯救的RSV基因组全长cDNA克隆,并进行鉴定。方法根据RSV Long株基因组序列设计并合成引物,利用RT-PCR技术分6段扩增RSV LZ01/09基因组序列并构建克隆载体;测序后,利用重叠PCR与酶切连接技术,根据基因组序列选择特异性酶切位点,引入Kpn I、Xma I和Sal I酶切位点,构建成4个亚克隆载体;将亚克隆载体的插入片段连接至经过改造且包含T7启动子、锤头状核酶、多克隆位点、丁肝核酶、T7终止子的p RSV1载体中,构建RSV基因组全长cDNA克隆;对克隆全长cDNA序列进行测定,与亲本RSV LZ01/09基因组进行同源性比对分析,并与RSV实验参比株进行系统进化树分析。结果测序结果显示,RSV LZ 01/09的基因组全长为15 204 bp,与GenBank公布的RSV基因组序列长度相当,将完整的序列提交GenBank,登录号为KY782635;酶切及测序结果显示,用于RSV全长cDNA克隆构建的基本载体p BSKS-MCS(简称p RSV1)与预期相符,RSV全长基因组cDNA克隆质粒(简称转录载体p RSV1-4F)酶切片段大小与预期一致;同源性比对结果显示,全长cDNA序列与亲本RSV LZ01/09基因组序列同源性高达99.83%;系统进化树分析结果显示,其与RSV-A亚型序列同属于一个分支。结论测序及酶切分析结果表明已成功构建RSVLZ01/09基因组全长cDNA克隆,为建立拯救RSV重组病毒的反向遗传学系统平台奠定了基础。     

三重融合PCR法构建感染性辛德毕斯嵌合病毒cDNA克隆

利用三重融合PCR法,即将3个DNA片段放在同一个反应里进行长片段PCR扩增法,融合得到了包含辛德毕斯病毒XJ-160株结构基因E3、E2、6K、3′UTR和辛德毕斯病毒YN87448株结构基因E1的融合DNA片段E3E26KE13′UTR。通过此融合片段两端引入的XbaI和XhoI酶切位点将其连接到XJ-160株的感染性全基因组cDNA克隆骨架上,成功构建了辛德毕斯病毒株XJ-160与YN87448外膜糖蛋白基因E1相互替换的嵌合病毒cD-NA克隆,命名为pBR-XJ160YE1。该克隆线性化后经体外转录,RNA转录体脂质体法转染BHK-21细胞,36h后细胞发生病变。间接免疫荧光检测到病毒蛋白的表达。提取5次传代后细胞上清中病毒RNA,RT-PCR法检测证明病毒来源于嵌合病毒cDNA克隆。此感染性辛德毕斯嵌合病毒cDNA克隆可以作为研究辛德毕斯病毒E1糖蛋白基因相关功能及XJ-160病毒和YN87448病毒存在单方向血清学反应的分子机理的分子生物学工具。     

小菜蛾乙酰胆碱酯酶cDNA片段的克隆和序列分析

利用反转录-多聚酶链式反应(RT-PCR)的方法对小菜蛾Plutella xylostella的乙酰胆碱酯酶基因cDNA片段进行了克隆和序列分析。通过简并性上游引物和下游引物扩增出了小菜蛾乙酰胆碱酯酶基因281bp的cDNA片段。同源性分析表明, 该cDNA片段与其它昆虫乙酰胆碱酯酶基因序列具有较高的同源性。     

龙葵阿特拉津抗性生物型的鉴定和阿特拉津抗性基因的克隆

通过直接施用除草剂、荧光诱导和正反杂交试验等鉴定出4种抗阿特拉津的龙葵生物型。从抗性最强的B_(13)株制备叶绿体DNA,构建限制性内切酶Bam HI片段的基因文库,并从中筛选出1个5kb Bam HI片段的克隆pSB 135,通过与探针的分子杂交,证明在pSB 135克隆的Bam HI片段中含有编码叶绿体32k蛋白质的阿特拉津抗性基因。