荧光能量转移技术在生物学研究中的应用

荧光能量转移(FRET)是指两个携带不同荧光基团的大分子在相互间距离足够近时(10～100A)所发生的能量非放射性地由一个荧光基团向另一个荧光基团转移的现象。结合绿色荧光蛋白的发现,FRET技术可用于检测生物大分子中不同亚基的位置和生物大分子间的相互作用。近年来,FRET技术在生物学研究中的突破性进展是在活体细胞中实时监测生物大分子之间的相互作用。本文就绿色荧光蛋白的发现,FRET技术的原理、研究进展和应用前景作简要综述。     

生物大分子相互作用检测技术新进展———三色荧光级联荧光共振能量转移技术

荧光共振能量转移(fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET),是指能量从一种受激发的荧光基团(fluorophore)以非辐射的方式转移到另一种荧光基团的物理现象.FRET的能量转移效率是两个荧光基团间距离的函数,并对此距离十分敏感,它的有效响应距离一般在1～10nm之间,因而可被用于测定原子间及分子间的距离.这一特点使FRET技术在大分子构象变化、大分子之间相互作用、细胞信号通路等研究中发挥重要作用,成为生物医学研究中的重要方法.但细胞内的生物学过程常常涉及多于两个的大分子间相互作用,二色荧光基团的FRET技术不能满足这种生物学研究的需求.最近,两个研究小组在这方面取得突破,建立了分别基于共聚焦显微镜和流式细胞仪的三色荧光级联FRET技术.这一技术的出现将会极大地促进生物学及相关研究领域的发展.     

基于GFP的FRET应用

绿色荧光蛋白（GFP）是一种活性荧光标记,已被用来研究基因表达、分子定位,蛋白质折叠和转运;荧光共振能量转移（FRET）是一种无损伤的光学检测方法,能检测到小于纳米的距离变化。将GFP的活性定位标记功能与FRET的高分辨率相结合。为活体研究生物分子的功能和命运开创了新的篇章。作者在介绍GFP和FRET原理的基础上,综述了基于GFP的FRET在蛋白酶活性,蛋白质间相互作用 构象改变研究中的应用。     

基于C6流式细胞仪平台应用FRET技术在活细胞中研究蛋白质相互作用

荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)显微镜技术被广泛应用于在活细胞中研究蛋白质相互作用。随着流式细胞术(fluorescence activated cell sorting,FACS)的发展与应用,FACS-FRET技术不但可以检测活细胞中蛋白质相互作用,还可以进行定量统计分析。由于流式细胞仪价格昂贵、FRET技术对荧光基团发光光谱的特殊要求等原因,目前为止FACS-FRET技术仅仅被应用到一些特殊的科学研究。为了解决这些问题,构建了一对新的FRET荧光基团EGFP-m Cherry,并且在小型流式细胞仪C6上检测了EGFP-m Cherry融合蛋白的FRET信号,最后使用已明确有相互作用关系的p53蛋白和MDM2蛋白做验证,证明了所构建的EGFPm Cherry可以作为检测FRET信号的荧光基团。不仅促进了FACS-FRET技术的发展,还为人类疾病治疗的药物作用靶点研究提供了有利的研究手段。     

荧光共振能量转移效率的实时定量测量

荧光共振能量转移（FRET）广泛用于研究分子间的距离及其相互作用,与荧光显微镜结合,可定量获取有关生物活体内蛋白质、脂类、DNA和RNA的时空信息。随着绿色荧光蛋白（GFP）的发展,FRET荧光显微镜有可能实时测量活体细胞内分子的动态性质。提出了一种定量测量FRET效率以及供体与受体间距离的简单方法,仅需使用一组滤光片和测量一个比值,利用供体和受体的发射谱肖除光谱间的串扰。该方法简单快速,可实时定量测量FRET的效率和供体与受体间的距离,尤其适用于基于GFP的供体－受体对。     

单个活细胞中生物分子动态行为的FRET实时检测

分别采用两种不同绿色荧光蛋白(green fluorescent prote in,GFP)突变体作为荧光共振能量转移(fluo-rescence resonance energy transfer,FRET)对的供体和受体,并利用分子生物学技术将供体和受体分子分别与特定的生物分子融合,这种技术已经成为在单个活细胞中实时长时间检测蛋白质间的动态相互作用的主要技术。主要介绍了基于GFPs的FRET技术在单个活细胞中实时长时间研究生物分子动态行为的应用。     

FRET技术在受体信号转导研究中的应用

细胞信号传导是细胞生物学方面的重要内容之一,涉及生命过程的各个方面,包括生长、分化发育、增殖、凋亡、迁移等等,对维持细胞功能及机体生存至关重要。目前对细胞信号转导研究的技术手段多种多样,其中荧光共振能量转移技术（FRET）是研究细胞信号转导较为常用的一种技术,可以实现活细胞内蛋白质之间相互作用的实时检测。本文中我们以受体酪氨酸激酶为例,介绍FRET技术在受体介导细胞信号传导中的应用及进展情况。     

CFP荧光蛋白文库构建及FRET技术筛选钙调素结合蛋白

钙调素（Calmodulin,CaM）是细胞内Ca^2＋信号的主要受体,能够与靶蛋白相互结合调节靶蛋白的活性,在细胞增殖、分化、凋亡、迁移等过程中都起着重要作用。荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer,FRET）技术是目前研究蛋白质相互作用比较成熟的方法之一。作者通过Cre-loxP位点特异性重组技术构建了带有CFP荧光蛋白标记的文库,与YFP—CaM共同转染HEK293细胞,应用荧光共振能量转移技术（FRET）进行检测,挑取发生FRET作用的单个细胞,并进行单细胞PcR检测。由此扩增出的片段通过测序和蛋白序列数据库NCBI进行序列比对后,筛选出与CaM产生相互作用的蛋白。目前,已经通过这种方法成功地筛选到了一些与CaM相结合的蛋白,从而为进一步研究CaM蛋白在生理环境下的作用提供有利条件。     

生物学中荧光共振能量转移的研究应用进展

荧光共振能量转移（FRET）可用于对生物大分子之间的距离进行定性、定量检测,所采用的材料、方法在近年都有了很大的发展,在核酸、蛋白质、细胞器结构功能检测、免疫测定、配体－受体相互作用测定等方面都有巧妙而有效的应用,应用前景十分广阔。     

双分子荧光互补技术

双分子荧光互补（bimolecular fluorescence complementation, BiFC）是近年发展起来的用于体内或体外检测蛋白质相互作用的一项新技术.该技术是将荧光蛋白在合适的位点切开形成不发荧光的2个片段,这2个片段借助融合于其上的目标蛋白的相互作用,彼此靠近,重新形成能具有活性的荧光蛋白.BiFC方法简单直观,既可以检测蛋白之间的相互作用,也可以定位相互作用蛋白质的位点.多色BiFC系统共用或与荧光共振能量转移（FRET）技术联用,还可以检测细胞内多个蛋白质的相互作用.