不对称水解(R,S)-2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯新菌种的分离鉴定及酯酶基因的克隆、表达

【目的】筛选鉴定1株可以选择性水解农药甲霜灵的中间体(R,S)-2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯(MAP)的菌株,并克隆、表达该菌株中的酯酶基因。【方法】以MAP为唯一碳源,对活性污泥样品中的微生物进行富集培养,采用罗丹明B平板显色法进行初筛,通过摇瓶复筛得到了1株对MAP具有最高对映体选择性和水解活力的新菌株,根据其形态、生理生化特征及16S rRNA序列分析,确立该菌株的系统发育学地位。构建该菌株的基因文库,筛选获得含目的基因的克隆子,通过序列分析和引物扩增得到酯酶基因,将基因与表达载体pET28a(+)连接后,转化大肠杆菌BL21Gold(DE3)plysS,构建重组菌。【结果】该菌属于革兰氏阴性菌,结合16S rRNA基因、形态特征和生理生化实验结果,鉴定该菌为反硝化无色杆菌。通过基因文库法,找到了该菌中的酯酶基因EHest,并成功构建了重组大肠杆菌EHest-p ET28a(+)-BL21Gold(DE3)plys S,表达了来自Achromobacter denitrificans 1104且具有不对称水解MAP活性的酯酶EHesterase,大小约27 kDa,表达酶活是原始菌株的27.1倍。用EHesterase催化MAP水解,底物浓度50 g/L,反应1 h,底物转化率为29.5%,产物(酸)的ee_p为85.1%,对映体选择性为R型。该酶的最适反应pH和温度分别为pH 9.0和50°C。它水解MAP的活性分别是水解橄榄油和乙酸乙酯活性的333倍和667倍。【结论】筛选到1株具有不对称水解MAP能力的新菌株Achromobacter denitrificans 1104。     

3-氰基吡啶水合酶的反应条件及影响因子

研究了芳腈水合酶催化水合3-氰基吡啶生成尼克酰胺的反应条件及影响因子.酶反应的最适pH为8.0,最适温度为25℃.酶在pH8.5于25℃保温4小时或在25—30℃于pH8.0保温3小时是稳定的.反应液中加入Fe~(3+)(1.5 mmol/L)可使酶活力增加 50%,而加入NH_4~+(300 mmol/L)则使酶活降低了67%.Ag~+和 Hg(2+)”强烈地抑制酶反应活性,在浓度均为 5mmol/L时,抑制率分别为99.7%和100%.NaCN(50 mmol/L)和苯甲腈(100 mmol/L)对酶活性的抑制率分别为78%和85%.该酶作用于 3-氰基吡啶的Km为62.5 mmol/L,V_(max)为85.8 μmol·min~(-1)·mg~(-1).     

3-氰基吡啶水合酶的反应条件及影响因子

研究了芳腈水合酶催化水合3-氰基吡啶生成尼克酰胺的反应条件及影响因子.酶反应的最适pH为8.0,最适温度为25℃.酶在pH8.5于25℃保温4小时或在25—30℃于pH8.0保温3小时是稳定的.反应液中加入Fe~(3 )(1.5 mmol/L)可使酶活力增加 50%,而加入NH_4~ (300 mmol/L)则使酶活降低了67%.Ag~ 和 Hg(2 )”强烈地抑制酶反应活性,在浓度均为 5mmol/L时,抑制率分别为99.7%和100%.NaCN(50 mmol/L)和苯甲腈(100 mmol/L)对酶活性的抑制率分别为78%和85%.该酶作用于 3-氰基吡啶的Km为62.5 mmol/L,V_(max)为85.8 μmol·min~(-1)·mg~(-1).     

双酶偶联转化富马酸制备β-丙氨酸的工艺的建立与优化

酶转化法是生产β-丙氨酸的重要途径,但单一酶法转化存在底物价格较高的问题。通过构建双酶催化体系制备β-丙氨酸,即将来源于大肠杆菌的天冬氨酸酶(AspA)和来源于谷氨酸棒杆菌的L-天冬氨酸α-脱羧酶(PanD)偶联,以富马酸和氨为底物进行酶促反应合成β-丙氨酸。催化反应中AspA与PanD的最适加酶比例为1∶80,其中AspA的浓度为10μg/mL,转化温度为37℃,pH为7.0;浓度为100 mmol/L的富马酸可在8 h内被完全转化,转化率为100%,摩尔产率为90.9%,β-丙氨酸的产量为90 mmol/L,约为7 g/L;浓度为200 mmol/L的富马酸在反应8 h后,体系中β-丙氨酸的产量为126 mmol/L,约合9.8 g/L,继续延长反应时间,转化率并没有明显提高。根据该研究提出的双酶偶联转化工艺可将价格低廉的富马酸一步转化为具有高附加值的β-丙氨酸。     

α-环糊精糖基转移酶活性区域突变提高选择形成γ-环糊精能力

探讨α-环糊精糖基转移酶(CGT酶)活性区域-3亚位点(47位赖氨酸残基),-7亚位点(146~152位氨基酸残基)以及环化中心位点(195位酪氨酸残基)对其催化底物形成γ-环糊精(CD)能力的影响。将α-CGT酶相应位点分别进行如下突变:K47T,Y195I,以及146~152位氨基酸残基替换为异亮氨酸(命名为△6),并在大肠杆菌BL21中实现异源活性表达。以可溶性淀粉作为底物进行转化,利用HPLC分析各种突变酶的催化产物中3种环糊精产量和比例。结果表明,和野生酶相比,所有突变酶的淀粉水解活性和环糊精总生成量都有不同程度的下降。在产物的组成方面,突变酶Y195I的催化产物中,α-CD的含量由68%降为30%,β-CD由22.2%提高为33.3%;而γ-CD由8.9%提高为36.7%,含量提高了4倍,取代α-CD成为产物中的主要成分;γ-CD的实际产量为1.1 g/L,是野生酶(0.4 g/L)的3倍。突变酶K47T和△6的转化产物中α-CD比例有不同程度下降,但仍然是产物中的主要组分,β-和γ-CD的比例都有所增加。由此可见,活性区域中195位氨基酸对于α-CGT酶的活力和催化选择性具有重要的影响,Y195I突变体酶最有利于选择性形成γ-CD。纯化后突变酶Y195I的酶学性质试验表明,其最适反应温度和野生酶相同,但最适反应pH有所提高,且比野生酶具有更好的pH稳定性。因此,突变酶Y195I具有生产制备γ-CD的潜力。     

高分子膜载体固定化酵母催化2-辛酮不对称还原

以戊二醛交联尼龙6膜载体固定化面包酵母DX213,采用固定化酵母细胞催化2-辛酮不对称还原得到(R)-2-辛醇。系统考察了有机溶剂、反应时间、pH、底物、辅助底物和热处理等因素对反应的产率和光学选择性的影响。结果表明,上述因素对酵母细胞催化不对称合成(R)-2-辛醇反应均有显著影响。二氯甲烷为该反应最适有机溶剂,在固定化细胞57 g/L(50℃预热50 min),水相与有机溶剂相体积比4/1,pH 7.0,初始2-辛酮浓度为60 mmoL/L(分别在反应0,10,17 h等分添加),蔗糖5.7 g/L和28℃条件下反应48 h,(R)-2-辛醇的产率和e.e.值分别达到89.3%和96.8%。     

高产(+)γ-内酰胺酶菌株的筛选与发酵产酶研究

从土壤中筛选获得高产(+)γ-内酰胺酶的微生物菌株,并鉴定和保藏为Delftia sp.CGMCC No.5755.对该Delfiia sp菌株的发酵产酶条件进行了研究,结果表明,最适发酵培养基为:蔗糖30 g/L,蛋白胨30 g/L,牛肉膏25 g/L,乙酰胺5 g/L,MgS04 1 g/L;最适发酵温度及初始pH分别为32℃和pH 7.0.该菌株在上述条件下发酵培养20 h,菌体生物量为16.0 g/L,(+)γ-内酰胺酶的酶活为692 U/L.采用Delftia sp.静息细胞对100 g/L的外消旋底物2-氮杂二环-[2.2.1]-庚烷-5-烯-3-酮(简称(±)γ-内酰胺)的水解拆分反应中,产物(-)γ-内酰胺光学纯度大于99.9％e.e.,转化率为53.7％.研究为生物催化法高效制备光学纯(+)γ-内酰胺提供了可行的途径.     

一种α-环糊精葡萄糖基转移酶的纯化及性质研究

本文报道了一种主要转化产物是α-环糊精的环糊精葡萄糖基转移酶的纯化、酶学性质和转化特性。将发酵上清液通过硫酸铵分级沉淀、疏水柱层析和离子交换层析获得表观电泳纯的酶蛋白。纯酶的分子量约为75KDa,等电点5.3。最适反应温度为50℃,最适反应pH为6。对可溶性淀粉的Km值和Vmax分别是50mg/ml和6.07 mg/ml/min。色氨酸残基为酶活力的必需基团。酶的N末端序列为-SPDTSVDNKV-。Ca2+、Zn2+、Fe3+、Cu2+、Fe2+、Ag+对酶活力有强烈抑制作用。纯酶催化转化条件试验表明,廉价的马铃薯淀粉是酶催化制备α-CD的适宜底物,最佳转化条件为：酶量200u/g淀粉,温度40℃,反应时间24h,总转化率达41%,其中α-环糊精占总转化产物的78%。因此,该酶不仅表现出特殊的酶学特性,而且有较好的产业化开发前景。     

羰基还原酶产生菌Candida ontarioensis制备(R)-2-氯-1-(3-氯苯基)乙醇

从实验室保藏的菌株中筛选获得Candida sp.PT2A,并通过18S rRNA鉴定为安大略假单胞菌Candida on-tarioensis。对C.ontarioensis不对称还原合成(R)-2-氯-1-(3-氯苯基)乙醇的发酵产酶条件和转化条件进行优化,确定了最适的发酵产酶条件和转化条件:温度30℃,初始pH 6.5,摇床转速180 r/min,菌体质量浓度200 g/L。采用2-氯-1-(3-氯苯基)乙酮质量浓度为10 g/L时,还原反应72 h,(R)-2-氯-1-(3-氯苯基)乙醇的e.e.值为99.9%,产率为99%;底物质量浓度提高至30 g/L时,产率下降为84.3%。采用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)对C.ontarioensis细胞进行通透性处理(CTAB g/L,4℃下处理20 min),在30 g/L底物下反应24 h,产物的e.e.和产率分别达到99.9%和97.5%。     

重组大肠杆菌产蔗糖磷酸化酶的酶学性质及其催化合成α-熊果苷

利用重组大肠杆菌Escherichia coli Rosetta(DE3)/pET-SPase发酵生产蔗糖磷酸化酶(EC 2.4.1.7,Sucrose phosphorylase,SPase)。收集的菌体经高压破碎后离心得到粗酶液,通过镍NTA亲和层析、超滤除盐后得到电泳纯的SPase,纯化后的SPase的比酶活是原来的2.1倍,酶活回收率达到82.7%。经SDS-PAGE电泳测定,重组SPase的分子量约为59 kDa。该酶在不高于37℃,pH 6.0~6.7的条件下比较稳定,最适催化温度与最适催化pH分别为37℃,pH 6.7,该酶对蔗糖的米氏常数(Km)为7.3 mmol/L,最大反应速率(Vmax)为0.2μmol/(min.mg)。此外文中还以蔗糖和氢醌为底物,利用重组SPase催化合成α-熊果苷。其最佳反应条件为:20%蔗糖,200 U/mL的酶液,1.6%氢醌,pH 6.0~6.5,25℃,反应21 h。α-熊果苷的摩尔产率为78.3%,α-熊果苷的产量为31 g/L。     

南海深海微生物酯酶EST12-7在制备(R)-2-氯丙酸乙酯中的应用研究

利用来源南海深海的微生物酯酶EST12-7不对称水解反应拆分制备（R）-2-氯丙酸乙酯。并探寻了温度、pH、底物浓度、有机溶剂和反应时间等因素对酯酶EST12-7催化制备（R）-2-氯丙酸乙酯的影响。结果表明,深海微生物酯酶EST12-7催化制备（R）-2-氯丙酸乙酯的最佳反应条件为：13.8 μg/ml酯酶EST12-7,50 mmol/L（±）-2-氯丙酸乙酯,2%正癸醇,pH8.5,30℃,0.05mol/L Tris-HCl,反应60 min。在最佳反应条件下,（±）-2-氯丙酸乙酯的转化率可达49%,所制备的（R）-2-氯丙酸乙酯的光学纯度为98%。通过对酯酶EST12-7拆分制备（R）-2-氯丙酸甲酯和（R）-2-氯丙酸乙酯进行比较,2-氯丙酸酯中的链长对酯酶EST12-7拆分反应有极大的影响。     

游离及固定化果糖基转移酶部分酶学性质的比较研究

 从诱变、筛选的米曲霉GX0 0 10菌株所产生的果糖基转移酶 ,经过纯化和固定化操作分别制备游离酶和固定化酶 ,对两者的酶学性质进行了比较研究 .结果表明 ,两者在蔗糖转化为蔗果低聚糖的酶促反应中 ,最适pH为 5 5,在pH5 0～ 7 5之间酶活性相对稳定 .游离酶和固定化酶的适宜温度范围分别是 4 5～ 52℃和 4 0～ 55℃ .在 55℃保温 60min ,酶活性保存率分别是 61 6%和 87 5% .固定化酶的热稳定性提高 .0 1mmol LHg2 +和 1mmol LAg+能完全抑制游离酶的活性 ,但只能部分抑制固定化酶的活性 ,1mmol L的Ti2 +能完全抑制两者的活性 .以蔗糖为底物时 ,游离酶的米氏常数Km=2 15mmol L ,而固定化酶Km =386mmol L .游离酶只能使用一次 ,固定化酶反复使用 54次后 ,剩余活力为 55 2 % .用 55% (W V)蔗糖溶液与固定化酶在pH5 0 ,4 6℃下作用 12h ,可获得61 5% (总低聚糖 总糖 )产物 ,其中蔗果五糖含量达到 7 2 % .     

Improvements of enzyme activity and enantioselectivity via combined substrate engineering and covalent immobilization

Esterases, lipases, and serine proteases have been applied as versatile biocatalysts for preparing a variety of chiral compounds in industry via the kinetic resolution of their racemates. In order to meet this requirement, three approaches of enzyme engineering, medium engineering, and substrate engineering are exploited to improve the enzyme activity and enantioselectivity. With the hydrolysis of (R,S)-mandelates in biphasic media consisting of isooctane and pH 6 buffer at 55 degrees C as the model system, the strategy of combined substrate engineering and covalent immobilization leads to an increase of enzyme activity and enantioselectivity from V(S)/(E(t)) = 1.62 mmol/h g and V(S)/V(R) = 43.6 of (R,S)-ethyl mandelate (1) for a Klebsiella oxytoca esterase (named as SNSM-87 from the producer) to 16.7 mmol/h g and 867 of (R,S)-2-methoxyethyl mandelate (4) for the enzyme immobilized on Eupergit C 250L. The analysis is then extended to other (R,S)-2-hydroxycarboxylic acid esters, giving improvements of the enzyme performance from V(S)/(E(t)) = 1.56 mmol/h g and V(S)/V(R) = 41.9 of (R,S)-ethyl 3-chloromandelate (9) for the free esterase to 39.4 mmol/h g and 401 of (R,S)-2-methoxyethyl 3-chloromandelate (16) for the immobilized enzyme, V(S)/(E(t)) = 5.46 mmol/h g and V(S)/V(R) = 8.27 of (R,S)-ethyl 4-chloromandelate (10) for free SNSM-87 to 33.5 mmol/h g and 123 of (R,S)-methyl 4-chloromandelate (14) for the immobilized enzyme, as well as V(S)/(E(t)) = 3.0 mmol/h g and V(S)/V(R) = 7.94 of (R,S)-ethyl 3-phenyllactate (11) for the free esterase to 40.7 mmol/h g and 158 of (R,S)-2-methoxyethyl 3-phenyllactate (18) for the immobilized enzyme. The great enantioselectivty enhancement is rationalized from the alteration of ionization constants of imidazolium moiety of catalytic histidine for both enantiomers and conformation distortion of active site after the covalent immobilization, as well as the selection of leaving alcohol moiety via substrate engineering approach.     

新颖微生物低温酯酶EstP8的酶学性质研究与在手性催化中的应用

从假单胞菌Pseudonocardia antitumoralis HUP007基因组中克隆了一个1 041bp的酯酶基因EstP8,编码的蛋白具有377个氨基酸残基。在E.coli BL21（DE3）中实现酯酶EstP8的高效异源表达和纯化。EstP8为脂肪酶家族Ⅳ中的一员,具有HGGG保守序列。EstP8最适底物为对硝基苯酚乙酸酯（p-NPO）,最适温度和pH分别为50℃和8.0。EstP8催化p-NPO水解反应的活性、V_max和K_m分别达到105.19U/mg、89.4μM/min、1.144mM。EstP8在pH7.0~8.0范围内具有良好的pH稳定性;在4℃时,酯酶相对活力为41.78%,在10~40℃内具有很好温度稳定性。EstP8对大部分金属离子有很好的耐受性,低浓度的Cu²⁺、Mn²⁺、Zn²⁺对该酶的活性有激活作用。辛烷、庚烷、甲苯、丙酮、DMF等有机溶剂对EstP8的活性同样具有激活作用。酯酶EstP8还可以通过水解拆分高效地制备手性（R）-1-苯基乙醇;添加有机溶剂可以很好地促进该酯酶的光学选择性和产率,在共溶剂甲苯的存在下,所制备的（R）-1-苯基乙醇的e.e.和产率可达91%和18%;在共溶剂DMSO的存在下,所制备的（S）-乙酸苏合香酯的e.e.和产率可达98%和60%。酯酶EstP8在手性生物催化等诸多工业领域有很好的应用潜力。     

(3R)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯水解酶产生菌的筛选与产酶条件优化

以2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯为唯一碳源,采用手性气相法检测,筛选到一株能产对映选择性水解酶的假单胞菌Pseudomonas CGMCC No.4184.该菌产的水解酶能优先水解R型底物产生(3R)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸,产物对映体过量值达到90%以上.对菌株Pseudomonas CGMCC ...     

新颖深海微生物酯酶EstC11的酶学性质及其在手性拆分乙酸苏合香酯中的应用

【背景】手性乙酸苏合香酯是重要的手性香料产品,在食品及精细化工等领域都有重要的应用。酶催化不对称合成手性乙酸苏合香酯产品具有极好的工业应用前景。【目的】研究酯酶EstC11的基本酶学性质及其在制备手性乙酸苏合香酯中的应用。【方法】对来自西太平洋深海热液口芽孢杆菌Bacillus sp.CX01中的新颖微生物酯酶基因EstC11进行克隆、表达及酶学性质鉴定。通过对p H、温度、有机溶剂等反应条件的优化提高酯酶手性拆分乙酸苏合香酯的光学纯度。【结果】酯酶EstC11的最适反应p H为8.5,最适温度为25°C,一些金属离子和有机溶剂对酯酶EstC11的水解活性具有不同程度的抑制作用。通过对反应条件的优化,在最适反应条件下(p H 9.0 50 mmol/L Tris-HCl,20°C,50 mmol/L底物浓度)反应3 h后,(R)-乙酸苏合香酯的光学纯度达98%,得率为39%。【结论】通过对酯酶拆分条件的优化,手性拆分乙酸苏合香酯生成(R)-乙酸苏合香酯的光学纯度明显提高,为酯酶EstC11在工业化上的应用奠定了基础。     

Isolation and characterization of sialate 9(4)-O-acetylesterase from influenza C virus

An esterase was isolated from influenza C virus with a specific activity from 1.7-5 U/mg protein, and its substrate specificity was tested with various naturally occurring O-acylated sialic acids, synthetic carbohydrate acetates, and other esters. The enzyme hydrolyses only acetic acid esters at significant rates. The non-natural substrates 4-methyl-umbelliferyl acetate, 4-nitrophenyl acetate, and alpha-naphthyl acetate are cleaved at highest hydrolysis rates, followed by the natural substrate N-acetyl-9-O-acetylneuraminic acid. The esterase also acts on N-glycoloyl-9-O-acetylneuraminic acid and, much slower, on N-acetyl-4-O-acetylneuraminic acid; N-acetyl-7-O-acetylneuraminic acid is not hydrolysed. 2-Deoxy-2,3-didehydro-N-acetyl-9-O-acetylneuraminic acid is also a substrate for this enzyme, however, 6-O-acetylated N-acetylmannosamine and glucose are not. Esterification of the carboxyl function of sialic acids strongly reduces or prevents esterase action on O-acetyl groups. The carboxyl ester is not hydrolysed. The relative cleavage rates also depend on the type of the non-sialic acid part of the molecule. N-Acetyl-9-O-acetylneuraminic acid as component of sialyllactose and rat serum glycoprotein shows hydrolysis rates close to the free form of this sugar, while acetyl ester groups of bovine submandibular gland mucin and rat erythrocytes are hydrolysed at slower rates. Gangliosides and 4-O-acetylated glycoproteins are no substrates for the purified enzyme. A slow hydrolysis is observed by incubation of 9-O-acetylated GD1a with intact influenza C viruses. As other natural acetyl esters (acetyl-CoA and acetylthiocholine iodide) are not hydrolysed, the enzyme can be classified as sialate 9(4)-O-acetylesterase (EC 3.1.1.53).     

Purification and characterization of a proteinase from Euphausia superba Dana (Antarctic krill)

The thiol-dependent serine proteinase (inhibited by DFP, PMSF, pCMB and iodoacetate) was isolated from the whole krill specimens and from the content of the krill digestive tract. The enzyme was purified to homogeneity using a seven-step procedure. Its specific activity with denatured haemoglobin as a substrate was about 6.0 unit/mg. The molecular weight of the enzyme, as determined by gel exclusion chromatography was 33 000 and by polyacrylamide gel electrophoresis with SDS 31 600 (12.5% gel) and 27 000 (7.5% gel). The enzyme is an acidic glycoprotein (pI below 2.9) containing about 5% of carbohydrate. The pH optimum of the enzyme with haemoglobin was 6.0 at the optimal temperature of 40 degrees C in 15-min reaction. The enzyme showed the esterase activity (hydrolysis of BAEE) and was inactive with carbobenzoxy- and benzoyl-dipeptides with the following C-terminal amino acids: Phe, Tyr, Lys, Gly and Leu.     

猪肝酯酶催化苯乙二醇环碳酸酯水解最佳反应条件的研究

猪肝酯酶是手性合成中重要的水解酶,在猪肝酯酶的催化下,苯乙二醇环碳酸酯发生水解,生成苯乙二醇。实验围绕影响猪肝酯酶催化反应活性的4个主要因素进行了系统研究,得到了最优的酶浓度（15g/L）、pH值（8.0）、温度（25~30℃）及有机溶剂种类和浓度（二氧六环,65%v/v）,为猪肝酯酶催化苯乙二醇环碳酸酯反应的进一步研究奠定了基础。