恒细胞密度发酵策略提高重组毕赤酵母生产碱性果胶酶的表达效率

为了提高重组毕赤酵母生产碱性果胶酶(Alkaline polygalacturonate lyase,PGL)的比速率,开发了一种新的恒细胞密度发酵策略。通过不同的甲醇流加方式,实现发酵过程细胞密度的合理控制。实验结果表明:控制细胞密度为75 g/L的策略为最优,最终单位发酵液体积生产强度和单位菌体生产强度为6.11 U/(mL.h)和81.5 U/(g.h),分别比传统高密度发酵提高了42.1%和191.2%,最终PGL酶活为441.9 U/mL。此外,该策略还具有提高细胞活性和降低蛋白酶降解作用等优势。     

正常人肝脏星形细胞的分离,培养及鉴定

参考Friedman等分离人肝脏星形细胞(HSC)的方法,采用校正密度的淋巴细胞分离液进行一步梯度离心,成功地分离得到了正常人HSC。HSC的收获量约为1×10~7个/10克肝脏组织,存活率在95％以上,纯度达85％以上。传代后纯度接近100％。对人HSC的标志物进行检测发现,结蛋白不宜作为鉴定初分离的及原代培养初期人HSC纯度的指标,而α-平滑肌肌动蛋白可作为鉴定激活的人HSC的可靠指标。     

碱性果胶酶在重组毕赤酵母中高效表达的关键因素研究

为提高重组毕赤酵母生产碱性果胶酶的产量和生产强度, 在摇瓶条件下优化了重组毕赤酵母生产碱性果胶酶的关键因素。结果表明, 以下条件：初始甘油浓度40 g/L、初始甲醇浓度3.1 g甲醇/g DCW、每24 h添加0.51 g甲醇/g DCW、诱导表达周期72 h、250 mL三角瓶诱导培养基装液量30 mL、初始pH 6.0, 最适于菌体生长与产物表达。在此基础上, 7 L罐上通过恒速流加甘油进一步提高细胞密度, 诱导阶段甲醇采取前期恒速流加和后期DO-stat, 发酵结束菌体干重达80 g/L, 酶活为217 U/mL, 比摇瓶结果提高了66.2%。     

浆水直投式增香酵母冻干菌剂制备工艺的优化

以一株分离自甘肃天水传统酿造浆水中的产香酵母——异常汉逊酵母（Hansenula anomala）Y16为供试菌株,经高密度发酵后,采用Plackets-Burman试验、最陡爬坡实验及响应面法（response surface methodology,RSM）,对其直投式增香酵母冻干菌剂的制备工艺进行优化。结果表明,经高密度增殖培养后,酵母Y16细胞浓度可达9.2×1010 CFU/mL;收集Y16发酵液的最佳离心条件：Y16发酵液经1 600 g离心10 min,离心沉降活细胞率为95.5%;冻干保护剂最佳组合配方：11%脱脂奶粉,9%蔗糖,12%海藻糖,在该条件下,冻干菌剂中酵母存活率为91.54%。经上述工艺制备的增香发酵剂保存3个月仍具有较好的贮藏稳定性。此外,浆水模拟发酵试验的结果表明,浆水风味优良。研究结果为浆水工业化生产提供了良好的增香发酵剂来源。     

利用高通量生物反应器优化一种CHO细胞无血清培养基

研究以DMEM/F12(1:1 V/V)培养基为基础,添加不同添加剂优化一种适宜CHO DG44细胞生长的廉价培养基。以细胞密度和细胞活率为主要指标,对DMEM/F12(1:1 V/V)培养基进行了优化。通过正交试验和单因素试验筛选出了CHO DG44细胞生长的最佳培养基。正交试验结果表明添加8mg/L Insulin、10mg/L Transferrin、12mM Glutamine、9mg/L Ethanolamine、9mg/L Sodium selenite、0.5×Lipids、0.5×Vitamin,对细胞生长有较好促进作用,细胞密度从0.6×106 cells/mL上升到1.8×106 cells/mL。在此基础上添加2.5g/L Malt Peptone和2.5g/L YeastExtract可使细胞密度达到2.65×106 cells/mL,基本上达到商业培养基的培养效果,而成本降低了约60%。     

出芽短梗霉膨大细胞分选及产糖分析

本研究运用Percoll密度梯度离心的方法对出芽短梗霉Aureobasidium pullulans的两种细胞形态进行分选,并对两种形态的细胞进行多糖产量的分析。通过对转速、分选时间、Percoll分离液浓度的优化,确定了两种细胞形态分选效果最佳的条件是Percoll分离液浓度为60%、转速为5 000r/min、离心时间为30min。经过光学显微镜和透射电子显微镜观察发现上层为酵母状细胞（YL）、下层为膨大细胞（SC）,并发现膨大细胞外有明显的薄膜包被,且产大量多糖。也为今后在相应状态下研究出芽短梗霉膨大细胞的其他代谢机理提供了可行的方法,满足后续研究的需要。     

狂犬病毒单克隆抗体CHO细胞灌流培养中细胞特异性灌流速率的研究

目的 研究灌流培养中,不同的细胞特异性灌流速率(cell specific perfusion rate, CSPR)对狂犬病毒单克隆抗体CHO细胞生长及抗体蛋白表达的影响,摸索适合本细胞株灌流培养的CSPR。方法 在标号为CSPR 1～5[CSPR1;0.02 nL/(细胞·d)、CSPR2:0.03 nL/(细胞·d)、CSPR3:0.04 nL/(细胞·d)、CSPR4:0.05 nL/(细胞·d)、CSPR5:0.06 nL/(细胞·d),每组3个重复]的15个TPP管中按100万个/mL的初始密度接种相同的CHO种子细胞;摇床中,以转速225 r/min、CO₂浓度5.0%、湿度80%和温度37℃的条件培养细胞;以后每天取细胞样品,分别检测活细胞密度(viable cell density, VCD)、细胞活率、葡萄糖浓度、乳酸浓度和渗透压。接种3 d起,每天分别从CSPR 1～5的各管中,按0.02～0.06 nL/(细胞·d)的CSPR计算所需要更换的细胞悬液体积,将各管中的细胞悬液离心,取出相应体积的上清并补入相同体积的新鲜培养液重悬细胞后,继续培...     

人早孕胎盘绒毛膜滋养层细胞体外培养模型的建立

目的通过对早孕胎盘绒毛膜滋养层细胞的分离,纯化和培养,寻找一种稳定、简便可获得较高纯度滋养层细胞的培养方法。方法通过胰酶/DNA酶联合消化法对妊娠6-10周绒毛组织进行消化,获得单细胞悬液,比较Per-coll密度梯度离心和淋巴细胞分离液对滋养层细胞的分离纯化效果。含10?S的DMEM/F12培养基培养,并比较是否应用鼠尾胶原对细胞贴壁和生长的影响。通过免疫荧光方法对滋养层细胞进行鉴定。结果经简化Percoll密度梯度离心分离纯化的滋养层细胞纯度高,明显优于淋巴细胞分离液的分离效果(P<0.001);细胞生长表面预先经鼠尾胶原处理后,细胞贴壁良好,分裂生长旺盛。结论利用简化Percoll密度梯度离心法分离细胞,并在应用鼠尾胶原的条件下进行培养,可以获得满意的人绒毛膜滋养层细胞的体外培养模型。     

利用游离型表达质粒强化毕赤酵母表达木聚糖酶

巴斯德毕赤酵母是用途广泛的蛋白表达系统。目前用于毕赤酵母的质粒主要以整合型质粒为主,很少见到游离的质粒用于外源基因的表达。文中通过将来源于酵母自身的自主复制序列连接到酵母整合型表达载体pGAP中构成自主复制的游离型表达载体pGAPZαA-PARS,将该载体用于表达木聚糖酶基因。转化毕赤酵母后同传统的整合型表达菌株相比,以甘油为碳源时最高酶活达到343 U/mL,比整合型表达提高了45.9%。同时游离载体表达重组酶比活相对整合表达提高了81.2%。为了节约发酵成本,进一步研究了分别以甘油、葡萄糖、蔗糖、混合碳源(蔗糖︰甘油=1︰2)等不同碳源下游离型重组菌株的表达水平。发现甘油表达水平最高,蔗糖最低,但是以工业葡萄糖为碳源时产酶成本最低。由于pGAP载体不需要以甲醇为碳源,因而文中所构建的游离载体pGAPZαA-PARS极大促进了毕赤酵母在食品行业中的应用。同时,游离型载体可大幅度提高表达水平,为进一步研究提高GAP启动子的高效表达奠定了基础。     

薰衣草细胞悬浮培养体系的优化

采用正交设计方法对影响薰衣草悬浮细胞生长的因素进行了优化研究,筛选了最有利于薰衣草悬浮细胞生长的培养条件:含有0.025mg/L2,4-D、0.5mg/L6-BA、40g/L蔗糖的B5培养基和120r/min的转速,在此条件下培养15天,悬浮活细胞密度可达到4.4×105个/ml;经过3个月的培养,悬浮细胞的分化率可达到90%以上。通过分析薰衣草细胞对残糖的消耗规律,探讨了蔗糖浓度影响活细胞密度的原因。     

重组人干扰素ω在对数生长期毕赤酵母中的高效表达特性研究

用不同比生长速率μ的毕赤酵母探讨其表达外源重组蛋白的差异性,通过起始pH值、甲醇诱导浓度和周期、菌体浓度、装液量等实验,优化具有较高μ的对数生长期毕赤酵母表达rhIFNω的摇瓶条件。结果表明,μ对毕赤酵母表达rhIFNω有显著影响。μ为0.1612h-1的毕赤酵母表达rhIFNω最高为558mg/L,较μ为0.1321、0.0505和0.0052h-1的毕赤酵母分别提高50%、68%和99%。对数生长期的毕赤酵母表达rhIFNω的最适摇瓶表达条件为:250mL摇瓶装入30mL BMMY,控制菌体浓度达到200~300g/L(WCW),起始pH值自然,每24h添加甲醇15g/L一次,诱导表达周期为4d。通过表达条件的优化,rhIFNω的表达量达到1070mg/L,较优化前提高149%。     

应用流式细胞术检测毕赤酵母的细胞活性

选取两种细胞活性染色试剂二乙酸荧光素(fluoresceindiacetate,FDA)和碘化丙锭(propidiumiodide,PI),应用流式细胞术(flowcytometry,FCM)检测毕赤酵母细胞活性。比较FDA/PI双染色与PI单染色的FCM图谱,后者能够很好地将死活细胞区分开来并得到正确的比例。利用PI单染色检测发酵过程细胞活性的变化,甘油补料阶段几乎没有细胞死亡,进入甲醇补料阶段后,随着细胞密度的增加,细胞的活性不断降低,发酵88h时细胞活性仅为73.8%。     

来源于Escherichia coli的高比活植酸酶基因的高效表达

高效表达高比活植酸酶是进一步提高植酸酶发酵效价、降低植酸酶生产成本的一个有效途径。对源于Escherichiacoli的高比活植酸酶基因appA ,按照毕赤酵母 (Pichiapastoris)密码子的偏爱进行了密码子优化改造。该改造后的基因appA m按正确的阅读框架融合到毕赤酵母表达载体pPIC9上的α 因子信号肽编码序列 3′端 ,通过电击转化得到重组转化子。对重组毕赤酵母的Southernblotting分析证实植酸酶基因已整合到酵母基因组中 ,并确定了整合基因的拷贝数。Northernblotting分析证实植酸酶基因得到了正常转录。SDS PAGE分析和表达产物的研究表明 ,植酸酶得到了高效分泌表达 ,在 5L发酵罐中植酸酶蛋白表达量达到 2 5mg mL发酵液 ,酶活性 (发酵效价 )达到 7 5× 10 6 IU mL发酵液以上 ,大大高于目前报道的各种植酸酶基因工程菌株的发酵效价。     

流式细胞术检测毕赤酵母发酵过程中胞内活性氧水平

以2′,7′-二氢二氯荧光黄双乙酸钠(DCFH-DA)和碘化丙锭(PI)为标记探针,通过DCFH-DA/PI双染色与PI单染色的对照,检测毕赤酵母胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)的水平及其影响。研究发现发酵过程细胞活性下降与胞内ROS积累相关。在甘油生长期,细胞几乎没有ROS积累,细胞活性接近100%。在甲醇诱导初期,部分细胞积累少量的ROS,细胞活性仍然很高,死亡细胞所占比例只有1.5%。在甲醇诱导后期,94.0%的细胞积累了大量的ROS,高含量的ROS造成细胞损伤,引起部分细胞丧失了活性,在总共29.1%的死亡细胞中,高ROS积累的死亡细胞占了25.4%。     

Two-step sedimentation process for selection of microcapsules containing cell aggregates

Microencapsulation technologies are being developed to protect transplanted islets from immune rejection, to reduce or even eliminate the need for immunosuppression. However, unencapsulated cells increase the chances of rejection and empty beads increase transplant volumes. Thus, separation processes were investigated to remove these byproducts based on density differences. The densities of islet-sized mouse insulinoma 6 (MIN6) cell aggregates and acellular 5% alginate beads generated via emulsification and internal gelation were ~ 1.065 and 1.042 g/ml, respectively. The separation of empty beads from those containing aggregates was performed by sedimentation under unit gravity in continuous gradients of polysucrose and sodium diatrizoate with density ranges of 1.032–1.045, 1.035–1.044, or 1.039–1.042 g/ml. The 1.039–1.042 g/ml gradient enabled recoveries of ~ 80% of the aggregate-containing beads while the other gradients recovered only ~ 60%. The bottom fraction of the 1.039–1.042 g/ml gradient contained beads with ~ 6% of their volume occupied by cell aggregates. Separation of unencapsulated aggregates from the aggregate-containing beads was then achieved by centrifugation of this purified fraction in a 1.055 g/ml density solution. Thus, these sedimentation-based approaches can effectively remove the byproducts of cell encapsulation.     

The development of metabolomic sampling procedures for Pichia pastoris, and baseline metabolome data

Metabolic profiling is increasingly being used to investigate a diverse range of biological questions. Due to the rapid turnover of intracellular metabolites it is important to have reliable, reproducible techniques for sampling and sample treatment. Through the use of non-targeted analytical techniques such as NMR and GC-MS we have performed a comprehensive quantitative investigation of sampling techniques for Pichia pastoris. It was clear that quenching metabolism using solutions based on the standard cold methanol protocol caused some metabolite losses from P. pastoris cells. However, these were at a low level, with the NMR results indicating metabolite increases in the quenching solution below 5% of their intracellular level for 75% of metabolites identified; while the GC-MS results suggest a slightly higher level with increases below 15% of their intracellular values. There were subtle differences between the four quenching solutions investigated but broadly, they all gave similar results. Total culture extraction of cells + broth using high cell density cultures typical of P. pastoris fermentations, was an efficient sampling technique for NMR analysis and provided a gold standard of intracellular metabolite levels; however, salts in the media affected the GC-MS analysis. Furthermore, there was no benefit in including an additional washing step in the quenching process, as the results were essentially identical to those obtained just by a single centrifugation step. We have identified the major high-concentration metabolites found in both the extra- and intracellular locations of P. pastoris cultures by NMR spectroscopy and GC-MS. This has provided us with a baseline metabolome for P. pastoris for future studies. The P. pastoris metabolome is significantly different from that of Saccharomyces cerevisiae, with the most notable difference being the production of high concentrations of arabitol by P. pastoris.     

呼吸商监控毕赤酵母表达猪α干扰素活性水平的研究

在5L发酵罐下开展毕赤酵母流加培养表达pIFN-α研究。通过多批次研究,结果表明：诱导阶段,RQ稳定情况可以作为反映底物甲醇浓度水平是否合适以及pIFN-α活性高低的监控指标。当甲醇浓度在8～12g/L水平时,RQ在整个诱导阶段能稳定在0.4～0.5之间某个特定值上,同时pIFN-α最高活性都能维持在106IU/mL水平上;而当甲醇浓度在0～5g/L或15～20g/L范围内时,RQ很不稳定,分别在0.15～0.4和0.4～0.8区间上下振动,相应的pIFN-α最高活性也只在10^3IU/mL和10^4IU/mL水平上。     

甘露聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达及酶学性质研究

采用PCR的方法,以枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis基因组 DNA 为模板,克隆出甘露聚糖酶MAN的成熟肽编码序列,将其插入巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris表达载体pPIC9K中,并位于α-因子信号肽序列的下游,获得重组质粒pPIC9K-MAN。重组质粒线性化后用聚乙二醇法导入毕赤酵母Pichia pastoris菌株GS115中,经大量筛选,获得高效分泌表达甘露聚糖酶的毕赤酵母工程菌株MAN22。将此菌株在5 L发酵罐中进行高密度发酵,测定酶活最高达1102IU /mL,同时对重组甘露聚糖酶的性质进行了初步研究。     

EMA-LAMP方法快速检测鉴别副溶血性弧菌

建立将DNA染料EMA(ethidium bromide monoazide)结合环介导等温扩增技术(loop-mediated isother-mal amplification,LAMP)的方法(EMA-LAMP),用于检测鉴别副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)死/活菌细胞。针对副溶血性弧菌不耐热溶血素基因tlh(thermolabile hemolysin)特异性序列的6个位点设计4条引物及2条环引物,进行检测。结果表明,浓度为8.0μg/mL或更高浓度的EMA,至少经25 min的曝光处理,能够有效抑制浓度为1×108cfu/mL的副溶血性弧菌死细胞的扩增,而对用相同浓度EMA处理的副溶血性弧菌活细胞扩增没有影响。经EMA处理,含有不同比例的副溶血弧菌死细胞和活细胞的混合液中,活菌的最小检测限为1.0×102cfu/mL。EMA-LAMP方法比EMA-PCR方法区分死活细胞中的活细胞更为有效,是一种能够快速、灵敏且更为有效鉴别副溶血性弧菌死活细胞的新方法。