炭疽杆菌保护性抗原（PA）重组腺病毒的构建及免疫效果分析

探讨利用腺病毒载体作为炭疽杆菌基因工程疫苗载体的可行性。从载体pcDNA3.1-PA上PCR扩增PA片断,将该片断克隆入质粒pAdTrack-CMV,得到阳性克隆pAdTrack-PA。PmeI线性化的阳性克隆转化含有腺病毒骨架质粒pAdeasy-1的BJ5183感受态细胞,经同源重组后得到重组腺病毒vAd-PA。vAd-PA经PacI线性化后,脂质体介导转染293细胞,经Western-blot检测表明PA在293细胞中得到表达。重组病毒肌肉注射免疫BALB/c小鼠,用ELISA方法检测血清中产生了特异性抗体,抗体滴度计算几何均数为1:2800。该研究为进一步研究以腺病毒为活载体的疫苗奠定了基础。     

炭疽芽孢杆菌保护性抗原在大肠杆菌中的表达及纯化

按照炭疽芽孢杆菌保护性抗原（PA）基因成熟肽编码序列设计引物,从炭疽杆菌pOX1质粒中扩增出PA基因片段,将该片段定向插入到原核表达载体pET-28a中,获得了pET-PA原核表达重组质粒,限制性酶切分析和DNA序列测定均证实该克隆插入片段为PA基因的成熟呔编码序列。将该重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导,重组蛋白在大肠杆菌表达系统中获得了高效表达;Western印迹分析表明表达产物具有良好的免疫学活性。     

炭疽杆菌保护性抗原基因的克隆与序列测定

采用聚合酶链反应从炭疽芽孢杆菌减毒株ＹＢ１中扩增其保护性抗原（ＰＡ）的编码区基因,将其克隆至ｐＧＥＭ－Ｔ载体中,并分步测定其序列。序列测定表明,该基因长２２０５ｂｐ,编码７３５个氨基酸残基,与献报道的标准菌株Ｓｔｅｒｎｅ株的ＰＡ序列只有４个碱基的差异。     

炭疽杆菌保护性抗原在大肠杆菌中的表达及其纯化

利用基因重组技术获取炭疽杆菌保护性抗原(PA)。将炭疽杆菌保护性抗原编码基因pag与pET载体连接构建重组质粒,转化大肠杆菌DE3株,诱导表达炭疽杆菌保护性抗原,并经亲和层析及凝胶过滤纯化此抗原。实验成功构建了表达炭疽杆菌保护性抗原的重组菌株,纯化后PA纯度达90%,且经检测纯化产物具有天然PA的生物学活性。同时表明从大肠杆菌中纯化PA较以往从炭疽杆菌中获取PA简便易行。     

重组炭疽保护性抗原的表达、纯化与生物活性分析

构建分泌型表达质粒 ,在大肠杆菌中实现了重组炭疽保护性抗原 (rPA)的分泌型表达。重组蛋白位于细菌外周质 ,表达量约占菌体总蛋白的 10 %。以离子交换、疏水层析和凝胶过滤为基础 ,建立了rPA的纯化工艺 ,每升培养物可获得约 15mgrPA ,纯度可达 95 %以上。体外细胞毒性试验显示rPA具有较好的生物学活性。用rPA免疫家兔产生的抗血清在体外可抑制炭疽致死毒素的活性 ,表明rPA可诱导机体产生保护性免疫。以上结果为今后发展新一代炭疽疫苗打下基础     

针对炭疽保护性抗原不同结构域的中和性单克隆抗体的筛选和鉴定

炭疽保护性抗原（PA）是炭疽毒素的重要组分,同时也是现有炭疽疫苗的主要有效成分,在炭疽杆菌的致病与免疫中发挥关键作用。以重组PA为免疫原,采用B淋巴细胞杂交瘤技术,结合炭疽毒素敏感细胞的毒性中和试验,大量筛选抗PA单克隆抗体,获得了9株炭疽毒素中和性单抗。进一步分析表明这些单抗以IgG1亚类为主,分别识别PA 3个结构域的4个不同中和表位区。针对结构域2的4株单抗识别同一表位区,其中3株单抗的中和活性强于抗PA多抗;针对结构域4的4株单抗识别两个不同表位区;另有1株单抗识别位于结构域3的表位。实验结果提示PA具有多个中和表位,分别位于其不同结构域,其中结构域2、4包含主要中和表位。实验中获得的针对不同表位的中和性单抗为深入研究PA的免疫保护机理提供了工具,也为研制针对炭疽毒素的被动免疫制剂和治疗药物打下基础。     

炭疽芽胞杆菌疫苗研究进展

炭疽芽胞杆菌引起的炭疽病死亡率非常高 ,当前的疫苗具有效力不稳定、对吸入性炭疽的保护率低、免疫程序繁琐、存在副作用等缺点。近年来人们在改造传统疫苗的同时又有一些新的发现 ,如保护性抗原 (PA)的抗体在体内可杀死芽胞 ;通过粘膜免疫能够诱导机体分泌IgA抗体 ;抗多聚谷氨酸 (γ D PGA)抗体可以同炭疽杆菌的繁殖体作用 ,从而杀死繁殖体 ;寻找到新的免疫原。DNA疫苗、活载体疫苗的出现为新一代安全、免疫程序简单、具更高保护率的疫苗奠定了基础     

利用组氨酸合成酶基因作为同源双交换序列构建在乳酸乳球菌中表达炭疽杆菌保护性抗原的载体

目的:为了实现炭疽杆菌保护性抗原(PA)在乳酸乳球菌中的整合性表达,利用组氨酸合成酶基因(HISB)作为同源交换序列构建表达PA的载体。方法:采用PCR等方法将酸启动子P170、红霉素抗性基因、HISB及酶切位点克隆到pMD18-T载体上,命名为pHEC-P170-PA。结果:构建好的双交换载体经酶切电泳鉴定并测序,其序列中含有PA基因。结论:构建了炭疽杆菌保护性抗原基因同源双交换载体。     

含EB病毒核抗原1重组腺病毒的构建及其在小鼠中免疫效果研究

构建含EB病毒核抗原1(ebna1)重组腺病毒疫苗防治鼻咽癌,并为鼻咽癌疫苗的研究提供药效学资料。PCR法扩增B95-8细胞株中ebna1的C-端部分片段,EcoRI和BglⅡ酶切后插入pDC316穿梭质粒,ebna1片段测序比对正确后,与腺病毒骨架质粒pBHG共转染293细胞。收集病变后细胞,通过流式细胞仪和Western blot检测EBNA1在293细胞中的表达。电镜下观察所获得的病毒颗粒大小,TCID50法确定重组腺病毒滴度。以2×108 VP/只的rAd-ebna1免疫BALB/c小鼠。在免疫结束后的第1、2、4和8周检测小鼠体内EBNA1特异性细胞免疫应答的水平变化。结果显示,经PCR扩增获得约900bp ebna1目的片段,测序结果与标准株序列一致,质粒共转染293细胞后,细胞出现病变,获得含EB病毒核抗原1重组腺病毒(rAd-ebna1),流式细胞仪和Western blot检测结果证实,ebna1在细胞中正确转录表达,收获病毒二代滴度可达108 TCID50/mL。rAd-ebna1免疫小鼠后,能够激活EBNA1的CD4+T细胞特异性细胞免疫应答。本实验成功构建了含ebna1片段的重组腺病毒,并具激活CD4+T细胞免疫应答活性。     

Expression and secretion of the protective antigen of Bacillus anthracis in Bacillus brevis

We used the Bacillus brevis-pNU212 system to develop a mass production system for the protective antigen (PA) of Bacillus anthracis. A moderately efficient expression-secretion system for PA was constructed by fusing the PA gene from B. anthracis with the B. brevis cell-wall protein signal-peptide encoding region of pNU212, and by introducing the recombinant plasmid, pNU212-mPA, into B. brevis 47-5Q. The clone producing PA secreted about 300 microg of recombinant PA (rPA) per ml of 5PY-erythromycin medium after 4 days incubation at 30 degrees C. The rPA was fractionated from the culture supernatant of B. brevis 47-5Q carrying pNU212-mPA using ammonium sulfate at 70% saturation followed by anion exchange chromatography on a Hitrap Q, a Hiload 16/60 Superdex 200 gel filtration column and a phenyl sepharose hydrophobic interaction column, yielding 70 mg rPA per liter of culture. The N-terminal sequence of the purified rPA was identical to that of native PA from B. anthracis. The purified rPA exhibited cytotoxicity towards J774A.1 cells when combined with lethal factor. The rPA formulated in either Rehydragel HPA or MPL-TDM-CWS adjuvant (Ribi-Trimix) elicited the expression of a large amount of anti-PA and neutralizing antibodies in guinea pigs and completely protected them against a 100 LD50 challenge with fully virulent B. anthracis spores.     

表达流感病毒神经氨酸酶基因的重组腺病毒的构建

通过RT-PCR方法扩增流感病毒神经氨酸酶基因,将其克隆到腺病毒穿梭载体pTrackCMV,此重组质粒与腺病毒DNA共转化大肠杆菌BJ5183,通过细菌内同源重组获得重组腺病毒DNA,将其转染293细胞获得重组腺病毒.经PCR证实目的基因已整合至腺病毒基因组中,western blot检测到神经氨酸酶的表达.重组病毒经滴鼻和灌胃两种途径免疫小鼠,结果表明2次免疫后滴鼻组和灌胃组均产生明显的免疫应答反应,滴鼻组的免疫效果优于灌胃组.     

表达流感病毒神经氨酸酶基因的重组腺病毒的构建

通过RT-PCR方法扩增流感病毒神经氨酸酶基因,将其克隆到腺病毒穿梭载体pTrackCMV,此重组质粒与腺病毒DNA共转化大肠杆菌BJ5183,通过细菌内同源重组获得重组腺病毒DNA,将其转染293细胞获得重组腺病毒。经PCR证实目的基因已整合至腺病毒基因组中,western blot检测到神经氨酸酶的表达。重组病毒经筋鼻和灌胃两种途径免疫小鼠,结果表明2次免疫后滴鼻组和灌胃组均产生明显的免疫应答反应,滴鼻组的免疫效果优于灌胃组。     

Efficacy of non-toxic deletion mutants of protective antigen from Bacillus anthracis

Current human anthrax vaccines available in the United States and Europe consist of alum-precipitated supernatant material from cultures of a toxigenic, nonencapsulated strain of Bacillus anthracis. The major component of human anthrax vaccine that confers protection is protective antigen (PA). A second-generation human vaccine using the recombinant PA (rPA) is being developed. In this study, to prevent the toxicity and the degradation of the native rPA by proteases, we constructed two PA variants, delPA (163-168) and delPA (313-314), that lack trypsin (S(163)-R(164)-K(165)-K(166)-R(167)-S(168)) or chymotrypsin cleavage sequence (F(313)-F(314)), respectively. These proteins were expressed in Bacillus brevis 47-5Q. The delPAs were fractionated from the culture supernatant of B. brevis by ammonium sulfate at 70% saturation, followed by anion exchange chromatography on a Hitrap Q, Hiload 16/60 superdex 200 gel filtration column and phenyl sepharose hydrophobic interaction column. In accordance with previous reports, both delPA proteins combined with lethal factor protein did not show any cytotoxicity on J774A.1 cells. The delPA (163-168) and delPA (313-314) formulated either in Rehydragel HPA or MPL-TDM-CWS (Ribi-Trimix), elicited a comparable amount of anti-PA and neutralizing antibodies to those of native rPA in guinea pigs, and confers full protection of guinea pigs from 50xLD50 of fully virulent B. anthracis spore challenges. Ribi-Trimix was significantly more effective in inducing anti-PA and neutralizing antibodies than Rehydragel HPA. These results indicate the possibility of delPA (163-168) and delPA (313-314) proteins being developed into nontoxic, effective and stable recombinant vaccine candidates.     

HIV-1 gagpol重组腺病毒疫苗的构建及其免疫原性的研究

目的：构建HIV-1重组腺病毒疫苗并初步鉴定其免疫原性。方法：用Adeno-XExpressionSystem试剂盒将HIV—lgagpol基因片段插入到腺病毒载体上,通过脂质体介导将获得的重组腺病毒质粒Adeno—X-gagpol转染至293细胞,使之自主包装成有感染活性的重组腺病毒tad—gagpol,用western-blotting法鉴定其表达情况;用CsCl密度梯度离心法纯化该重组腺病毒,以5×10^8 pfu／mL的滴度lmL单次免疫小鼠,15天后测小鼠体液免疫效果。结果：克隆序列与设计相符,重组腺病毒疫苗能稳定表达gag—pol蛋白,体液免疫中检测出抗p55和p24的特异性抗体。结论：HIV—lgagpol重组腺病毒构建成功,具有一定的体液免疫原性。     

表达狂犬病病毒糖蛋白的重组犬2型腺病毒的构建

本试验以犬2型腺病毒全基因组重组质粒pPolyⅡ-CAV-2及其E3区重组质粒pVAX-E3为基础,通过DraⅢ和SspⅠ双酶切,缺失第25097bp-26141bp共1044bp的E3区片段,按与编码链相同转录方向插入由CMV启动子、狂犬病病毒SRV\-9株糖蛋白基因、SV40 polyA基因构成的总长2424bp的表达盒,获得重组基因组质粒pPolyⅡ-CAV-2-CGS(34.7kb).以AscⅠ和ClaⅠ双酶切,游离重组基因组(32.7kb),在脂质体Lipofectamine TM 2000介导下,转染MDCK细胞系,获得了E3缺失区携带狂犬病病毒糖蛋白表达盒的重组犬2型腺病毒CAV-2-CGS.Western印迹试验表明,CAV-2-CGS表达了狂犬病病毒糖蛋白.初步接种试验显示,重组病毒可以诱导犬产生狂犬病病毒特异性抗体.