Sos恢复系统--一种新型的酵母双杂交系统

Sos恢复系统是一种新型的不依赖转录激活机制的酵母双杂交系统,原理是通过蛋白质的相互作用将Sos富集在细胞膜上激活Ras信号通路,使得酵母温度敏感缺陷株可以在限制温度下生长。与传统的酵母双杂交系统相比,Sos恢复系统的主要优点在于被研究的蛋白质的相互作用发生在胞质而不是核中;而且,它更适合研究转录因子以及在胞质中行使生理功能的蛋白质。Sos恢复系统克服了传统的酵母双杂交系统的一些限制,大大拓展了酵母双杂交技术的应用范围。     

酵母双杂交衍生系统

酵母双杂交系统是在酵母体内分析蛋白质蛋白质相互作用的基因系统,由Fields等人于1989年首次建立并得到广泛地应用。十余年来,随着酵母双杂交迅速推广,不断涌现出一些衍生系统,其中包括酵母双杂交的二元诱饵系统,逆向双杂交系统,非转录读出特点的双杂交系统(如Sos蛋白招募系统、PI3K介导的靶蛋白识别系统和断裂泛素为基础的双杂交系统)以及转录激活因子与其相关蛋白之间的相互作用的双杂交系统(如以polⅢ为基础的杂交系统和RTA系统)等。它们的建立在很大程度上克服了传统酵母双杂交系统的局限性,扩大了被研究的蛋白质的范围,提高了系统的灵敏度。     

酵母双杂交系统

酵母双杂交系统是研究细胞内蛋白质之间相互作用的一种分子遗传学技术,用已知的蛋白质作为诱饵来筛选其可以相互作用的伙伴蛋白。本文简要叙述了酵母双杂交系统的原理、基本方法,以及这个技术的发展和应用。     

酵母双杂交系统研究进展

20世纪90年代新兴起的酵母双杂交系统,应用有效的酵母遗传学方法,快速、直接分析已知蛋白之间的相互作用,并能寻找、分离新的与已知蛋白相互作用的配体,发现新基因。在此基础上,相继出现了反向双杂交系统、三杂交系统等多种新技术,为探索蛋白质－蛋白质、蛋白质－核酸作用的奥秘开拓了更为广阔的天地。     

酵母双杂交系统在膜蛋白相互作用研究中的应用

膜相关蛋白约占细胞总蛋白质中的1/3,它们大都参与了细胞的诸多生理、病理过程和药物反应机理。研究膜蛋白的相互作用对于揭示细胞的生命活动规律及寻找药物作用靶标都有重要的意义。由于膜蛋白本身的特性及其难以进入核内等原因,经典的酵母双杂交技术并不适用于检测膜蛋白间的相互作用。针对在活细胞中研究膜蛋白相互作用的需要,近年来国际上先后发展了一系列用于膜蛋白相互作用研究的酵母双杂交新系统,并取得了许多重要发现。     

酵母双杂交及其衍生系统

酵母双杂交系统是一种研究蛋白质相互作用的分子生物学方法,过去20多年里,大量衍生系统的出现使得这套双杂交技术体系更加完善和高效,成为研究蛋白质-配体相互作用的重要技术手段,广泛应用于功能基因组学、蛋白质组学、病理学等研究领域。对酵母双杂交及其衍生系统的基本原理和应用进展进行综述。     

分裂泛素化酵母双杂交系统研究光合膜蛋白相互作用

光合类囊体膜主要由光系统Ⅱ、细胞色素b6f复合物、光系统Ⅰ以及ATP合酶4个超分子复合物组成.利用分裂泛素化酵母双杂交系统研究光合类囊体膜蛋白间的相互作用.将叶绿体psbA基因编码的D1蛋白作为诱饵蛋白,以叶绿体基因psbD编码的D2蛋白、petB编码的Cytb6蛋白作为靶蛋白,分别共转化酵母菌株后进行相互作用分析.实验结果表明,诱饵蛋白D1能与来源于同一复合物光系统Ⅱ的D2蛋白发生相互作用,而与来源于细胞色素b6f复合物的Cytb6蛋白没有互作.这一结果表明,分裂泛素化酵母双杂交系统可以用于检测光合膜蛋白间的相互作用,从而为研究光合膜蛋白生物发生的调控机理提供一个有效的工具.     

逆向酵母双杂交系统的应用

198 9年Ｆｉｅｌｄｓ等提出了酵母双杂交系统来研究真核细胞的蛋白质之间的相互作用。这一崭新手段迅速发展成为一种常规的分子生物学技术 ,并得到了广泛的应用。近来 ,国外学者为拓宽传统的双杂交系统的应用范围 ,在原有的酵母双杂交的基础上发展了大量衍生系统 ,包括用于研究蛋白质与ＤＮＡ之间相互作用的单杂交系统 (ｏｎｅ ｈｙｂｒｉｄｓｙｓ ｔｅｍ) [1] ;研究两个蛋白质与第三个成分间相互作用的三杂交系统 (ｔｈｒｅｅ ｈｙｂｒｉｄｓｙｓｔｅｍ) [2 ] ,第三个成分可以是蛋白质、ＲＮＡ或小分子药物等[3 ] 。另外 ,在通过双杂交体系…     

酵母双杂交系统在病原生物学研究中的应用

酵母双杂交系统作为一种新型的研究蛋白质之间相互作用的方法是功能基因组学和蛋白质组学中一种重要的手段,其在病原生物学的后基因组研究中也日益广泛和深入。本文将从病原体与宿主蛋白之间相互作用、病原体内蛋白之间相互作用以及病原体蛋白自身相互作用等三方面作一综述。     

利用酵母双杂交系统在人脑cDNA文库中筛选与禽流感病毒核蛋白相互作用的蛋白质

禽流感病毒核蛋白 (NP) 在病毒的转录、复制以及决定病毒的宿主特异性方面都具有重要作用。通过酵母双杂交系统筛选与核蛋白相互作用的蛋白,为进一步了解NP蛋白与细胞内蛋白质的相互关系以及流感病毒与宿主的相互关系奠定基础。应用酵母双杂交系统,构建NP诱饵质粒,进而筛选人脑cDNA文库,寻找可能与禽流感病毒NP相互作用的蛋白质。经过酵母双杂交共验证,得到7个与NP相互作用的阳性克隆。该结果为深入了解病毒复制的分子机理及其在蛋白质水平上与宿主蛋白的相互作用关系提供了线索。     

人Calpain1与心脏结构蛋白的相互作用

为探讨人calpain1与心脏结构蛋白之间的相互作用 ,采用酵母双杂交体系筛选与人calpain1大亚基相互作用的蛋白质 ,通过DNA序列测定及BLAST分析同源性 ,获得了阳性克隆 12 (pACT2 12 ) ,16 (pACT2 16 ) ,2 2 (pACT2 2 2 )和 37(pACT2 37)等 .12和 2 2分别与人心脏α肌动蛋白 (humancardiacmusclealpha actin ,ACTC)有 99%和 10 0 %同源性 .16和 37分别与人心脏的肌球蛋白结合蛋白C(humancardiacmyosin bindingproteinC ,MYBPC3)和人α2 辅肌动蛋白 (humancardiacalpha 2actinin ,ACTN2 )有 10 0 %同源性 .这些阳性克隆均属于心脏中心肌细胞的结构蛋白 ,参与心肌细胞的收缩运动 .为鉴定calpain1大亚基的哪些结构域可能参与这些相互作用 ,阳性克隆再分别与含有人calpain1大亚基结构域Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的诱饵质粒共同转化AH10 9进行酵母双杂交 ,发现pACT2 12(ACTC)和pACT2 16 (MYBPC3)均能与全长人calpain1大亚基的结构域Ⅱ和Ⅲ相互作用 ;pACT2 16(MYBPC3)还能与大亚基的结构域Ⅳ作用 ;而pACT2 37(ACTN)虽能与全长人calpain1大亚基作用 ,却不与其单独的结构域Ⅱ、Ⅲ或Ⅳ发生作用 .定量分析阳性克隆与人calpain1大亚基作用的强弱的结果显示 ,pACT2 12、16或 37分别与诱饵质粒pGBKT7 CANP共同转化AH10 9后     

Functional Characterization of Protein Kinase MAC-V with the Use of Two-Hybrid Cloning in Yeast

Identification of interaction partners opens a way to direct functional characterization of proteins. Several cDNAs coding for potential partners of protein kinase MAK-V/Hunk were isolated using two-hybrid cloning in yeast. Based on the partner properties, MAK-V/Hunk was assumed to play a role in tumorigenesis and tumor progression. With the previous results of two-hybrid cloning, MAK-V/Hunk was shown to participate in vesicular transport.     

G-CSF受体胞内区与AK017149的相互作用

为研究G-CSF受体胞内区与AK017149基因之间的相互作用,进而揭示G-CSF受体信号转导通路的可能机制,采用高敏感性的酵母双杂交体系,筛选小鼠胎肝文库,在筛选过程中获得了1个功能未知的基因片段-AK017149,并在酵母和哺乳动物细胞体内验证了该基因片段的表达蛋白与G-CSF受体间的相互作用．实验研究提示,G-CSF受体作为胞内信号转导的起始点,可以与众多蛋白因子相结合,对其中未知蛋白的研究,可以为揭示G-CSF受体信号转导通路起重要的提示作用．     

酵母三杂交系统的应用研究进展

介绍了酵母三杂交系统的原理、应用、前景和存在的不足.在酵母双杂交基础上发展起来的酵母三杂交系统,将应用范围扩大到研究蛋白质-蛋白质、蛋白质-RNA、蛋白质-小分子药物间的相互作用.     

Novel p62dok family members, dok-4 and dok-5, are substrates of the c-Ret receptor tyrosine kinase and mediate neuronal differentiation

Docking proteins are substrates of tyrosine kinases and function in the recruitment and assembly of specific signal transduction molecules. Here we found that p62dok family members act as substrates for the c-Ret receptor tyrosine kinase. In addition to dok-1, dok-2, and dok-3, we identified two new family members, dok-4 and dok-5, that can directly associate with Y1062 of c-Ret. Dok-4 and dok-5 constitute a subgroup of dok family members that is coexpressed with c-Ret in various neuronal tissues. Activated c-Ret promotes neurite outgrowth of PC12 cells; for this activity, Y1062 in c-Ret is essential. c-Ret/dok fusion proteins, in which Y1062 of c-Ret is deleted and replaced by the sequences of dok-4 or dok-5, induce ligand-dependent axonal outgrowth of PC12 cells, whereas a c-Ret fusion containing dok-2 sequences does not elicit this response. Dok-4 and dok-5 do not associate with rasGAP or Nck, in contrast to p62dok and dok-2. Moreover, dok-4 and dok-5 enhance c-Ret-dependent activation of mitogen-activated protein kinase. Thus, we have identified a subclass of p62dok proteins that are putative links with downstream effectors of c-Ret in neuronal differentiation.     

组蛋白酵母双杂交诱饵载体的构建及其自激活作用检测

目的:构建组蛋白 H2A、H2B、H3、H4的酵母双杂交诱饵载体,检测其在酵母细胞中的表达和自激活活性,为应用酵母双杂交系统筛选与组蛋白相互作用的蛋白奠定基础.方法:扩增 H2A、H2B、H3、H4蛋白基编码区 cDNA序列,克隆至酵母表达载体 pGBK-T7中,再将其转化至酵母细胞 AH109中,提取酵母总蛋白,检测各种组蛋白的表达,并检测表达的组蛋白在酵母细胞中对报告基有无自激活作用.结果:将 H2A、H2B、H3、H4基的 cDNA 克隆至酵母表达载体 pGBK-T7中,其中组蛋白 H4得到正确表达,且对报告基 LacZ、HIS3、Ade 无激活作用.结论:可以利用酵母双杂交系统筛选与 H4相互作用的蛋白质.     

发展中的酵母杂交体系

酵母杂交体系包括双杂交、反向双杂交和三杂交等体系。双杂交作为一种新兴的体内研究蛋白质之间相互作用的方法,已经得到了广泛的应用。而反向双杂交和三杂交系统是在双杂交基础上发展起来的两种新技术。反向双杂交除了筛选突变株,以获取蛋白质结合的信息外,还能发现可导致已知蛋白质间特异相互作用发生解离的肽类或其他小分子物质,进一步分析蛋白质间作用位点、调控。三杂交系统则在蛋白质与小分子配基之间以及多种蛋白质之间相     

Pairwise interactions of the six human MCM protein subunits

The eukaryotic minichromosome maintenance (MCM) proteins have six subunits, Mcm2 to 7p. Together they play essential roles in the initiation and elongation of DNA replication, and the human MCM proteins present attractive targets for potential anticancer drugs. The six MCM subunits interact and form a ring-shaped heterohexameric complex containing one of each subunit in a variety of eukaryotes, and subcomplexes have also been observed. However, the architecture of the human MCM heterohexameric complex is still unknown. We systematically studied pairwise interactions of individual human MCM subunits by using the yeast two-hybrid system and in vivo protein-protein crosslinking with a non-cleavable crosslinker in human cells followed by co-immunoprecipitation. In the yeast two-hybrid assays, we revealed multiple binary interactions among the six human MCM proteins, and a subset of these interactions was also detected as direct interactions in human cells. Based on our results, we propose a model for the architecture of the human MCM protein heterohexameric complex. We also propose models for the structures of subcomplexes. Thus, this study may serve as a foundation for understanding the overall architecture and function of eukaryotic MCM protein complexes and as clues for developing anticancer drugs targeted to the human MCM proteins.