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从江浙蝮蛇中分离纯化的碱性磷脂酶A2在pH9.5,0.05mmol/L CHES缓冲液中,用汽相悬滴扩散的方法,获得了适用于高分辨率X射线结构分析的单晶。经X200B面探测器分析,表明该晶体属于正交晶系,P2I2I2I空间群,晶胞参数为a=97.13A,b=103.69A,c=23.27A。并收集了一套衍射数据,独立衍射点数12001个,数据完整度为86.2%,Rmerge为0.0459。最高分辨 相似文献
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江浙蝮蛇毒碱性磷脂酶A2单斜晶体的培养和晶体学研究 总被引:2,自引:0,他引:2
江浙蝮蛇毒碱性磷脂酶A_2单斜晶体的培养和晶体学研究牛秀田,孟五一,桂璐璐,王小强,林政炯(中国科学院生物物理研究所生物大分子国家重点实验室,北京100101)顾培忠,周元聪(中国科学院上海生物化学研究所,200031)关键词江浙蝮蛇毒碱性磷脂酶A_2... 相似文献
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江浙蝮蛇毒碱性磷脂酶A2的溶血位点 总被引:1,自引:0,他引:1
用聚合酶链式反应 (PCR)对江浙蝮蛇毒碱性磷脂酶A2 基因进行点突变 ,使对应 34位氨基酸残基由Arg分别突变为Glu和Gln ,将其基因克隆至温敏表达载体pBLMVL2 ,并在大肠杆菌RR1中成功诱导表达 ,表达产物以包涵体的形式存在。对包涵体进行变复性后 ,用凝胶过滤的方法纯化。对纯化后的产物进行酶活力测定及溶血活性测定。实验结果表明 ,突变后的表达产物维持原有磷脂酶A2 活性 ,且溶血活性显著降低 ,表明磷脂酶A2 的34位碱性氨基酸残基在溶血过程具有重要作用 相似文献
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浙江蝮蛇毒中性磷脂酶A2的晶体学研究 总被引:1,自引:0,他引:1
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钙离子是磷脂酶A2催化必须的辅因子,以蝮蛇毒酸性磷脂酶A2为材料,采用在晶体培养液中加入EDTA或EGTA螯合剂络合法除去PLA2中可能有的Ca2+离子和加入CaCl2以确保PLA2能克分结合上钙离子的方法培养充分结合Ca2+和脱Ca2+的PLA2晶体。加了螯合剂后长出的晶体为长棒状六方柱,加Ca2+离子后长出的晶体则为短粗的六方柱。经X射线鉴定两种晶体为同晶型,空间群为P61,晶胞参数很接近。现已收集到这两种晶体的高分辨率衍射数据。进一步的结构分析和结构比较将有助于详细和清楚地分析Ca2+离子对分子构象的影响。 相似文献
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蝮蛇毒碱性磷脂酶A_2基因的克隆 总被引:2,自引:0,他引:2
从蝮蛇毒腺中抽提总RNA.利用人工合成寡核苷酸引物作逆转录,以cDNA为模板进行体外扩增,获得磷脂酶A2(简称PLA2)基因,克隆至pBS-ks载体中。通过对3个碱性PLA2(简称BPLA2)基因单独克隆分别作DNA全序列分析,推导pro-BPLA2由138个氨基酸残基构成,与已测定的部分氨基酸序列比较,基本相符。该基因成功的克隆,不仅推导出BPLA2的蛋白质全序列,也为进一步开展蛇毒功能肽蛋白质工程的研究工作打下了良好的基础。 相似文献
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江浙蝮蛇毒中性磷脂酶A2晶体的非晶体学对称性研究 总被引:1,自引:0,他引:1
用悬滴气相扩散法获得了突触前神经毒素中性磷脂酶A2的晶体,空间群为P21,并有明显的C2赝对称性.晶胞参数为a=10.836nm,b=8.486nm,c=7.082nm,β=109.87°在Siemens X-200B面探测器上收集了0.26nm分辨率的衍射数据.赝C2对称性揭示存在一个平行于晶体学b轴方向的非晶体学二重对称轴.采用POLARRFN程序进行分子置换法的自身旋转函数计算,在不同积分半径和分辨率范围均得到了稳定且相对突出的4个峰,对应3个一般方向的非晶体学二重对称轴和1个特殊的非晶体学对称关系.从它们之间的相互关系推测晶胞内多个分子的堆积情况:分子可能以二体形式存在,并以“二体的二体”方式排列. 相似文献
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利用荧光光谱学对8PLA_2和Ca ̄(2+)相互作用的研究表明,Ca ̄(2+)在BPLA_2中十分重要。在Ca ̄(2+)存在时,底物与BPLA_2的结合使酶中色氨酸残基周围的环境变得较为疏水,荧光发射谱蓝移达9nm,而无Ca ̄(2+)存在时却无此现象发生;实验证明BPLA_2分子中有一较强的疏水区,Ca(2+)可明显增强这一区域的疏水性;另外,我们还发现Ga ̄(2+)与酶的结合与酶中唯一的His残基有关。 相似文献
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江浙蝮蛇毒L—氨基酸氧化酶的分离纯化及其性质鉴定 总被引:5,自引:0,他引:5
从江浙蝮蛇粗毒中经SephadexG 15 0凝胶过滤、DEAE SepharoseCL 6B以及FPLCSuperose 12分离出一种蛋白质。该蛋白质经SDS PAGE测定在非还原和还原条件下分子量均为 5 7kD左右 ,等电聚焦测得其等电点约为 4.9。生物活性测定表明该蛋白质具有L 氨基酸氧化酶活性 ,能够抑制由ADP和胶原所引起的血小板聚集 ,具有抑制革兰氏阴性菌的作用 ;并且具有细胞毒性 ,能够诱导细胞凋亡 相似文献
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利用荧光光谱学对BPLA2和Ca2+相互作用的研究表明,Ca2+在BPLA2中十分重要.在Ca2+存在时,底物与BPLA2的结合使酶中色氨酸残基周围的环境变得较为疏水,荧光发射谱蓝移达9nm,而无Ca2+存在时却无此现象发生;实验证明BPLA2分子中有一较强的疏水区,Ca2+可明显增强这一区域的疏水性;另外,我们还发现Ca2+与酶的结合与酶中唯一的His残基有关. 相似文献
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江浙蝮蛇(Agkistrodon halys Pallas)蛇毒神经生长因子的分离纯化和特性 总被引:3,自引:0,他引:3
神经生长因子(nerve grow th factor, N G F)是第一个被发现,也是迄今为止研究得最为清楚的一种神经营养因子 利用 P C12 细胞生物活力测定为跟踪检测手段,分别经过 C M Sepharose C L 6 B、 Sephadex G 75 及 F P L C m ono S层析,从30 g 江浙蝮蛇粗毒中分离纯化到200 μg N G F,纯化倍数高达105经 S D S P A G E 测定,该蛋白分子量为 26 k D,由两个亚基通过二硫键交联组成二体形式等电聚焦显示其等电点为67,与氨基酸组成分析结果相吻合 江浙蝮蛇神经生长因子的生物活力水平与小鼠25 S N G F相当,在1~100 μg/ L 的浓度范围内维持 P C12 细胞在无血清条件下的存活 相似文献
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江浙蝮蛇蛇毒中性磷脂酶A2的结构模拟研究 总被引:1,自引:1,他引:0
从我国江浙蝮蛇蛇毒纯化出的中性磷脂酶A2(ATX)不仅具有酶催化活性,还具有突触前神经毒性。用图象模拟和能量极小化及分子动力学方法,根据美国西部菱斑响尾蛇(C.atrox)蛇毒PLA2的晶体结构构建了ATX二体和单体模型,它们的基本折叠与C.atroxPLA2是很相似的。能量计算表明,二体的总势能比单体相应能量的两倍低263.6kcal/mol;ATX二体模型中两亚基间的作用与C.atroxPLA 相似文献
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蝮蛇类凝血酶基因的分析及表达研究 总被引:17,自引:1,他引:17
从蝮蛇(AgkistrodonhalysPalas)毒腺中抽提总RNA,经RTPCR扩增该基因,克隆后经全序列测定,蝮蛇类凝血酶palase的cDNA长708个核苷酸,即编码236个氨基酸;根据同源性,推测该类凝血酶palase的活性中心为His41、Asp86和Ser182;二硫键为Cys7Cys139、Cys26Cys42、Cys74Cys234、Cys118Cys188、Cys150Cys167和Cys178Cys203;该蝮蛇毒类凝血酶cDNA序列及推导的氨基酸序列均为首次报道。构建T7启动子控制下的palase的大肠杆菌表达质粒,IPTG诱导palase获得表达。 相似文献
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蛇毒蛋白C激活物的初步研究 总被引:5,自引:1,他引:5
目的:研究蝮蛇毒蛋白C激活物的分离纯化与理化性质。方法:经DE52-纤维素、CM-Sphadex C-50、G-75柱层析,从安徽芜湖产蝮蛇(Agkistrodon halys)蛇毒中纯化一种均一的蛋白C激活物(PCA)。结果:SDS-PAGE测定分子量约为155000Da,IEF-PAGE测定等电点为4.8。它能使人血浆的KPTT明显延长,显示出强烈的抗凝活性。通过中和试验与显色肽定量实验表明, 相似文献